海藻糖对植酸酶热稳定性的影响研究

　　1.3.1　酶样试剂的准备精确称取1 g植酸酶(精确到0.001 g)、1 g植酸酶＋40 mg海藻糖、1 g植酸酶＋60 mg海藻糖、1 g植酸酶＋80 mg海藻糖，置于100 ml容量瓶中,加入约70 ml pH值为5.5的乙酸缓冲液，在磁力搅拌器上高速搅拌30 min，制成悬浮液。将此悬浮液静置0.5 h，直至上清液完全析出后取上清液待用。每个样品做1个平行样，逐级稀释测定酶活性。

　　1.3.2　酶样试剂的稀释（逐步稀释）酶液用醋酸缓冲液进行适当稀释,控制吸光度 OD值在0.1～0.6,确保试验结果准确度。

　　取上清液1 ml于1号试管中,加入醋酸缓冲液4 ml,摇匀;取1号液1 ml于2号试管中,加入醋酸缓冲液3 ml,摇匀;取2号液1 ml于试管中,加入醋酸缓冲液2 ml,摇匀。(待反应液)具体稀释步骤如下（见表1）。

　　1.3.3　反应步骤每组取4支试管(样品和样品空白各设1个平行,取其平均值)分别加入1.8 ml醋酸缓冲液,再各加0.2 ml待反应液。摇匀，37 ℃预热5 min。样品中加4 ml底物，样品空白中加4 ml终止液，摇匀。37 ℃水浴反应30 min（样品空白可以不反应）后，样品中加4 ml终止液，空白中加4 ml底物，摇匀，静置后在415 nm下测定吸光度OD415。具体反应步骤见表2。

　　1.4酶活力测定

　　1.4.1　测定方法采用绝对法（仲裁法）。

　　1.4.2　酶活力单位定义酶活力单位定义：37 ℃，pH值为5.5条件下，每分钟水解植酸钠溶液释放1 μmol无机磷的酶量为1个酶活单位。活性赿高，单位时间内水解植酸、植酸盐的量就越多。


　　1.4.3　待测酶液的制备精确称取两份1 g的植酸酶(精确到0.001 g)、1 g的植酸酶＋40 mg海藻糖、1 g的植酸酶＋60 mg海藻糖、1 g的植酸酶＋80 mg海藻糖，置于100 ml容量瓶中，加入约70 ml pH值为5.5的乙酸缓冲液，在磁力搅拌器上高速搅拌30 min，制成悬浮液。

　　1.4.4　绘制标准曲线准确称取0.680 4 g在105 ℃烘至恒重的基准物磷酸二氢钾于100 ml容量瓶中,用乙酸缓冲液溶解,并定容至100 ml,浓度为50.0 mmol/l,再按表3中的比例稀释成不同浓度,按表2中的步骤与试样一起反应并测定,以无机磷浓度为横坐标,吸光值为纵坐标,列出直线回归方程(y=ax+b)。标准曲线的数据见表3和图1。