介导锌和铜吸收、利用的载体

007畜牧

　　摘要  
       载体被发现前，人们认为哺乳动物体内的锌和铜是以阴离子复合物的形式协同运输，比如金属离子与一个氨基酸结合形成螯合物或与转铁蛋白等受体结合。1995 年，第一个锌离子载体 (ZnT) 基因 ZnT1 在哺乳动物中被发现。 现在人们认为有两个蛋白家族参与锌的转运。ZnT 蛋白家族促进胞内锌外流或内流入胞内小囊泡，降低胞内锌浓度。 ZnT蛋白逆浓度梯度转运锌的机制尚不明确，然而，只有ZnT1是位于质膜上，它在动物组织中以多种方式参与锌的转运。 我们实验室发现，在药理锌浓度下，ZnT1 与金属硫蛋白的锌转运机制相同。第二个是 Zip 蛋白家族，介导细胞外液或 细胞内小囊泡中的锌转运进入细胞质中，但这种蛋白却没有在家畜中发现。目前，尚未找到合适的指标来评价体内 铜的状态。然而，随着近年来铜载体和伴侣蛋白的发现，研究人员认为，铜运输的调节依赖于后翻译机制介导的调 节位点蛋白结构的改变。铜载体 Ctr1 和 Ctr3，调控铜吸收的高亲和力位点。在人类的肝脏中发现一种小分子胞质蛋 白 MURR1，但其在铜代谢中的作用机理尚不清楚。铜伴侣蛋白可促进蛋白对铜的吸收，这可能成为衡量铜状态的一 个合适的指标。研究证实，适量的高锌日粮诱导缺铜大鼠，这些大鼠组织内的 Cu/Zn 超氧化物歧化酶铜伴侣蛋白 (CCS) 含量增加，我们最近在仔猪体内也发现 CCS。其他已证明的铜伴侣蛋白包括 COX17 和 Atox1，与 CCS 相同，他们与细 胞内的 apo- 酶对铜的利用有关。这些分子领域的新发现，对于评估家畜铜、锌的生物利用率和营养需要非常必要。
　　中图分类号 ：S816.72文献标识码 ：A文章编号 ：1006-6314(2013)08-0050-04
　　

      1 引言
　　一百多年前，人们就认识到微量元素对家畜生产的重要性，根据微量元素需要量的评估结果，设计日粮配方，最大限度发挥畜禽的生产性能。近年来，随着有机矿物的出现，人们越来越关注环境污染以及饲料成本的增加，微量元素吸收和利用的相关问题也日益显现。微量元素的来源与质量，对于动物能否有效利用和是否产生外源污染非常重要。我们更多关注的是无机微量元素引起的环境污染，而不仅仅是按标准添加。
　　

      2 改变的原因
　　矿物质在动物肝脏或骨骼的储量并不代表动物的代谢需要量，Bobilya 等 1994 年的研究结果很好地证明了这个观点。他们通过骨活组织检查发现，缺锌导致仔猪生长受阻，但其骨锌含量却高达 27mg/kg。这个经典的试验告诉我们，动物组织中被吸收的微量元素，并不能完全被利用。虽然组织矿物浓度测定在 1960年和 1970 年取得了一定的进展，但酶活性依旧是评估矿物代谢率和状况的有效指标。Dell(1997) 将生物利用 率定为 ：用生理生化功能的矿物元 素占动物总吸收量的比例。因此，20世纪末对无机微量元素生物利用率的 定义是基于酶活性、生长性能、营养 平衡和肝储。Hollis 等 (2005) 利用生 长性能评估锌生物利用率的研究就是 一个很好的例子，他们通过研究药理 浓度锌对生长的影响，来比较不同形 式锌的生物利用率。Rincker等(2005)发现，乳猪饲喂 2,000mg/kg 的氧 化锌或蛋氨酸锌，排泄物中锌含量不 同，其中蛋氨酸锌组尿中锌含量更高， 这表明蛋氨酸锌组的锌吸收率更高， 而在肝中锌含量却没有差异。更重要 的是，这个研究还清晰地表明，乳猪 必须在饲喂试验日粮 10 ～ 14d 后， 粪中的锌含量才会增加。因此，在试 验期的不同时间段测定的肝脏锌浓度 差异很大。Hambridge(2003) 重复了 上述试验，他发现除硒以外，血浆或 血清中许多微量元素的浓度并不能作 为一个合适的生物标记，反映机体微 量元素的状况。由于许多微量元素在 动物血浆、血清和肝脏中的浓度会在 急性反应期内升高或降低，因此经常 会干扰血浆或血浆中的矿物含量的正 常测定，得到错误的结果。
　　自从 Hill 和 Spears(2000) 关于 猪的微量和超微量元素的报道发表以 来，又出现了许多关于微量元素在体 内应用的分子水平上的研究成果。真 核细胞，转基因小鼠 ( 如敲除小鼠 )和先天性代谢异常的人等都给了科学家应用分子生物学研究的素材。研 究人员认为，蛋白的调节存在多级水 平，他们假设金属应答转录因子存在(Rutherford and Bird,2004)。尽管在啮齿目哺乳动物上已经进行了许多类似的研究，但在非啮齿目动物如家畜上的研究还比较少。
　　
     3 锌载体
　　Cousins 等 (2006) 在短篇综述中提到，3% ～ 10% 的人类蛋白基因组含有锌结合区。因此，为了健康和长寿，必须保持锌的内稳态。在组织器官水平，这种稳态依赖于肠道对锌吸收的调节以及胰腺和肠道分泌物中锌的转运。而在细胞水平，锌浓度的调节方面则依赖于吸收、分泌和重分配，甚至是螯合。因此，锌的转运对于生命至关重要。
　　

      4 ZnT
　　1995 年，Palmiter 和 Findley 发现第一个锌转运蛋白 ZnT1。在这之前，人们认为锌在体内是通过阴离子、氨基酸复合物或螯合物、转铁蛋白受体来转运。ZnT1 蛋白家族被认为是溶质联合载体家族 (SLC30) 的一个分支。ZnT1 通过介导胞内锌流出细胞外或流入胞内小囊泡来降低胞内锌浓度。尽管载体转运机制尚不明确，但Chimienti 等 (2004) 发现，人类 ZnT1蛋白存在很大的同源性。在人类细胞、酵母菌、蛙卵母细胞中已发现 10 个这样的蛋白家族。这些蛋白家族的蛋白序列各不相同，但除 ZnT5 含有 12个跨膜区以外，其余家族都含有 6 个跨膜区，而其中 4 个区域都有一个锌移位的通道。另外，序列同源性表明，细胞膜内侧的氮端和碳端以及由几个组氨酸残基组成的胞内环，是细胞内锌转移的主要调节因子。
　　虽然大多数的 ZnT 蛋白存在于胞内细胞器中，如高尔基体或内质网，但 Cousins 等 (2006) 报道，ZnT1 定位于质膜，ZnT2 定位于胰腺腺泡细胞中，ZnT5 存在于胰腺 β-细胞的分泌小囊泡中和肠细胞顶膜上，在有丝分裂细胞的胞核内发现了ZnT9 蛋白。采用免疫组织化学分析法，Yu 等 (2007) 在小鼠中的研究发现，ZnT1 基因在胃肠道部分 ( 如食道、十二指肠，盲肠等 ) 上皮细胞表达，而 ZnT4 主要是在大肠中表达，ZnT6 蛋白在胃、空肠、盲肠、结肠和直肠中都有发现，ZnT7 蛋白在胃肠道的各部分都有表达，在小肠中最多。机体一定浓度的锌对胚胎和胎儿的生长非常重要，那么在胎盘发现ZnT 就不奇怪了。Helston 等 (2007)报道，小鼠胎盘 ZnT 的表达对日粮锌含量非常敏感，当日粮锌含量低于或 3 倍高于需要量时，金属硫蛋白(Mt)，ZnT1 和 ZnT4 的转录蛋白浓度降低。在人类绒毛合体滋养层细胞中，也发现 ZnT1 和 ZnT5。
　　

      5 Zip
　　Zip 是哺乳动物 SLC39 家族成员，主要与锌的转运活性有关，包括 Zip1 到 Zip8 和 Zip14。它们在锌吸收中的主要作用是推动锌顺浓度梯度的运输，不需要 ATP 参与。尽管Zip 蛋白对锌的转运具有特异性，但他们也会被其他一些阳离子抑制。大多数 Zip 蛋白都有 8 个跨膜区域，他们的氮端和碳端在细胞外侧，胞内含有一个很长的由组氨酸残基组成的内环。而不同的是，Zip14 的组氨酸环在胞外侧 (Cousins 等 ,2006)。
　　大多数 Zip 蛋白定位于质膜，但Zip7 却在高尔基体上。Zip 能够根据锌的有效含量和生理状况发生改变，以发挥功能。当锌利用受限，肠上皮细胞质膜上的转运蛋白 Zip4 增加，而当锌恢复，基底层 Zip4 蛋白的表达减少 (Cousins 等 ,2006)。Zip1 蛋白增加急性反应期肝细胞对锌的吸收，因此，Zip 基因的表达受日粮锌含量的调控，Zip 蛋白的出现，可能对家畜锌利用的调控非常关键，但目前关于 Zip 家族在畜禽中研究的报道较少。
　　

      6 载体调节和 Mt
　　当日粮含锌量不同时，ZnT1 在不同组织中的调控是不同的，主要表现在金属敏感转录因子 1 和 mRNA的丰度。我们实验室 (Martinez,2004)发现，无论在仔猪日粮中是否添加植酸酶，1,000mg/kg 锌日粮组肝脏中ZnT1 蛋白的表达都大于 2,000mg/kg 组。而有趣的是，Mt 蛋白在试验 猪肠黏膜中的表达却没有发现这种 现象，2,000mg/kg 锌( 以 ZnO 中Zn 计 )+ 植酸酶组肠黏膜 Mt 含量 极显着高于2,000mg/kg锌-植酸酶 组，而且，2,000mg/kg 锌 - 植酸酶组Mt含量极显着高于 1,000mg/kg锌 + 植酸酶组。这提示我们，当给 保育猪饲喂药理浓度的锌，ZnT1 和 Mt 都参与了体内锌平衡的调节。在 另一个研究中，给保育猪分别饲喂100、1,000 和 4,000mg/kg 的锌，1,000 和 4,000mg/kg 组十二指肠 黏膜细胞中 Mt 蛋白含量极显着高于100mg/kg 组，而1,000mg/kg 和 4,000mg/kg 组没有差异 ；然而，在空肠段，两个高锌组总锌吸收量增加但单位肠表面积的锌含量却下降，4,000mg/kg 锌组 Mt 蛋白含量极显着高于 1,000mg/kg 或 100mg/kg锌组 (Martinez et al.,2005)。假设 十二指肠内的 Mt 蛋白通过从空肠细胞中脱落，降低了空肠吸收的锌的可利用率，从而导致空肠锌含量的差异。在空肠中，随着结合 Mt 中锌的量的减少，大量的锌与肝脏中的Mt 结合，导致激发 ZnT1 生成的可用锌含量降低。
　　

    7转铜载体
　　细胞生物， 人类代谢性疾病和分子生物学技术研究人员阐明 了动物体内铜代谢的规律。如肝豆核变性病人体内铜的蓄积异常，而门克斯病患者则是伴 X 染色体铜 代 谢紊乱， 由于铜转运蛋白缺乏，导致铜在不同器官内缺乏或蓄积 (Hill 等,1987;Cater 和Mercer,2005;Vonk 等 ,2008)。门 克斯病患者表现为头发和皮肤的功缺失，生长发育迟缓，神经机障碍，结缔组织异常 (Cater 和Mercer,2005)。肝豆核变性患者表现 为肝功异常，神经机能障碍，或两者 皆而有之，可能会死于红细胞不完 整 (Hill 等 ,1987)。伯灵顿更病也是 一种铜代谢紊乱的遗传疾病。作为一 种营养需要，铜在体内存在是有矛盾 的，因为它是以二价氧化还原态形式 存在，可以通过接受或供给电子改变 价态。因此，像铁一样，为了防止芬 顿反应产生自由基，铜必须与蛋白结 合。最重要的是，铜在体内的含量以 及在细胞中的传递必须被精密调控和 管理。铜的吸收主要是在十二指肠段， 从刷状缘转移到肠上皮细胞 (Cater和 Mercer,2005)。然而，肠黏膜上的 这些特殊细胞端吸收铜的机制尚不明 确。两个相关蛋白分别是 ：①高亲和 力的铜转运蛋白 (Ctr1)，一种普遍表 达的跨膜蛋白。②刷状缘上的二价金 属转运蛋白 (DMT1)，也叫 nramp。
　　

      8DMT1
　　已知 DMT1 与 细 胞 Cu2+、Fe2+、Zn2+、Mn2+ 的吸收有关。然而，当铜不足或其他微量元素缺乏时，DMT1 不参与铜吸收的调节 (Cater和 Mercer,2005)。
　　
      9 Ctr1
　　Ctr1 蛋白使铜转运入细胞成为可能 (Zhou 和 Gitschier,1997)。Ctr1含有富含组氨酸和蛋氨酸残基的三 个铜结合跨膜区，有证据表明，Ctr1蛋白还构成一个铜离子通道。因此， 当铜超量时，Ctr1 通过介导质膜内 陷或降解内涵体调节体内铜含量。经 检测，Ctr1 基因在所有组织中都存 在，其中以肝脏中含量最丰富 (Cater和 Mercer,2005)。这与肝细胞需铜理论相符，因为肝脏具有很强的代 谢作用。Ctr1 以 Cu2+ 形式将铜传递给细胞，又以一种未知的机制将铜 以Cu1+ 形式转移给伴侣蛋白。正如Field 等 (2002) 描述，为了将铜合成金属酶，生物体演化出一组胞内铜结 合蛋白家族，形成一个用于合成金属 酶的可用铜储备库，直接将铜离子转 运到适当的靶器官。
　　

     10 COX17
　　据统计，已确定有 3 个伴侣蛋白， 机体可能通过将铜转运入这些小分子 蛋白，调节铜在各组织结构中的数量 和位点，发挥功能。细胞色素c氧化 酶铜伴侣蛋白 (COX17) 将铜运输进入线粒体，在线粒体膜间隙中再将铜传递给细胞色素c氧化酶 (Maxfield等 ,2004)。 然而，Bertinato 和Abbe(2004) 却认为，COX17 只是将铜转运给线粒体，由SCO1和SCO2蛋白负责将铜结合到细胞色素c氧化 酶分子上。细胞色素c氧化酶中的铜 对于能量的有效利用的作用不可低 估，它在细胞中产生ATP的效率最高。
　　

     11 CCS
　　超氧化物歧化酶 (SOD) 是细胞质中一种主要的酶，需要铜和锌才能发挥正常功能，其中铜的转运依赖于铜转运蛋白 (CCS)。SOD 是胞质中一种必需的抗氧化物酶，对于降解超氧化物自由基非常重要，但在真核生物线粒体的膜间隙也发现大约1% ～ 2% 的 SOD(Field 等 ,2002)。CCS 蛋白将 apo-SOD 前体转换为活性 holo-SOD，并对铜浓度变化敏感。 我们最近发现猪 CCS 中的铜是一种 有机形式的铜，Bertinato 等 (2003)建议 70-kDA 的蛋白可以用作评估 铜含量的生物标记，因为他们发现， 在缺铜大鼠肝脏和红细胞中 CCS 的表达呈现出一种剂量依赖性的增量调节作用。这与肝脏、红细胞和大脑中 的 SOD 活性不同，虽然标准日粮、 适当缺乏或缺铜日粮会引起机体铜含 量变化，但各组 SOD 活性却并没有 差异。而 Bertinato 和 Abbé(2003)报道，铜通过降解 26S 蛋白亚基调节 培养细胞 CCS 的表达。这可能是当 机体铜缺乏时，哺乳动物保护重要细 胞的一种方式，比如心细胞。
　　我们已经认识到高锌或药理浓度锌日粮会对动物体铜含量造成一定的 影响。1983 年，我们就报道了给妊 娠和泌乳母猪饲喂含锌量 5,000mg/ kg(ZnO) 的日粮，引起新生仔猪铜缺 乏 (Hill 等 ,1983)。在肝豆核变性病 患者中，我们也发现这种影响胃肠道 铜吸收的代谢交互效应。饲喂药理 浓度的锌引起肠道内 Mt 含量增加，Mt 与肠道内的含铜黏膜细胞结合，导致其脱落，加剧了铜的缺乏 (Hill和 Spears,2000)。如果在动物活体组 织中没有一个适当的反映铜状态的生物标记，研究人员将很难评估机体铜含量的变化，然而，CCS 似乎解决了这个问题。Iskandar 等 (2005) 报道，CCS 在红细胞中的表达对轻微的铜缺乏也表现敏感，而血浆铜蓝蛋白和血浆铜浓度却没有表现出这种效应。在这个研究中，他们发现日粮锌含量240mg/kg 组大鼠十二指肠中 Mt1、ZnT1、ZnT2 和 ZnT4 浓度显着高于30、60、或 120mg/kg 锌组。正如预期，30mg/kg 和 60mg/kg 锌组十二指肠Zip4 含量高于 120mg/kg 和 240mg/ kg 组。因此，这些锌铜载体对我们 研究药理浓度的锌、铜或两者联合使 用的生物学机制是非常有用的。
　　

      12Atox1
　　另一个铜伴侣蛋白Atox1通过与ATP7A(转铜ATPase1)和ATP7B( 转铜 ATPase2) 的直接交互 作用，将铜转移给他们。这两个蛋白 与 P 型 ATPase 密切相关，他们通 常在转运高尔基体网将铜转移给赖氨 酸氧化酶、血浆铜蓝蛋白等含铜酶(Cater 和 Mercer,2005)。如果细胞内铜浓度增加，ATP7A 将多余铜释放 到质膜内侧，而ATP7B 将其储存在 质膜囊泡内。因此，除了将铜转移合成必需的含铜酶以外，这些 ATPase还作为一种解毒途径，帮助细胞清除 或存储多余的铜。肝脏是调节铜平衡 的主要器官，它是体内铜的储存库，它以血浆铜蓝蛋白形式将铜分泌入血浆或以一种不能重吸收的形式分泌入胆汁，来调节机体的铜含量。肝豆核 变性患者铜代谢紊乱，主要是由于体内ATP7B 蛋白生成障碍，不能将适量的铜分泌入胆汁所致。门克斯病 患者由于 ATP7A 基因的缺陷，铜的吸收和分配发生障碍，由于没有足够的 ATP7A 来进行铜跨血脑屏障的转运，导致大脑缺铜。因此，Atox1是铜从 Ctr1 运输到 ATPase(ATP7A和 ATP7B) 的 第 1 个 连 接， 通 过ATPase 最后将铜转移给许多含铜酶类 (Cater 和 Mercer,2005)。
　　

    13 其他铜锌蛋白
　　其他蛋白也会影响动物对铜的需要或者防范单体或离子铜的风险。伯灵顿更患者含有一种常染色体隐性 遗传基因 (MURR1 或 COMMD1)，已证实这种基因与 ATP7B 存在交互 作用 (Bertinato 和 L'Abbé,2004)。在哺乳动物中，ATP7B 蛋白具有多 种功能，但它在铜代谢中的作用尚不 明确，它影响伯灵顿更患者肝脏中铜 的蓄积，作用方式与肝豆核变性病 相似。尽管 Mt 在种属和进化时期上 存在广泛的同源性，但是这种高硫 含量的低分子蛋白的主要功能至今 尚不明确。可以肯定的是，它的功 能之一就是沉积过量的铜、锌等阳 离子，最终作为一种降低这些阳离 子毒性的生物学手段。而 Mt 的功能 可能不仅仅是防止过量的铜、锌吸 收，而且还与这些元素的正确价态 或靶向吸收有关。
　　

14 结论
　　随着饲料成本的增加，人们越 来越关注产品质量以及如何减少动物 排泄物中矿物对环境的污染。如何根 据家畜种属、遗传基础、生理阶段以 及环境四个方面，确定家畜日粮铜、锌和其他微量元素的适宜添加水平，已成为我们的挑战。而分子生物学技术的应用，是我们现在以及将来获得 这些信息的有效工具。（参考文献略。文章来源：吉隆达集团技术中心　作者：杨 帆 罗仕伟 文 然）


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