3.2 小肽饲料价值指标的测定方法 3.2.1 小肽总含量的测定方法 3.2.1.1 双缩脲法 双缩脲法的原理是利用蛋白质和肽分子中含有的肽键（CO-NH-）具有双缩脲反应的特性。在碱性溶液中蛋白质或肽与Cu2+形成紫红色的络合物，络合物颜色的深浅与其浓度成正比。所以它是蛋白质和肽类物质的特异性测定方法。双缩脲法测定灵敏度不高，一般测试浓度在1～10 mg/ml之间。此法尤其适合于肽类物质的测定，但只能测定二肽以上的肽, 造成测定结果偏低。对于小肽来说，双缩脲法会把三肽以上的肽也算在小肽里面，因此只适合可以确定饲料中只含有三肽的饲料。 3.2.1.2 福林-酚法（Lowry法） 福林-酚法是在双缩脲法的基础上发展起来的。首先是在碱性溶液中蛋白质与Cu2+形成紫红色的络合物，然后该络合物再与还原磷钼酸-磷钨酸试剂反应产生深蓝色溶液。此法适合于蛋白类的定量分析，灵敏度较高，检测低限为5 μg，通常测定范围在20～250 μg之间，但专一性不强。同双缩脲法一样，此法也只适合可以确定饲料中只含有三肽的小肽饲料的检测。 3.2.1.3 三氯乙酸（TCA）法 三氯乙酸法的原理是利用大分子的蛋白质在TCA溶液中沉淀，除去酸不溶蛋白质，然后测定酸溶蛋白含量。国外大量资料表明，在蛋白质酶水解的研究中测定水解度，通常在酶解液中加入TCA溶液，使未水解的大分子蛋白质沉淀，而与小分子的酸溶蛋白成分，即肽类和FAA离开，测定酸溶蛋白占总蛋白的含量，求得水解度，即酸溶蛋白占总蛋白的百分比。日本某公司将TCA可溶蛋白做为大豆肽的常规检测方法。大豆肽粉行业标准中酸溶蛋白质的测定方法就是将肽粉经酸沉处理后用国家标准（GB14771-1993）的方法测定酸溶蛋白，游离氨基酸含量测定方法采用GB/T14965食物中氨基酸的测定方法，酸溶蛋白质含量减游离氨基酸含量即为大豆肽含量。 3.2.2 平均肽链长度的测定 测定平均肽链长度需要测定α-氨基氮（α-NH2-N）含量和总氮（TN）含量。用甲醛滴定法测定α-NH2-N含量，总氮用凯氏定氮法测定。然后计算平均肽链长度，公式如下： 3.2.3 特定小肽和氨基酸含量的测定 3.2.3.1 紫外光吸收法 分子中含有芳香族氨基酸（苯丙氨酸、酪氨酸、组氨酸等）的肽，在280 nm处有最大吸收峰。肽在最大吸收峰λmax波长处的吸光值的强弱与蛋白的浓度成正比。这种方法适合对分子中含有芳香族氨基酸的肽进行定量分析，对不含芳香族氨基酸的肽灵敏度较低。 3.2.3.2 消光系数法 分子中含有芳香族氨基酸残基的肽，在280 nm处有特定吸光值。肽分子中所含氨基酸数量不同，它们在280 nm处吸光值的强弱就有差异。因此，每一种纯的单一肽在280 nm处有一个特定的消光系数。如果已知某个小肽的消光系数，只要在280 nm处测定出该蛋白吸光值就可以计算出其相应的含量。 3.2.3.3 考马斯亮兰法（Bradford法） 1976年由Bradford建立的考马斯亮兰法，是根据蛋白质与染料相结合的原理设计的。这种蛋白质测定法具有超过其它几种方法的突出优点，因而正在得到广泛的应用。这一方法是目前灵敏度最高的蛋白质测定法。考马斯亮兰G-250染料，在酸性溶液中与蛋白质结合，使染料的最大吸收峰的位置由465 nm变为595 nm，溶液的颜色也由棕黑色变为蓝色。经研究后人们认为，染料主要是与蛋白质中的碱性氨基酸（特别是精氨酸）和芳香族氨基酸残基相结合。在595 nm下测定的吸光度值A595，与蛋白质浓度成正比。Bradford法的突出优点是：①灵敏度高，据估计比Lowry法约高4倍；②测定快速、简便，只需加一种试剂，完成一个样品的测定只需要5 min左右；③干扰物质少，此法可以用来测定含碱性氨基酸的肽的含量。 3.2.3.4 层析比色法 通过层析柱将不同分子量的肽或氨基酸一一分开，用比色法测定其浓度，再采用已知分子量的肽类和氨基酸做标准曲线，从而计算出一定分子量范围内肽类的含量。该方法与以前的方法相比有很大的进步，但基本上仍属化学法，操作繁琐，人为误差较大。 3.2.3.5 高效凝胶色谱法（HPGC） 该法在层析比色法的基础上，进行了仪器自动化的改进，准确性高、重现性好、数据处理科学，能真实地表示出蛋白质和肽类的分子量分布。分子量分布的测定不但能定性地鉴定肽类产品的优劣、真伪，而且能定量的表示出不同分子量范围的肽的百分含量。国家药品标准《转移因子溶液》WS1—XG—036—2000 中，将该方法做为转移因子（一种肽类）的标准分析方法。 3.2.3.6 高效液相色谱法（HPLC） 高效液相色谱法是20世纪60年代发展起来的一种新型分离分析技术，随着不断改进与发展，目前已成为应用极为广泛的重要化学分离分析手段，是常用的小肽分析方法。高效液相色谱法分为两种；一种用反相C18柱，用乙睛和0.1% TFA或高氯酸的水溶液进行梯度洗脱分离，有的还需加入十二烷基磺酸钠；另一种是以分离氨基酸的经典反相高效液相色谱（HPLC）条件，对小肽进行柱前或柱后衍生化来进行测定。邹娟娟等研究了反相HPLC 分离分析化学合成的O8肽的方法。欧宇认为HPLC测定小肽含量简便、准确，结果稳定，可以用来测定已知小肽在瘤胃中的释放情况。冯健等使用HPLC法测定草鱼血浆肽和虾蛋白肽中小肽总量。但是该法成本高、耗时长，不适用一般饲料企业的快速测定。刘庆生等研究了新型离子色谱的氨基酸分析系统和积分脉冲安培检测对小肽的检测，结果发现此方法无需衍生，可以直接分离测定小肽和氨基酸，而且操作简单、重现性好，其流动相为水、氢氧化钠和醋酸钠溶液，有环境污染小、危险性小和排放少等优点。 3.2.3.7 CE-ESI-MS联用法 毛细管电泳（CE）作为一种高效、快速的分离方法，样品用量少，已被广泛应用于小肽和蛋白质的分离分析。质谱（MS）能够进行微量鉴定，并提供精确的分子量和结构信息，使其成为小肽和蛋白质检测及序列测定强有力的支撑技术之一。其中的电喷雾（ESI）质谱作为一种软电离技术，易与常规的高分辨率分离方法如高效液相色谱、毛细管电泳等实现在线联用，具有分离效率高、检测灵敏度高和样品定性方便等特点，因而在小肽和蛋白质的测定中得到广泛的应用。梁振等研究了CE-ESI-MS联用测定小肽混合物的技术，其检测限可达4.2~33 pg。 4 总结 随着小肽制品商业化的不断深入，制定科学、统一的小肽标准，对小肽饲料进行营养价值的评定已非常必要。科学的测定方法是小肽标准的制定和使用的保证。明确小肽的概念，了解影响小肽饲料营养价值的因素是评定小肽价值的前提，在此基础上我们要选择必要的测定指标，然后筛选相应的测定方法。目前，测定小肽含量的方法有很多种，但从中发展出一套科学有效的测定方法做为小肽标准的尺度仍是一个艰难的任务，有待进一步的研究。 |
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