饲料用木聚糖酶活力测定的研究

kiroco

饲料用木聚糖酶的分析测定是长期以来困扰木聚糖酶生产和应用的一个主要难题,特别是固态发酵生产的木聚糖酶,发酵成品中往往含有其它非淀粉多糖酶(纤维素酶、葡聚糖酶、果胶酶和甘露聚糖酶等)[1-3]。文献报道的关于影响酶活测定的因素很多,测定的重复性较差 [4-5，7]，除了温度和pH值以外,还存在着其它很多不确定的因素。本文将从底物的性质和浓度、酶样的稀释度、离子强度和反应时间等方面讨论对酶活测定的影响,提出比较可行的饲料用木聚糖酶的分析方法。

酶活定义为在37 ℃和设定pH值条件下，每分钟内从底物溶液中降解释放1 μmol/l还原糖所需要的酶量为一个酶活单位(U)。测定木聚糖酶活力的方法主要有3种：粘度法、底物染色法和还原糖法。

粘度法是通过测定木聚糖酶对底物粘度的降解速度来计算酶活力，这种测定分析方法有较好的实用价值，但是测定过程比较繁琐，而且重复性较差，目前很少采用。

底物染色法是一种比较简便快速的测定方法,其基本原理是以木聚糖为基质,用胶联方式连接和包裹特定的染料，制成染料含量均衡,质量稳定的片剂。这种片剂容易溶于水溶液中,与木聚糖酶反应后,长链的木聚糖被降解,结合的染料分子被释放到溶液中。通过测定溶液中染料的浓度,就可以就算出酶活力。这种测定方法经常被一些专业生产生物酶的大型企业采用。但是它只能测定特定的木聚糖酶活力,不具有代表性。

还原糖法是通过测定还原糖的产量来计算酶活力。这种分析方法也比较简便，而且重复性也比较好。国内外关于木聚糖酶的研究报告多数采用这种方法。这种方法的主要不足是不能很好地分析内切酶的活力，而内切酶的活力对于饲料酶的实际使用效果来说是很重要的。

如果希望通过测定木聚糖酶在某一标准状态下的活力来判断木聚糖酶质量的优劣或者预测其动物饲喂效果是远远不够的。木聚糖酶的实际作用底物是不溶于水的高聚物，它们主要存在于植物种子的表皮层内，与葡聚糖、果胶、甘露聚糖、木质素和蛋白质等生物大分子结合在一起。在天然木聚糖与水组成的多相体系中，酶总是处于底物不饱和状态，因此难以用测定酶反应初速度的方法测定酶活力。酶与底物的反应是在固相界面上进行的，其酶解反应速率受到底物对酶蛋白吸附速率和产物扩散速率的限制[4]。目前通常采用的底物是溶于水的木聚糖，如燕麦木聚糖和桦木木聚糖，其测定值要比实际发挥作用的酶活力高出很多倍[5-6]。从目前的研究进展分析，制定一个绝对公平的标准是很困难的，几乎是不可能的。

2005年6月，我们接受全国饲料工业标准技术委员会下达的木聚糖酶活力测定的标准制定任务，联合了众多酶制剂企业共同起草了木聚糖酶活力测定的标准。在标准起草过程中，我们分析了近300 个含有木聚糖酶的样品，测定数据约1 200个。通过综合各种因素，采用还原糖法，分析了影响酶活力测定值的因素，同时结合生产实际，制定了相对比较公正科学的评判标准。

1 重要操作分析参数的确定

1.1 标准曲线的线性范围

确定酶解产物浓度与吸光度的标准曲线的线性范围是酶活力测定的前提，试验采用DNS法测定木糖浓度，其线性范围为：木糖浓度在0.2～0.7 mg/ml之间，吸光度在0.15～0.70之间

1.2 底物的性质

从酶的组成分析可以发现，木聚糖酶存在着底物作用的特异性。

目前工业生产中使用的木聚糖酶主要有两大类，一类是用于饲料，另外一类是用于造纸。用于饲料的木聚糖酶应该以降解燕麦木聚糖的能力为主要检测指标，而用于造纸工业的木聚糖酶应该以降解桦木木聚糖为主要分析指标。

在实际使用过程中，单纯比较某一种酶活力指标是不够的，但是要想全面衡量饲用木聚糖酶的活性和使用效果也是很困难的。目前国内外的研究报道通常以降解燕麦木聚糖(Sigma X0627)的活力作为主要比较指标[8-10]，这是因为测定降解燕麦木聚糖相对比较容易，重复性也比较好。因此笔者建议测定饲料用木聚糖酶活力的行业标准也以测定降解燕麦木聚糖的活力为主要指标。

从理论上分析，只要满足3个条件，即能被酶作用、很好的代表性、很好的稳定性和重复性，都可以作为测定饲料酶活力的底物。但是，从目前的研究分析发现，能符合这个条件的底物只有Sigma X0627，虽然Sigma X0627这个产品的本意并不是想用于木聚糖酶活力测定的标准底物。无论是国内还是国外，也不论是生产实际还是SCI论文，涉及木聚糖酶活力测定的底物基本上都是用Sigma X0627。

1.3 底物浓度对测定活力的影响

底物浓度对测定值有重要影响，这主要与酶反应的米氏常数Km值有关。图2是关于3种菌种产生的木聚糖酶，它们要求的饱和底物作用浓度(使酶活发挥达到99%的饱和活力时的底物浓度)有一定差异。

从理论上分析，底物浓度越高分析的偏差越小。但是，实际上并非如此，过高的底物浓度也会对测定结果产生不利的影响。燕麦木聚糖比较难溶于水，需要先在碱性条件下加热，然后才能溶解。如果配制浓度过高，底物溶液中的还原糖和低聚糖含量都增大，使测定本底值升高，所以过高的木聚糖浓度是不必要的。由图2可知，三种木聚糖酶(Xylanase 1、Xylanase 2、Xylanase 3分别来源于硫色曲霉A. sulphureus、米曲霉A. orzyae和黑曲霉A. niger)，它们的饱和底物浓度都不超过3.0 mg/ml。

目前市场上流行的由毕赤酵母发酵产生的木聚糖酶，其结构基因也是来自曲霉菌或者细菌，而细菌产生的木聚糖酶(包括其它酶种)其饱和底物浓度远低于曲霉菌产生的酶。

燕麦木聚糖(Sigma X0627)在中性条件下很难溶解，在碱性条件下容易溶解。在溶解燕麦木聚糖底物时可以先在氢氧化钠碱性溶液中溶解，然后再用醋酸溶液调节到所需的酸碱度。事实证明，这种方式是比较好的，所产生的本底还原糖浓度也是很低的，对测定结果影响很小。

1.4 反应液离子强度对测定的影响

反应液的离子强度对酶活力测定结果也有影响。如图3所示：在不同离子强度条件下测定纤维素酶的活力，结果有较大差异。溶液的离子强度影响酶分子的空间构像，从而影响了酶分子活力的发挥。所以，在测定过程中应该统一反应液的离子强度，这一点往往被人们忽视。那么究竟应该选择何种离子强度比较合适，目前还没有统一。不同的酶系要求的最佳离子强度各不相同，需要经过探索才能确定。根据畜禽消化道的生理状况，笔者建议反应液的离子强度采用0.1 mol/l。

1.5 反应时间的选择

为了使获得的测定值尽可能准确，不仅需要选择在线性的反应范围内，而且应该有足够的线性反应时间。在线性反应条件下，延续的作用时间越长，测定的相对误差也越小。

大量研究发现,不同的酶系其线性作用时间各不相同。一般情况下,酶系较全的组分线性作用时间较长。而酶系比较简单的组分,线性作用时间较短。图4是2种比较典型的木聚糖酶系及比利时生产酶C 的线性范围。硫色曲霉(A. sulphureus MAFIC-001)产生的木聚糖酶A的线性作用时间接近100 min，黑曲霉(A. niger MAFIC-005)产生的木聚糖酶B的线性作用时间不到60 min。从文献报道的数据和笔者的试验结果发现，比利时生产的一种由细菌发酵产生的木聚糖酶C的线性作用时间最长，可达8 h左右。线性反应时间最短的商业木聚糖酶是由一种木霉发酵产生的，线性反应时间不到20 min[5]。

酶反应的线性作用时间长，对分析产物本底值含量高的酶产品是很有利用价值的。在实际测定过程中，为了消除产品的产物本底误差，必须适当加大稀释度。此时就要尽量延长酶反应时间，使形成的产物量尽可能与本底值拉开距离。这种情况特别适用于测定活力比较低的酶产品。

1.6 酶反应液pH值的选择

反应液pH值的选择是重要参数。研究发现,目前木聚糖酶的同功酶至少有200种,有商业生产价值的不少于10种。它们的最适pH值都不一样,而且有些变动幅度还很大(见图5)。

如何确定合理的分析用pH值对酶活力测定的影响。目前国内的很多饲料生产企业对于饲料酶的综合评价能力很低，很多用户只看标示酶活力，没有考虑实际作用效果。由于饲料酶产品标签上不能标示很宽泛的pH值范围内的表现酶活，另外，也由于生产菌种不同，即使是同样的测定酶活力，实际使用效果也是不同的。

所以必须要定一个比较合理的pH值，在这个pH值条件下测定酶活力。酶活力只是一个酶活效果的参考值，但是对于产品本身来说确是判定产品质量是否合格的重要指标。

考虑到目前流行的测定木聚糖酶pH值和实际可操作性，本标准采用 5.50作为测定用pH值。

1.7 样品酶活力检测限量的确定

如果从纯粹的分析仪器和标准曲线的线性范围考虑，样品酶活力的检测限量可以达到1.0 U/g，甚至更低。但试验发现，一些在预混料中的饲料酶，有些木聚糖酶活力在5.0 U/g以上，也很难测定出来，往往只显示0.2～0.5 U/g。使用螯合物以消除金属离子的干扰，结果也不理想。这种现象不仅存在于木聚糖酶，其它一些饲料酶，如常用的植酸酶、纤维素酶和葡聚糖酶等都有类似现象。

考虑到饲料用木聚糖酶的实际情况，我们选定10.0 U/g作为其检测限量。事实上，目前流通的绝大多数饲料用木聚糖酶(包括含木聚糖酶的复合酶)的活力很少低于20.0 U/g，选用10.0 U/g作为检测限量已经覆盖了99%以上的流通产品。

1.8 酶样的稀释度对酶活力测定的影响(见表2)

酶分子的浓度对测定结果也有重要影响，表2是关于硫色曲霉固态发酵制品中的木聚糖酶活力测定值(Sigma X0627为底物)与稀释倍数的关系。

确定酶样的稀释度实质上是选择酶分子的数量与底物分子的数量之间的比例，二者的比例只有在一定的范围内，酶分子的活力才能得到充分发挥。超出了这个比例范围，酶的活力发挥受到影响。所以在测定酶活力时需要做酶样的稀释梯度，梯度的间隔不能太大，最好是加倍稀释，以确定合适的线性测量范围。

1.9 底物存放时间对酶活力测定值的影响

木聚糖酶的反应底物(燕麦木聚糖Sigma X0627)是多聚物，长时间存放会使底物分解，产生较多的小分子寡聚物和单体，使测定值偏高，同时还会造成较高的本底值，影响测定精度。我们通过试验分析了10.0 mg/ml的木聚糖底物溶液在4 ℃条件下的存放时间对本底还原糖浓度的影响，结果见表3。

木聚糖是比较容易降解的多糖。在4 ℃冰箱存放2 d，降解产生的还原糖达到0.142 mg/ml，这个本底值对酶活力测定结果有很大影响。建议底物配制后的存放时间不超过12 h，最好现配现用。

1.10 关于样品处理的一些细节问题

目前在测定分析中主要存在的操作细节问题有：样品在缓冲液中合适的存放时间和酶液如果采用过滤获得清液是否可行。

根据我们的研究，一般情况下，样品中的酶蛋白在磁力搅拌30 min的条件下已经充分溶解到缓冲液中了，没必要再进一步存放浸泡。但是如果遇到一些包裹很致密的颗粒，需要一定时间的浸泡才能使酶蛋白充分释放。考虑到生产企业的实际可操作性和分析结果的可靠性，我们建议在冰箱中再存放1～2 h。从目前我们获得的试验数据分析，浸泡2 h已经足够，目前还没有遇到例外。

样品酶液都采用低速离心(3 000 g以下)获得清液，如果采用过滤，酶蛋白容易被过滤介质吸附，从而造成酶活力损失。酶蛋白的分子量越大，截流损失越多。试验发现，纤维素酶的截留损失在 10%~15%，木聚糖酶的活力损失小一些，不超过10%，考虑到离心比较方便，不会对生产企业带来多大设备投资，所以，建议采用低速离心获得上清酶液。

1.11 验证对比

对于饲料用木聚糖酶活力的分析测定，笔者建议以Sigma X0627为标准底物，反应液中底物的浓度为5 mg/ml，配制的木聚糖底物溶液的存放时间不超过12 h(4 ℃存放)，反应体系的pH值为5.5，反应温度为37 ℃，反应体系的缓冲液(HAc-NaAc体系)盐浓度为0.1 mol/l，反应时间为30 min。

以上述方法为基准，试验测定分析了近300 个含有木聚糖酶的样品，现列举12个比较有代表性分析结果(见表4，保留4位有效数字)，相对误差均不超过6.0%。

2 结论

综合上述分析结果，除了pH值和温度以外，底物的性质和浓度、酶分子浓度、反应时间、溶液的离子强度和体系的运动状态都能影响酶的测定活力。由于这些影响因素的存在，使得酶活力的测定分析变得纷繁复杂，同一种酶在不同的条件下分析获得的结果存在很大偏差。

为了测定的统一，同时使结果有较好的可比性，建议固定反应体系(即固定反应温度、pH值、反应时间、底物浓度和要求的产物浓度范围)。样品酶做不同的稀释度，只有在规定条件下产生所要求的产物浓度范围的稀释酶液才是有效的作用酶液，然后，以此为依据计算酶活力。这种方法虽然比较繁琐，但是它排除了许多干扰，有较好的可比性。

参考文献

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陆文清，中国农业大学农业部饲料工业中心，副研究员，100193，北京海淀区圆明园西路2号。

何丽花、曹云鹤，单位及通讯地址同第一作者。