请高手分析饲用植酸酶活性的检测结果总是很低的原因。

fangke3546

刚开展饲用植酸酶活性的测定这个项目，检测结果总是很低，相差很大，不知道是什么原因，方法如下：

饲用植酸酶活性的测定

一、适用范围
  

本标准规定了以分光光度法测定饲用植酸酶活性的方法。适用于作饲料添加剂用的植酸酶产品，也适用于添加有植酸酶的配合饲料、浓缩饲料和添加剂预混合饲料。样品最低检出量为90U／kg。
二、方法原理
  

植酸酶在一定温度和pH条件下，水解低物植酸钠，生成正磷酸和肌醇衍生物，在酸性溶液中，用钒钼酸铵处理会生成黄色的[(NH4)3PO4NH4VO3·16MoO3]复合物，在波长415nm下进行比色测定。
三、试剂和溶液

3.1
乙酸缓冲液(I)，c(CH3COONa·3H2O)为0.25mol／L：称取34.02g三水乙酸钠于1000 mL烧杯中，加入1000mL蒸馏水溶解，用冰乙酸调节pH至5.50±0.01。室温下存放2个月有效。
3.2
乙酸缓冲液(Ⅱ)，c(CH3COONa·3H2O)为0．25mol／L：称取34.02g三水乙酸钠，0.5 g TritonX-100, 0.5g牛血清白蛋白于1000mL烧杯中，加入1000mL蒸馏水溶解，用冰乙酸调pH至5.50±0.01，室温下存放2个月有效。
3.3
植酸钠溶液，c(C6H6O24P6Na12)为7.5mmol／L：称取0.6929g肌醇六磷酸钠(C6H6O24P6Na12)于100mL容量瓶中，用乙酸缓冲液(3.1)溶解并定容至刻度，现用现配(实际反应液中的最终浓度为5.0 mmol／L)。
3.4
硝酸溶液：1+2水溶液。
3.5
100g／L钼酸铵溶液：称取10g钼酸铵[(NH4)6Mo7O24·4H2O]于100mL。容量瓶中，加入1．0mL氨水(25％)用水溶解定容至刻度。
3.6
2.35 g／L钒酸铵溶液：称取0.235 g钒酸铵(NH4VO3)于100mL棕色容量瓶中，加入2 mL硝酸溶液(3.4)，用水溶解定容至刻度。避光条件下保存一周有效。
3.7
颜色终止液：移取2份硝酸溶液(3.4)，1份钼酸铵溶液(3.5)，1份钒酸铵溶液(3.6)混合后使用，现用现配。
3.8 磷酸二氢钾(KH2PO4)：基准物。
3.9
清洗试验用容器不要用含磷清洗剂。
四、仪器和设备
4.1
实验室常用仪器设备.
4.2
恒温水浴：(37±0.1)℃。
4.3
分光光度计：有10mm比色皿，可在415nm下测定吸光度。
4.4
磁力搅拌器。
4.5
涡流式混合器。
4.6
酸度计：精确至小数点后2位。
4.7
离心机：转速为4000r／min以上。
4.8
秒表
五、试样制备
   
取有代表性样品，用四分法将试样缩分至200g，植酸酶产品不需粉碎，配合饲料和添加剂预混合饲料需粉碎通过0.45mm标准筛，装入密封容器，防止试样成分变化。
六、测定步骤
6.1 标准曲线
   
准确称取0．6804g在105℃烘至恒重的基准磷酸二氢钾(5．9)于100mL容量瓶中，用乙酸缓冲液(3．1)溶解，并定容至100mL浓度为50.0mmol／L。准确移取磷标准溶液（50mmol/L）0，1.0，2.0，3.0，4.0， 5.0ml于50ml容量瓶中，与试样一起反应测定，以无机磷浓度为横坐标，吸光值为纵坐标，列出直线回归方程(y＝ax+b)。
6.2 试样溶液的制备
   
称取0.5g—0.7g两个试样(表示酶活为6000U)精确至0.0001 g，同时称取0.5g—0.7g参考样(已知活性的植酸酶),分别置于100mL容量瓶中，加入约70mL乙酸缓冲液(3.2)，一个磁力棒，在磁力搅拌器上高速搅拌30min，用乙酸缓冲液(3.2)定容至刻度(减去磁力棒的体积)。摇匀，在离心机上以4000r／min离心10min。
分取1ml上清液,用乙酸缓冲液(3.2)定溶至100ml，摇匀,再吸取稀释后的溶液10ml用乙酸缓冲液(3.1)定溶至100ml.使样液浓度保持在0.08U／mL左右，待反应。
6.3 反应
   
取10mL试管按下面的反应顺序进行操作，在反应过程中，从加入底物(3.3)开始，向每支试管中加入试剂的时间间隔要绝对一致，37℃水解30min。反应步骤及试剂、溶液用量见表2。
6.4
样品测定



反应后的试样在室温下静置10min，如出现混浊需在离心机上以4000r／min离心10min，
上清液以标准曲线的空白调零，在分光光度计415 nm波长处测定样品空白(A0)和样品溶液(A)的吸光值，A-A0。为实测吸光值。用直线回归方程计算植酸酶的活性。
   

表2

反应顺序	样品、标准	样品空白(标准空白)
1．加入待反应液	2.0 mL	2 mL
2．37℃预热5 min	√	－
3．依次加入底物(3.3)	4 mL	4 mL(第二步)
4．混合	√	√
5．37℃水解30min	√	－
6．依次加入终止液(3.7)	4 mL	4mL(第一步)
7．混合	√	√
总体积	10 mL	10 mL

七、结果计算

  

式中：
U——试样中植酸酶的活性，U／g；
   
C——根据实际样液的吸光值由直线回归万程计算出的酶活性，U；
   

F——试样溶液反应前的总稀释倍数,50000；
   
M——试样质量，g；
   

30——反应时间，min。
7.2
结果表示
   
两个平行样品的测定结果用算术平均值表示，保留整数。
7.3重复性
   
同一样品两个平行测定值的相对偏差，植酸酶产品不大于8％，添加植酸酶的各种饲料样品不大于10％。

薛侃

你这个问题好像很难哦，可能就只有植酸酶生产厂家才测这个指标。所以能跟你讨论的人应该很少。但我期待高手的出现！

zhengronghai

使用哪家的植酸酶啊？

fangke3546

倒是大厂家的
按理说不应该这样的，TritonX-100对检测结果的影响到底有多大啊

tgz5637

哈哈，刚好我就是高手，很多卖酶的恐怕连酶检测的基本概念都没弄清。今天毛遂自荐、鲁班面前耍大刀，关公面前弄弄斧。
1 牛血清白蛋白是稳定剂，TritonX-100是表面活性剂，在分子生物学实验里用得很多。两个一块用，无非是减少酶样被浸提萃取及稀释过程中酶的失活，减少酶在试管壁残留，缺点是用量大后，产生的泡沫很多，不容易定容，可以稍微加几滴无水酒精消泡，（乙醇在酶工业也用于提取，但浓度和时间有限制，浓度上限是20～30%（V/V)）,实际上，对于没有加入饲料里的纯酶检测，如果马上测定，不加影响不大，（但记住做标准曲线时，也不能用乙酸缓冲液2，保证同样条件才可以），如果用加了稳定剂的缓冲液，比用不加的测定结果高一些。加入饲料的检测，由于要萃取，故此要加，而且，稳定剂的添加量要加大。
2  检测偏低情况，多数是底物配制出问题，称重很少出问题（除非你的仪器很久没有校正了），必须先调 pH，再来用缓冲液定容。（缓冲液在其缓冲范围，如乙酸盐的缓冲范围是pH3.6～5.8，都有一定缓冲能力，调好pH再定容后的pH是不会改变的）。先定容后调pH,导致底物浓度不足，结果偏低。只用缓冲液溶解植酸钠，不调pH,直接定容，测定结果也是偏低，因为pH偏离5.5。
3
怎样来理解酶活的定义呢？对采用分光光度法，采用的原理是对等比色，即同样的确定条件下，
一个酶活单位分解植酸产生的产物的吸光度值等同于一微摩尔无机磷与显色剂产生的吸光度值。在得到的标准曲线上找出测定吸光值对应的无机磷的量，返推出酶活大小。要注意回归方程的得到的代表无机磷量的单位是什么？你才能理解计算公式的含义。

另一种情况的可能性是你做标准曲线和计算公式根本就不正确，导致计算公式错误，结果偏低。
如果磷酸二氢钾的浓度对OD值做标准曲线，浓度单位是微摩尔/mL, 回归方程单位也换算成微摩尔/mL，计算公式=（回归方程×稀释倍）/(称样量×30)；如果是以磷酸二氢钾的物质的量对OD值做标准曲线，物质量单位是微摩尔，计算梯度时，要乘以0.2。计算公式=（回归方程×稀释倍）/(0.2×称样量×30)；

怎样做标准曲线，可以找书自己看看。

4 例子：5000单位的植酸酶，称样0.8g,稀释10000倍，OD=0.320, 回归方程以磷酸二氢钾的物质的量对OD值做标准曲线，为y=7.840x+0.002,代入第二公式计算，酶活=7.840×0.320×10000/(0.2×0.8×30)=5220u/g

5 其他可能出问题的地方，多数是些低级错误！
       可能就是显色剂配制没配好，多数出在矾酸铵没溶解好，量不够，显色偏低。如果偷懒，没有每次重配显色剂后，重测标准曲线，就套用原来的回归公式，就犯错。或者查查硝酸液配对没有。
      又或者植酸酶的萃取浸提时间不足，以上清液来测，酶活自然偏低。
      或者你的恒温槽恒温温度有误。或者分光光度计有问题。不是单色光，向浓度轴发生偏离。自然测定值低。
       不是自己测定回归方程，而是使用别人提供的或在其他机器上测定的回归方程，计算自然谬误差之千里。

[ 本帖最后由 tgz5637 于 2008-6-20 10:52 编辑 ]

fangke3546

不胜感激,请问我应该怎么样来检验上述环节是否存在问题,怎样解决这些问题呢
另外,我还想请问在计算的时候国家标准上提到"C——根据实际样液的吸光值由直线回归万程计算出的酶活性，U",那C是怎么计算的啊?
我能贸然问一句,我能否电话与你联系?

微尘

华南农大近期有个有关酶制剂的检测培训，是个不错的学习机会

fangke3546

什么时间,有具体信息吗

fangke3546

tgz5637的分析非常透彻,我刚刚接触植酸酶不久,不清楚各个因素的影响到底有多大,tgz5637能否更详细的分析评估一下各个因素的影响.
我的磷标准曲线的回归方程的系数没你的大,我的只有二点几,不知到怎么回事,我怀疑标准曲线的制作也存在一些问题.
我的邮箱是aipu_tchx@yahoo.com.cn,方便的话可否告知电话号码.

fasetuan

确实是个很深奥的问题,没有测过这个项目,学习中......