对溶菌酶的工艺开发角度的综述

叶赫娜兰.孤城

王兄：

　　你好！

　　来信收到，你的报告很直接，也很简洁，相信是企业所乐于接受的。你说的可行性报告，我稍后会一一做来，或者，王兄你做，是不是更直接，不管怎样，我先把溶菌酶及其他结构活性物质（主要是蛋白）在畜牧行业的应用，简单介绍下。

兽用结构蛋白，在分子时代以前，主要是以下几个方面：

1、蛋白提取溶菌酶，主要用于很特殊的方面，如，极端抗药性的感染情况下，奶牛子宫消炎等，原因是价格，换算成纯蛋白，成本在2000-3000元/KG，用这种工艺得到的溶菌酶是不具备大量应用的可能的（大量应用的价格应在1000以内）。

2、蛋黄抗体，当恶性兽类流行病横行时，会先让鸡轻微感染此病，然后在蛋黄内提取抗体，缺点还是成本，奇高。

3、免疫激活剂，主要是微生物细胞壁上附着的糖蛋白，是细胞壁的粗制品，低端产品，效果不稳定，不明确。

4、伪干扰素类产品，由免疫激活剂加载植物提取物，抗病毒合成药物而成，低端产品，有效果，但事实是草药和抗病毒药物的效果，这类产品，简直是他妈儿戏。

5、干扰素，理论上讲，可以从血液得到动物干扰素，但干扰素有种的差异性，所以，从成本上考虑，不可能把动物源干扰素用于同种动物。所以，实际上，这种产品，是没有的。

叶赫娜兰.孤城

　　在分子时代前，得到蛋白药物也是不难的，如溶菌酶，抗体，干扰素，但成本是不能接受的，只有进入分子时代后，用分子技术生产蛋白，才具有真正意义上的商业价值。

　　发酵行业进入分子时代后，畜牧业也正好面临一个大的变动，就是欧盟的全面禁抗（抗生素），大陆的畜牧业，不具备依靠国内市场存活的能力，而大陆的养殖环境，又决定了养殖动物始终是在亚健康状态生长，这就进入了一个悖论：谁用抗生素，谁的产肉率高，而谁的产品就没法卖；谁不用抗生素，谁的产肉率就低，谁就赔钱卖！分子时代的溶菌酶，就是在这种环境下，被提上了议事日程。

　　为什么首先是溶菌酶，而不是其他产品，如干扰素，如抗体，被关注呢？不同于溶菌酶，做抗体，做干扰素，一方面，听起来技术含量就高（注意，是听起来，听起来而已），而且，在人药方面，抗体和干扰素积累了大量的技术经验，比如说，高等动物基因在微生物细胞环境内表达，比如说，糖基化（没有糖基化的蛋白会被蛋白酶水解，而来不及表达活性）及高等动物糖基化的种的差异性，这些经验完全可以在开发鸡，牛，猪，马，鸵鸟，骆驼，老虎，等等而应用。

叶赫娜兰.孤城

　　其实，这牵扯到畜牧业的行业特点，骆驼，老虎不是不能养，是量太少，而鸡，牛，猪，我们关心的是在群体水平下，在可接受的经济投入上，动物产品的最大化，虽然，个体死亡是构成群体死亡的元素，是行业不愿看到的，但，事实上，个体死亡是不被严肃对待的，更绝对不会真正注意个体水平的健康问题。换句话说，畜牧业关心的是，以经济投入为x轴，以动物蛋白产量为y轴，得到函数的微分函数的最大值。

　　所以，只有具有以下特点的产品才有可能在这个行业里，（这种游戏规则下）被重视（或说，也会很快实现产品附加值）：

1、价格低，（当然，附加值更低）用量大，可以被大量应用，最好是防病或用于亚健康，如果治疗，应用面就窄了（这个行业的市场容量之大，始终会超出人的想象，在行业待了4年，听了不少传闻，看了不少传奇，当听到哪个产品卖了多少，有时我还会吃惊，更不是业外人士可以想见）。
   
2、可以适用于应付群体生长问题，令用户在此水平核算成本与收益，而不是面对动物个体的问题。

3、开发商，如有远见，把产品开发，定位时，充分考虑和接受以上两点，而生产的产品。

叶赫娜兰.孤城

那么，我们看一下，就会发现溶菌酶可以在现在的历史条件下（欧盟的全面禁抗，及相应的国内国际背景），经过努力，是可以符合以上1，2，3，点了。因此，首先被关注的，是它（而抗体和干扰素，只能作为第二代产品应用----除非突然出现某种对症的恶性流行病，才能打破这个次序）。

现在的历史时期，是其他科研单位，包括我们实验室，经典做抗体和干扰素，面对开发，首先想到人用药模式（生产规模，利润率，利润、成本构成，利润模式，市场模式），用它来衡量兽用溶菌酶开发，如果看不到市场真正的大小，即便不考虑转让费，就算只是“为做好一件事，而去做这件事”也是很容易打退堂鼓的，因为在人用药的思路下（50升微型罐，精提取，精包装，代金销售，高回扣），兽用药给出的价格，是不可想象的。

所以，目前暂没有国内权威研究机构做这一块工作，不过，既然已经进入了分子时代，而且，分子改造生产的确成本大大低于蛋清提取，行业内还是有做的。下面对此进行介绍。

叶赫娜兰.孤城

澳洲易太公司，是名义上的海外公司，经济内幕不详。人员构成，以畜牧业海归为主。口号类似湖南卫视，说：“我们一直被模仿，但从未被超越。”这样类似的话。据说是国内最大的兽用溶菌酶生产厂家，应用技术不详。但从成本考虑，肯定不是蛋清提取。怀疑是酵母菌表达。

杭州康德权公司，申请有一个专利，但似乎始终没有产品问世，专利显示，是用酵母菌表达（我甚至怀疑他们并没有工业水平的技术，而摇瓶又太没意义）。

其余有几个生产成品而非原料的厂家，技术内幕不详。如果做，应该也是酵母菌表达。

一般的，用酵母表达，成本应在600元/KG纯蛋白以上，而目前的单位售价，大概在1000元/KG纯蛋白以上（原料）。如果用大肠杆菌表达，300-400元/KG纯蛋白或以下是可以做到的。但市场上应该没有大肠杆菌表达的产品。

为什么怀疑（或推断）大部分厂家是用酵母而不是大肠呢？我们实验室做酵母和大肠都很普遍了，我来猜一下，可能基于以下三个原因：

叶赫娜兰.孤城

1，最早做人用蛋白时，首选是酵母，是由于早期提取工艺下回避毒性问题。后来虽然技术攻克了，但成本集中在后面资金运作，所以也就不改了。如果（其实是只能）沿用人药技术，而不做新的开发，沿用以往技术，是想当然的选择。

2，二硫键，用大肠做的优势在于高表达量，形成包涵体，二硫键的存在，对蛋白复性影响巨大，往往因为它的存在而无法复性。现在用的溶菌酶有两个二硫键，折叠正确有一定困难。如果加信号肽，在酵母中表达并引出细胞，形成可溶性蛋白，则提取简单----过一遍柱子就行，无需复性。

3，工艺问题，摇瓶做包涵体可以达到总蛋白的20%以上，但到罐上就不长了。关键是配方和工艺没走通。做好这一步，国内的SCI文章发了很多，但经验，（相对于我们以往做抗生素的水平）是一点也没有。

而我们实验室可以会避开以上问题。

作为微生物技术国家重点实验室和国家糖工程中心，做蛋白的折叠（包涵体复性）和糖基化，并非我们实验室的高端，但在国内，在这方面，我们是理所当然的权威。至于发酵罐工艺表达，先不必说你，我两个老发酵的水平----这与我无关的----手上正好有与国外（原导师实验室）合作开发的一个工艺，适合大肠的外源蛋白表达。缘由是这样的：

叶赫娜兰.孤城

最早，为了培养硕士生，也与其他院校交流（其实是做点东西和国内院校换DNA，当然互相担保不用于商业目的），开发过一个做感受态细胞的蛋清溶菌酶，摇瓶水平，闲着也是闲着，把复性也做了。后来知道与兽用溶菌酶是一个。如果扩大，就套用做抗体的工艺就是了。所以，应该没有问题。这是一个成熟的工业水平工艺。

不仅如此，如果专利有任何东西可能撞车，（虽然我知道在工业水平是不可能的）我们都有技术力量合理规避开（仅仅出于实验室考虑，我们也会这么做）。

另外，在工艺方面，我们可以做交钥匙工程，也可以和对方的技术人员协商解决，也可以先做可行性报告，不过，建议还是王兄做，一方面，你经验多，我把情况介绍清楚，你还需要什么我再给，另一方面，如果我做，会套用原来的模板，那时的平均工资水平，定在6000元/年，相应的动力费用，也太低，还得从头算，太烦。呵呵，不过王兄非让我做，我就上。

叶赫娜兰.孤城

至于琥珀酸等有机酸发酵，小分子药物，PHA,PHB,聚乳酸，是实验室赖以发家和申请课题经费的核心，也是我们的技术专长，如果转让，可能价值不菲----虽然实际上，钱我们早已经在国家那里拿到了，但此事关系到实验室和整个生科院的声誉。操作肯定要小心些。贤兄既然关心，我下次给你介绍清楚（很快，一两天）。

贤兄身处此位，手头企业资源比较丰富，看能让我俩有何作为。在畜牧业，由于各国自然环境不同，人文环境不同，更有经济环境及结构不同，国外产品其实不足训！如果真让此等产品推广了，也许，畜牧行业就开始走出了仿造国外产品的时代。这样，于国于民，于人于己，都不算坏事。作为上世纪九十年代的重点高校毕业生，你我也可了慰此心吧。

国外产品不足训！----愿以此言，为一个好的开始。


                                                   弟，斌，即日

叶赫娜兰.孤城

以上是和四川抗生素研究所的往来信件，谈到溶菌酶，拿来放在这儿了。

1，不用WORD格式，省的弟兄们下载来下载去，烦。

2，不修改，虽然唐突，但是真实。

3，我的一家之言，错误和片面处肯定不少，欢迎批评，指正。真的，渴望交流。

        坐在实验室，透过窗户看出去，穿越层楼，是远处群山的山顶，风云变时，姿态万千。随手抽屉内，有绿茶花茶乌龙茶，欢迎各位到山大，同品茗观雨，孤城当侧立执壶以奉。

叶赫娜兰-孤城 于 2009-4-9 17:13 补充以下内容

弱弱的问一句，没人留言吗？批评也是好的啊。

叶赫娜兰.孤城

分子生物学，并不是分子水平的生物，或生化，或生理学。其实，它是指分子水平的DNA学，除了DNA外, 对其他有机物也是围绕与DNA的关系展开的。考虑到在我们发酵生理学的视点下，DNA的价值，是蛋白的信息载体，而一切生理变化，都是蛋白活性的宏观表达。那么，目前的生物技术，可以认为只有两个大的方面（或技巧）：1，通过分子水平DNA技术，抑制细胞内源蛋白活性。2，表达细胞外源蛋白及其活性。

表现在宏观上，就可以实现代谢流调控，蛋白产品的获得，用外源酶合成或催化反应等。比如像代谢流调控，我们找到编码琥珀酸脱氢酶的基因，并敲除之，使这个蛋白不能表达，则从琥珀酸到延胡索酸的反应不能进行，来积累琥珀酸，属于第一种情况。我们敲除PTSG这个基因，使细胞对各种不同的糖没有选择性，也属于第一种情况，而引入另一个基因，使糖代谢加强，就是第二种情况了。在合成PHA时，外源基因指导合成三个外源酶，并在细胞内表达活性，就属于第二种情况。当然，表达外源蛋白最典型的，还是直接以被表达蛋白为产品，不过当蛋白需要被修饰时（如糖基化），就又需要这两种技巧的配合或反复使用了。

这样得到的菌株，生产产物的代谢十分直接，往往转化率在90%或以上。但是，细胞本身的活力比较弱，也会有大量的宏观上类似回复突变的生理问题。这就是为什么我说：“现代发酵，分子调控，菌种和工艺是分不开的，有时，工艺唯一的目的，就是保证菌种处于某种特定状态而已。”----因为，许多本来由我们过程工程师在生理水平控制的代谢，分子技术已经帮我们在种子阶段解决了，而同时，又丢给我们一些不大不小的新问题。

以往，类似味精发酵，获得初级代谢产品，并减少中间代谢产物和副产物，需要工艺近似苛刻的控制，而现在，就不必了。