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[技术研发] 饲料专用低温淀粉酶

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发表于 2015-6-4 16:23:27 | 显示全部楼层 |阅读模式
本帖最后由 高研 于 2015-6-4 16:34 编辑

论坛里很少有关于淀粉酶的文章,发一篇供大家交流,虚心求教。
      
      
一种低温α-淀粉酶的酶学性质研究
         
( 杭州保安康生物技术有限公司,浙江杭州311508)
      
    摘要:经分离纯化及诱变育种得到一株低温α-淀粉酶高产菌株。研究结果表明,该菌株产生的酶是一种内切型淀粉酶,最适作用温度为50℃,最适作用pH为5.2。该酶具有较好的耐热性和耐酸性,经85℃高温制粒,酶活存留率达88.1%;用pH4.0的乙酸-乙酸钠缓冲液处理4h后,酶活存留率达90%以上。体外模拟耐胃蛋白酶试验,证明胃蛋白酶对该低温α-淀粉酶无影响。对酶解产物进行分析,分子量集中在5000以下,比例达到70.26%。
      
    关键字:低温α-淀粉酶;酶学性质        
      
    淀粉是单胃动物能量的主要来源,其供能占总能量需求的60%~80%。幼龄动物消化系统发育不成熟,淀粉酶分泌不足,限制了淀粉的消化吸收。随着动物日粮配方的富营养化、饲养条件应激和环境污染问题越来越突出,成年健康动物添加“外源性营养消化酶”的作用也越来越明显,意义也越来越大。通过添加外源性淀粉酶来提高饲料淀粉的消化吸收,对于提高动物生产性能、节约饲料资源意义重大[1]。
      
    目前饲料专用淀粉酶的研究开发较少,一般均采用食品加工、化纤、印染等工业用酶。中温α-淀粉酶是饲料工业中应用最多的淀粉酶,其最适作用温度为70℃~80℃,pH5.0以下失活严重。动物生理环境温度—般为37℃~42℃,胃内pH较低,中温淀粉酶在动物消化道内发挥作用甚微。低温淀粉酶最适作用温度比中温淀粉酶要低20℃~30℃,因此研究开发低温淀粉酶对饲料用酶而言,具有重要意义。
      
本研究对低温淀粉酶的酶学性质进行了研究,旨在为饲料专用淀粉酶的开发提供依据。
      
1 材料和方法        
      
1.1 菌种 从采集到的样品中分离纯化并经诱变育种得到。
      
1.2 培养基        
      
固体发酵培养基
      
      麸皮50%,大豆粉25%,玉米粉15%,玉米芯7%,葡萄糖2%,酵母膏0.35%,MgSO4 0.04%,KH2PO4 0.1%,CaCl2 0.01%,NH4Cl 0.5%。
      
1.3 药品和试剂
      
1.3.1 0.05 mol 硫代硫酸钠:
      
13g Na2S2O3·5H20和0.1 g 无水碳酸钠定容1000mL。
      
1.3.2 费林试剂
      
-----铜溶液:硫酸铜34.66 g 溶解在水中,定容至500 mL。
      
-----酒石酸钾钠碱溶液:酒石酸钾钠173 g 和氢氧化钠50 g 溶解在水中,定容至500 mL。
      
-----使用前,精确地取等体积的铜溶液和碱液充分混合。
      
1.4 低温淀粉酶活力的测定方法
      
将可溶性淀粉溶液10ml加到100mlErlenmyer三角瓶中,置于(40±0.5)℃恒温水浴中。预热10min-15min,加入样品稀释酶液1ml.准确加热30min后。加入费林试剂4ml使酶失活。将三角烧瓶直接在煤气喷灯(或电炉)上加热2min后,立即放在自来水中冷却。随后,加入30%碘化钾溶液2ml和25%硫酸溶液2ml,用0.05mol/L硫代硫酸钠溶液滴定游离出的碘,以蓝色小时作为滴定终点T30(ml)
  空白对照实验:以水取代酶液。在另一个三角烧瓶中用上述同样的操作步骤测定空白对照值T0(ml).临近终点时,加入1%可溶性淀粉溶液1滴-2滴,以蓝色消失作为滴定终点。
      
一个酶活力单位定义为1g固体酶粉(或1mL液体酶),于40℃、pH=5.0条件下,反应30min,反应液中产生相当于10mg葡萄糖的还原糖所需的酶量。
      
淀粉酶活力(u/ml)=(T0-T30)×f×1.62×1/10×n
      式中:T30----酶反应液滴定消耗硫代硫酸钠标准溶液的体积,ml
   T0----空白溶液滴定消耗硫代硫酸钠标准溶液的体积,ml
   f----0.05mol/l硫代硫酸钠溶液浓度的校正系数
   1.62----换算系数
   1/10----该分析方法的常数(相当于10mg葡萄糖的还原糖)
   n----样品的稀释倍数      
2 实验结果
      
2.1 产酶菌株的发酵培养与活力检测
      
    将经过筛选和育种得到的菌株接入固体发酵培养基中,30℃培养50h。烘干、粉碎后测定低温淀粉酶活力,酶活最高达3820U/g。
      
2.2 酶学性质的研究        
      
2.2.1 低温淀粉酶作用温度的研究
      
在pH5.0 的酶活测定反应体系中,分别在25℃、30℃、35℃、40℃、45℃、50℃、55℃、60℃温度下测定酶活,温度对酶活的影响如图1。
                                                 6.jpg
                                                        图1 温度对酶活的影响
      
Fig.1 The effect of temperature on relative activity
      
    由图可知,该低温淀粉酶最适作用温度为50℃,在35~60℃之间均有较高的酶活。
      
2.2.2 低温淀粉酶的最适作用pH
      
在40℃的酶活测定反应体系中,分别调节pH为2.2、2.5、3.0、3.5、4.0、4.2、4.4、4.6、4.8、5.0、5.2、5.4、5.6、5.8、6.0、6.5、7.0、7.5、8.0,按照低温淀粉酶的酶活力测定方法测定酶活,测定结果如图2所示。
                                                                           
                                          1.jpg
图 2 pH对酶活的影响
      
Fig.2 The effect of temperature on relative activity
      
由图可知,该低温淀粉酶最适作用pH为5.2,在pH4.0~6.0之间均有较高的酶活。
      
2.2.3 酶的热稳定性
      
     为了准确评估低温淀粉酶经饲料高温制粒后的实际存留率,本试验在饲料中添加20%的淀粉酶,然后进行85℃高温制粒后进行评估,试验结果见图3。
                                        2.png
图 3 酶的热稳定性
      
Fig.3 Thermal stability of enzyme
      
由图3可知,制粒前低温淀粉酶理论值为624U/g,实际检测值为603U/g,经过85摄氏度制粒后酶活为531 U/g ,酶活存留率达到88.1%,说明在高温制粒过程中低温淀粉酶具有较好的耐受性能,适用于饲料制粒工艺。
      
2.2.4低温淀粉酶的耐酸性评估
      
将制得的酶液分别用pH3.5、4.0、4.5的乙酸-乙酸钠缓冲液处理0h、1h、2h、3h、4h,测定淀粉酶活力,结果如图四所示。
            
3.jpg

图 3低温淀粉酶的耐酸性
      
Fig.4 Acid resistance of enzyme
      
     用pH3.5的乙酸-乙酸钠缓冲液处理4h后,淀粉酶活力存留80%以上,经pH4.0的乙酸-乙酸钠缓冲液处理4h后,淀粉酶活力存留90%以上,说明该淀粉酶耐酸性良好。
      
2.2.5 体外模拟耐胃蛋白酶实验
      
     模拟动物体内生理环境温度40℃,加入1mg/mL的新鲜胃蛋白酶盐溶液(0.1N,pH3.5),处理5h,每隔1h测定淀粉酶活。
            
4.jpg

图 5 耐胃蛋白酶实验
      
Fig.5 Resistance to pepsin experiment
      
由图可知,在pH3.5、温度40℃、用1mg/mL的胃蛋白酶溶液处理淀粉酶5h后,淀粉酶活力存留仍在80%以上。
      
2.2.6 HPLC对酶解产物的分析
      
取一定量5%的淀粉溶液,预热保温40℃,加入一定量的低温淀粉酶,控制反应时间为30min,然后沸水浴5min使酶失活,微孔膜过滤后,利用HPLC分析样品中各物质的分子量分布,图谱峰见图6。

                                                                     
            
保留时间
         
            
重均
         
            
重均/数均
         
            
%
         
            
8.055
         
            
4539
         
            
1.34742
         
            
52.7026
         
            
8.643
         
            
1586
         
            
1.00603
         
            
10.1598
         
            
8.955
         
            
1245
         
            
1.00315
         
            
6.3192
         
            
9.295
         
            
1015
         
            
1.00207
         
            
1.0784
         
      
图5 低温淀粉酶酶解产物HPLC图谱
      
Fig.6 HPLC analysis of starch solution by cold-adapted amylase
      
    从图谱可看出,低温淀粉酶酶解产物分子量多集中于5000以下,占酶解物总量的70.26%。
      
3 结论与讨论
      
    通过分离纯化筛选到的菌株,产淀粉酶活力能够达到3820U/g,同国内报道的低温淀粉酶菌株相比,具有较高的研究应用价值[9,10]。该淀粉酶是一种内切型α-淀粉酶,最适反应温度为50℃,最适作用pH为5.2,在pH4.0~6.0之间具有较高活性;该低温淀粉酶有较好的耐酸性和耐热性,用pH4.0的乙酸-乙酸钠缓冲液处理4h后,淀粉酶活力存留90%以上,经过85℃高温制粒后,酶活存留率为88.1%。采用体外模拟耐胃蛋白酶试验,证明胃蛋白酶对其无影响。
      
    从酶学性质分析,该菌株生产的低温α-淀粉酶适合动物消化道环境条件,能够耐受高温制粒,在饲料行业有很大的应用前景。
      
      
参考文献
      
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