芽孢杆菌菌体形态观察生理生化试验

kiroco

将COL-J菌接种到初筛平板上37℃培养24h，观察菌落形态；接种于种子培养基中37℃，180r/m摇瓶培养12h，做革兰氏染色观察。
1 生理生化试验：以一株标准短小芽孢杆菌为对照，对COL-J菌的部分生理生化特征进行实验观察。
根据分离菌的菌落和菌体形态，芽孢的有无和着生情况，以及生理生化反应，按东秀珠《常见细菌系统鉴定手册》进行初步分类[8] 。
2 16S rDNA的PCR扩增
生物细胞DNA分子的一级结构中既具有保守的片段，又具有变化的碱基序列,保守的片段反映了生物物种间的亲缘关系，而高变片段则能表明物种间的差异．这些核苷酸序列则是不同分类级别生物(如科、属、种)鉴定的分子基础，以16SrDNA为聚合酶链式反应(PCR)扩增的靶分子进行细菌快速分类鉴定，与其它细菌鉴定方法比较，具有高效、准确、简便、特异性强的优点[9]。
1.4.3.1细菌总DNA的提取
将菌种接种于20mL/150mL种子培养基，37℃ 180r/m培养12 h，按如下柱式DNA out抽提试剂盒使用手册提取菌株COL-J的总DNA：
(1)取1mL菌液离心1 min后，重悬于0.6mL溶菌液中，吹打均匀，37℃保温30 min。
(2)13000g离心10 min后弃上清夜。
(3)加入300uL溶液A到细菌沉淀中，吹打均匀。
(4)加入150uL溶液B到离心管中，颠倒数次混匀后溶液中将有白色丝状悬浮物产生。
(5)65‍℃水浴放置3-5min。
(6)加入200uL氯仿，震荡混匀30秒，溶液呈乳白色。
(7)13000g室温离心2min，上清透明，中间层有白膜，小心转移上清到新的离心管中，避免触及中间的白膜。
(8)加入1.5倍体积（约0.6mL）的通用上柱夜到上清中，颠倒混匀全部转移到离心吸附柱中，室温放置4min。
(9)13000g室温离心1min，DNA吸附在离心吸附柱的膜上，倒弃收集管中的穿透液。
(10)将0.5mL通用洗柱液加入离心柱中，13000g室温离心1min，弃穿透液。
(11)重复第10步操作一次。
(12)空甩半分钟，将离心吸附柱转移到新的离心管中。
(13)加50-100uL自备TE（pH8.0），室温放置3-5min。
(14)13000g室温离心1min即得DNA溶液。
1.4.3.2 16S rDNA 的PCR扩增和序列测定
上游引物序列：5’-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3’
下游引物序列：5’-TACGG（C/T）TACCTTGTTACGACTT-3’
PCR反应体系（25uL）为：10×buffer2.5uL, 25umol 的MgCl2 0.5uL，2.5mmol dNTP0.5uL，上游引物1uL,下游引物1uL, DNA0.5uL，5U/uL的Taq酶0.5uL，超纯水17.5uL。PCR扩增程序为：95℃预变性5min；95℃45sec，56℃30sec，72℃1.5min，循环30次；72℃延伸10min。PCR产物送上海英骏 (invitrogen)生物技术有限公司进行序列测定。
1.4.3.3 序列比对
将16S rDNA测序结果在GenBank的核酸数据中进行同源性比对。