溶菌酶及其在畜禽饲料中的应用

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溶菌酶来源于动物、植物和微生物，还可以通过基因工程大量生产溶菌酶。溶菌酶化学性质稳定，是一种较耐热的碱性蛋白质；能水解细胞及真菌细胞壁中的N-乙酰氨基葡萄糖和N-乙酰胞壁酸之间的β-1，4糖苷键，具有抗菌消炎、抗病毒、增强机体免疫力等功效。将其用于饲料中具有防腐和杀菌、防治子猪腹泻、防治胃肠炎和消化不良等作用，在畜禽饲料中具有广阔的应用前景。
    对溶菌酶的研究最早是从1907年发表枯草杆菌溶解因子的报告开始的；两年后，研究者指出，鸡蛋清强烈的抑菌作用是酶作用的结果；1922年英国细菌学家Fleming发现人的唾液、眼泪中存在一种明显溶解细菌细胞壁的成分，因其具有溶菌作用而将其命名为溶菌酶。随着研究的不断深入，发现不仅有溶解细菌细胞壁的溶菌酶，还有作用于真菌细胞壁的溶菌酶，同时对其作用机制也有了更深入的研究。溶菌酶作为畜禽饲料添加剂的应用才刚开始，国内已有报道在畜禽生产中应用溶菌酶，并取得了较好的饲养效果。
溶菌酶的化学性质
    溶菌酶是一种广泛存在于各种动植物机体中的糖苷水解酶，使用于N-乙酰氨基葡萄糖和N-乙酰胞壁酸之间的β-1，4糖苷键，能分解某些细菌细胞壁中的粘多糖。鸡蛋清溶菌酶是研究最清楚的一种溶菌酶，它是由129个氨基酸残基组成的碱性球状蛋白质，在分子中的4对含硫氨基酸残基间形成4个S-S键，等电点在pH值10.8左右，分子量为14000。其化学性质非常稳定，当pH值在1.2~11.3的范围内剧烈变化时，其结构几乎保持不变。在酸性环境下，溶菌酶对热的稳定性很强，pH值4~7时100℃加热处理45分钟。干燥条件下在室温可长期保存，其纯品为白色或微黄色结晶体或无定型粉末，无嗅，味甜，易溶于水，不溶于丙酮、乙醚。研究者1965年用X射线晶体结构分析法阐明了溶菌酶的三维结构，溶菌酶分子近椭圆形，大小为4.5nm×3.0nm×3.0nm，其构象复杂，螺旋仅占25%，在分子的一些区域有伸展着的折叠结构。研究表明，溶菌酶的内部几乎都为非极性的氨基酸残基，疏水的相互使用在溶菌酶的折叠构象中起到重要作用，其分子表面有一个较深的裂缝，其大小恰能溶纳多糖底物的6个单糖，这是溶菌酶的活性部位。在溶菌酶的活性部位，由第三十五位的谷氨酸和第五十二位的天门冬氨酸残基构成的活性部位能水解微生物细胞壁N-乙酰氨基葡糖和N-乙酰胞壁酸间的β-1，4糖苷键。
溶菌酶的生物学功能
    细菌的细胞壁由胞壁质组成，胞壁质是由N-乙酰氨基葡糖及N-乙酰胞壁酸交替组成的多聚物，胞壁酸残基上可以连接多肽，称为肽聚糖。肽聚糖是细菌细胞壁的主要成分，它是由N-乙酰氨基葡糖、N-乙酰胞壁酸和肽“尾”（一般是4个氨基酸残基）组成，N-乙酰氨基葡糖与N-乙酰胞壁酸通过β-1，4糖苷键相连，肽“尾”则是通过D-乳酰羧基连在N-乙酰氨基葡糖的第三位碳原子上，肽尾之间通过肽“桥”（肽键或少数几个氨基酸残基）相接，N-乙酰氨基葡糖、N-乙酰胞壁酸、肽“尾”与“肽”桥共同组成了肽聚糖的多层网状结构，作为细胞壁的骨架，上述结构中的任何化学键断裂，皆能导致细菌细胞壁的损伤。对于G+细菌与G-细菌，其细胞壁中肽聚糖含量不同，G+细菌细胞壁几乎全部由肽聚糖组成，而G-细菌只有内壁层为肽聚糖。
    溶菌酶能有效地水解细菌细胞壁的肽聚糖，其作用位点是N-乙酰氨基葡糖的1位碳原子和N-乙酰胞壁酸的4位碳原子间的β-1，4糖苷键，结果使细菌细胞壁变得松弛，失去对细胞的保护作用，最后使细菌细胞溶解死亡。溶菌酶之所以会对G+细菌有很强的杀伤力，而对G-细菌作用不大，是因为G+细菌的细胞壁主要是由胞质壁和磷酸质组成的，其中的主要成分胞质壁又是由杂多糖与多肽组成的糖蛋白，而这种杂多糖正是由N-乙酰氨基葡糖和N-乙酰胞壁酸以β-1，4糖苷键连结而成的。在体内环境下，由于有分泌型免疫球蛋白A、补体参与，溶菌酶还能水解某些G-细菌，如大肠杆菌等。人和动物细胞无细胞壁结构，故溶菌酶对人及动物体细胞无毒性作用。
    由于真菌细胞壁中N-乙酰氨基葡糖之间形成的β-1，4糖苷键（几丁质）也是溶菌酶作用的底物，所以溶菌酶可以抗含有几丁质细胞壁的真菌感染。溶菌酶还能与各种诱发炎症的酸性物质结合，使其失活，并增强抗生素和其他药物的疗效，改善组织基质的粘多糖代谢，从而有利于修复被炎症损伤的组织。溶菌酶还有抗病毒作用，它是一种碱性蛋白质，在体内近于中性的pH值环境下带有大量正电荷，可与带负电荷的病毒蛋白起作用，和DNA、RNA、脱辅基蛋白形成复盐，使侵入体内的病毒失活。溶菌酶可增强机体免疫力，溶菌酶参与体内多种免疫反应，在机体正常防御和非特异性免疫中具有重要作用。它可以改善和增强巨噬细胞吞噬消化功能，降低细胞抑制剂导致的白细胞减少，结合细菌脂多糖，减轻内毒素作用，以达到增强机体抵抗力的目的。另外，溶菌酶还能激活血小板，改善组织局部循环障碍，分解脓液，增强局部防卫，从而更好地体现抗菌、消炎、止疼等作用。
溶菌酶的来源
    溶菌酶作用底物的特异性很强，不同来源的溶菌酶作用的底物不同。按其来源不同可分为蛋清溶菌酶、动物溶菌酶、植物溶菌酶、微生物溶菌酶和噬菌体溶菌酶。按其作用的微生物不同分为两大类，即细菌细胞壁溶菌酶和真菌细胞壁溶菌酶。细菌细胞壁溶菌酶有两种，一种是作用于β-1，4糖苷键的细胞壁溶菌酶，另一种是作用于肽“尾”和酰胺部分的细胞壁溶菌酶。真菌细胞壁溶菌酶包括酵母菌细胞壁溶解和霉菌细胞壁溶菌酶。
    鸡蛋清溶菌酶
    鸡蛋清溶菌酶占蛋清总蛋白的3.4%~3.5%，是动植物中溶菌酶的典型代表，也是目前了解最清楚的溶菌酶之一。可分解溶壁小球菌、黄色八迭球菌和巨大芽孢杆菌等革兰氏阳性菌，但对革兰氏阴性菌无效。当有二乙烯三胺存在时，某些G-细菌也可被该酶分解。鸡蛋清中的溶菌酶分子量为14000，等电点为11.1，最适温度为50℃，最适pH值为6~7，其化学性非常稳定，pH值在1.2~11.3范围内剧烈变化时，结构仍然稳定。其在酸性环境下，是一种热稳定的碱性蛋白质，但在碱性环境中对热稳定性较差；在pH值4~7范围内，100℃处理1分钟，仍保持原酶活性。其一级结构由129个氨基酸组成，维持其结构的主要使用力为二硫键、氢键和疏水键。
    从其他鸟类如鹌鹑、珍珠鸡、火鸡等禽类的蛋清中也分离纯化出溶菌酶，与鸡蛋清溶菌酶活性非常相似，也由129个氨基酸组成，虽排列顺序有所不同，但活性部位的氨基酸排列则大体相同。
    人和哺乳动物的溶菌酶
    在人和许多哺乳动物的组织和分泌液中均发现有该酶存在。已知在人的眼泪、鼻黏液、唾液、乳汁等分泌液中及肝、肾、淋巴组织含有此酶。人体溶菌酶由130个氨基酸组成，含4个二硫键，分子量为14600。人溶菌酶的氨基酸组成和排列顺序与鸡蛋清溶菌酶有较大差异，但与鸡蛋清溶菌酶的高级结构却十分相似，人溶菌酶活性比鸡蛋清溶菌酶活性高3倍。目前，从牛马等的乳汁中已分离出了溶菌酶，其理化性质与人溶菌酶基本相似，但结构尚不清楚，其溶菌活性也远低于人溶菌酶约3000倍。
    植物中的溶菌酶
    目前已从木瓜、芜菁、大麦、无花果和卷心菜等植物中分离出溶菌酶，其分子量较大，约为24000~29000。植物溶菌酶对溶壁小球菌活性不超过鸡蛋清溶菌酶的1/3，但对胶体状甲壳质的分解活性则是鸡蛋清溶菌酶的10倍。
    微生物产生的溶菌酶
    微生物产生的溶菌酶可分为7类，其中细菌细胞壁溶菌酶有3类：（1）内N-乙酰已糖胺酶：破坏细菌细胞壁肽聚糖中的，β-1，4糖苷键，与鸡蛋清溶菌酶作用相似。（2）酰胺酶：切断细菌细胞壁肽聚糖中N-乙酰胞壁酸肽“尾”之间的N-乙酰胞壁酸-L-丙氨酸键。（3）内肽酶：使肽“尾”及肽“桥”内的肽键断裂；现有的研究发现，细菌细胞溶菌酶的抗菌活性不仅表现在其分解细菌细胞壁方面，当酶受到不可逆抑制后，它仍然显示出抗菌效应；不同来源的细菌细胞壁溶菌酶有不同的抗菌范围，并对不同类型的肽聚糖有特异性。真菌细胞壁溶菌酶有4种：（1）β-1，3、β-1，6葡聚糖酶和甘露聚糖酶：能分解酵母细胞的细胞壁。（2）壳聚糖酶：与葡聚糖酶共同作用，可分解霉菌和酵母。（3)磷酸甘露糖酶：与葡甘露糖酶共同作用，可分解原生质。（4）脱乙酰壳多糖酶，主要分解毛霉和根霉。
    噬菌体产生的溶菌酶
    该酶是一种特异性的酶，由噬菌体感染、诱导产生，但未被感染的宿主细胞内不存在该酶。
    基因工程溶菌酶
    一些动物和微生物来源的溶菌酶已进入工业化生产。国内企业生产的溶菌酶主要是蛋清溶菌酶。然而从生物材料提取溶菌酶存在固有缺陷，一是受生物材料来源限制。二是生物材料由于取自不同生物体，保鲜程度不一，难以保证不受病毒和其他有害物质污染，这会造成产品质量不稳定。而利用DNA重组技术进行生产，则可以克服这一弊病。目前，文献已有利用DNA重组技术将人等物种的溶菌酶基因克隆到原核或真核生物中进行表达的报道。
溶菌酶在畜禽饲料中的应用
    溶菌酶已广泛地在食品工业、医学、酶工程及科研中得到应用，而其在畜禽饲料中的应也也越来越受到人们的重视。
    用作饲料防腐剂和杀菌剂
    由于溶菌酶本身是一种天然蛋白质，无毒性，是一种安全性高的饲料添加剂。它能专一性的作用于目的微生物的细胞壁，而不能作用于其他物质。该酶对革兰氏阳性菌、枯草杆菌、耐辐射微球菌有强力分解作用。对大肠杆菌、普通变形菌和副溶血弧菌等革兰氏阴性菌等也有一定的溶解作用。与聚合磷酸盐和甘氨酸等配合作用，具有良好的防腐作用，在饲料中添加溶菌酶可防止霉变，延长饲料的储存期。
    具有防治子猪腹泻的作用
    溶菌酶可以提高内源性蛋白酶的活性，促使抗炎多肽的产生，因而具有抵抗和消除炎症的作用。溶菌酶对引起子猪腹泻的埃希氏大肠杆菌和轮状病毒具有较强的抑制作用。溶菌酶对子猪腹泻有防治作用，它与免疫球蛋白在功能上有着紧密的联系，并能与其他活性物质一起增强抗体的活性，从而杀灭或抑制细菌生长繁殖。研究报道，7日龄~60日龄的子猪饲喂溶菌酶制剂后，其腹泻发病率显著降低，说明溶菌酶对引起子猪腹泻的埃希氏大肠杆菌和轮状病毒具有较强的抑制作用。试验表明，溶菌酶对治疗子猪腹泻有明显的功效，溶菌酶可溶性粉剂治疗子猪腹泻效果优于传统用药，治愈率达80%以上。
    用于防治胃肠炎、消化不良等疾病。试验表明，日粮中添加溶菌酶饲喂肉子鸡、犊牛、子猪等畜禽，可用于防治胃肠炎、消化不良等疾病。溶菌酶制剂还能有效防止球虫病。饲喂小麦基础日粮的鸡，添加和不添加酶对球虫病的应激呈现不同的反应，对照组鸡生长被抑制52.5%，而加酶组为30.5%，而且损伤系数要好得多。试验表明，在不用任何抗生素情况下，肉鸡饲料中添加饲用溶菌酶制剂，可促进鸡体的健康，增加体重和饲料报酬，降低死亡率。
结论与展望
    由于饲料工业中长期使用抗生素而导致畜禽细胞免疫及体液免疫功能下降，同时抗生素可在畜禽体内残留而危及人类的健康，饲料工业急需无毒、无害的安全绿色添加剂。由于溶菌酶具有良好的理化特性，可用于饲料中替代抗生素，应用前景相当广阔。溶菌酶作为畜禽饲料酶类添加剂，在饲料加工及通过胃内酸性环境时仍能保持较高的酶活力，溶菌酶所具有耐热、耍酸特性为其用作饲料添加剂提供了保证。
    但是，由于各类型的溶菌酶都有其最适的反应条件，而且作用特性强，只对特定的微生物有充分的溶解作用，通常对G+细菌的溶菌作用有效，对G-细菌则无效或效果不显著。因此，首先应充分掌握溶菌酶的化学特性；其次要搞清楚饲料中的水分、pH值、离子等影响溶菌酶作用效果的因素，采用适当的添加量和添加方法，最大程度地发挥溶菌酶的活力。  本文转自D+快检创客联盟：http://bbs.dplus.com.cn/