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现代动物生物化学
第一讲 蛋白质化学
一、 蛋白质的一级结构
（一）、蛋白质的构件分子
20种氨基酸都属于α-氨基酸，按侧链的极性和有无电荷分为非极性侧连氨基酸、不带电荷的极性侧连氨基酸、带电荷的极性侧连氨基酸。含特异遗传密码，也称编码氨基酸。
非编码氨基酸是在蛋白质合成后或合成过程中由相应的氨基酸残基经修饰而成的。
（二）、肽键与肽链
蛋白质是由构件分子氨基酸通过肽键连接而成的多聚生物大分子多肽。
肽键 —CO—NH— （酰胺键）
水解肽键的酶有内肽酶和外肽酶两类，内肽酶对氨基酸的种类有选择性；而外肽酶对氨基酸的种类无选择性。
10个以下的肽称寡肽，10个以上的肽称多肽。一条多肽链有一个C末端和一个N末端。
二硫键是蛋白质结构中常见的一种共价键。
多肽与蛋白质的区分通常以50-100个氨基酸为界，但并非绝对。
（三）、蛋白质一级结构的内容——测定方法与原理
蛋白质一级结构的测定是蛋白质高级结构和酶活性部位研究的前提。
一级结构测定的基本战略是用两套断链方法分别将纯化的蛋白质肽链裂解成肽段，再将各个肽段分离纯化，并测定每个肽段的顺序，然后比较两套肽段氨基酸顺序以排定蛋白质一级结构。
一级结构测定前的准备
1）蛋白质的纯化 纯度必须达到98%以上。
蛋白质常用的纯化方法有SDS-PAGE，高效液相层析（HPLC）。纯度的鉴定常用电泳和层析法
2）、蛋白质分子量的测定
常用凝胶过滤、SDS-PAGE、超速离心、毛细管电泳、质谱等。
3）、蛋白质多肽链数目和大小的测定
用还原性SDS-PAGE分析，若分子量变小，则说明此蛋白质由2条以上多肽链组成，然后将每条多肽链分离出来，分别测定其一级结构。
4）、封闭自由巯基
游离的巯基必须封闭，否则在纯化肽段时易氧化为多种产物。常用碘代乙酸烷化法。
5）、去除N末端封闭的基团
N-末端有时会被封闭，应用相应的方法除去N-末端封闭基团。
氨基酸组成的测定
1）、蛋白质的水解
将蛋白质水解成游离的氨基酸，水解的方法有酸水解、碱水解和酶水解。常用的是酶水解。
酸水解色氨酸全部破坏，应添加巯基乙醇作保护剂。
2）、氨基酸的组成
经典的氨基酸组成分析法是茚三酮法。用自动氨基酸分析仪经离子交换层析相继分离，各种氨基酸与茚三酮反应形成紫色化合物，然后在570nm及440nm波长测定光吸收，计算出氨基酸的含量。
3．链的拆离与纯化
由几条肽链组成的蛋白质，须将不同的蛋白质肽链拆开，并分离纯化。
1）、二硫键的拆开
氧化法：过甲酸
还原法：巯基乙醇、巯基乙酸等
2）、共价键的拆开
I）、改变pH值：蛋白质解离的临界pH值为3-4、9-10。
II）、强变性剂：尿素和盐酸胍与巯基乙醇共用。
3）、肽链的分离纯化
4．末端氨基酸的测定
测定末端氨基酸可确定蛋白质分子中多肽链的数目。
1）、N-末端的测定
常用2、4-二硝基氟苯（DNFB）法、二甲基氨基萘磺酰氯（DNS-Cl）法、异硫氰酸苯酯（PTH）法等。
2）、C-末端的测定
常用的方法有：肼解法、羧肽酶法、还原氨基醇法等。
5．肽链的专一性裂解与肽段的分离纯化
1）、肽链的专一性裂解
化学裂解法：专一性化学试剂：溴化氰裂解法；酸水解；碱水解
酶水解法：胰蛋白酶，胰凝乳蛋白酶，胃蛋白酶等，每一种酶都有一个专一的切点。
2）肽段的分离纯化
可用层析和电泳的方法分离提纯。
6．肽段氨基酸排列顺序的测定
常用化学法：Edman降解法；蛋白质序列测定仪可自动检测氨基酸的性质、含量和氨基酸序列。
7．蛋白质一级结构的建立
氨基酸排列顺序测定出来以后，将小肽段重新构成大肽段或蛋白质的一级结构。
肽段重叠：将断裂的许多肽段的氨基酸按顺序排列，最后用重叠的方法确定整个多肽或蛋白质的氨基酸排列顺序。
原则：将一段一段小肽按一定顺序排列，将各个样品中相同的氨基酸残基位置对准重叠排列。
二硫键位置的确定：将完整的蛋白质分子不经任何处理，直接用酶或酸水解，用凝胶过滤或离子交换层析等方法及二硫键鉴定的显色反应，分离检出其中含有二硫键的肽段，将肽的二硫键拆开，分别测定两个肽段的顺序，将两个肽的结构与已测定的蛋白质一级结构进行比较，找出相应的二硫键位置。
A-1 AF
A-2 AFGR
B-1 GRLY
B-2 LYKW
A-3 KW
B-3 WHS
A-4 HS
AFGRLYKWHS
二、蛋白质一级结构与功能的关系
同源蛋白质一级结构差异与分子进化
同源蛋白质：在不同生物种属中执行同一功能的蛋白质。
不同生物体的同源蛋白质一级结构在氨基酸组成和顺序上不同，存在种属差异。同源蛋白质一级结构的差异可反映种属间的亲缘关系，但不影响其生物学功能。
1．胰岛素
不同种属哺乳动物胰岛素的功能相同，但其一级结构不同。胰岛素由A、B两条链组成，不同种属动物A链第8、9、10三个氨基酸残基和B链C-末端第30个氨基酸残基有差别，这4个氨基酸残基对胰岛素的生物活性不起决定性作用。胰岛素结构中有20个氨基酸保持不变，是胰岛素生物活性所必需的。
2．细胞色素C
带有一个血红素辅基的一条多肽链。不同动物细胞色素C氨基酸除了不变的残基外，还有相当一部分是不同的，不同动物间差异有所不同，有些差异很小，有些差异很大。
在细胞色素C不变的氨基酸残基中，有些位置的残基对所有生物都是不变的，这些残基称保守残基。
3．肌红蛋白
由一个血红素辅基和一条153个氨基酸残基的多肽链组成。不同动物肌红蛋白的氨基酸组成和排列顺序相似，但不同。
4．血红蛋白
由珠蛋白和亚铁血红素组成。不同动物血红蛋白α-链和β-链结构不同，但有些有高度的相似性，如人与抹香鲸。
5．α-乳清蛋白和溶菌酶
α-乳清蛋白由123个氨基酸组成，溶菌酶由129个氨基酸组成，两者多肽链的数目、氨基酸数目、链内二硫键的位置和数目相似，为同源蛋白质，但两者的功能不同。
（二）蛋白质一级结构差异与分子病
同种生物来源的一种蛋白质，有时存在两种或两种以上形式，它们的氨基酸序列差异很细微，通常只有一二个氨基酸残基的差别。这种细微的差别在某些情况下可引起功能的明显变化，有时甚至引发疾病，如分子病。
分子病是由构成生物体基本物质分子一级结构发生变异而引起的疾病，这种变异来源于基因的突变。
基因突变的类型：
误义突变：由于碱基突变使某一氨基酸的密码子变成另一氨基酸的密码子。
无义突变：基因中某一氨基酸密码子变为终止密码子，使多肽链合成提前终止。
移码突变：基因中碱基缺失或插入，造成这一位置以后一系列或部分编码发生移位错误。
血红蛋白基因突变可导致血红蛋白一级结构改变而产生异常血红蛋白，引起血红蛋白病。如镰刀状贫血病，β-链N-末端第6位谷氨酸被缬氨酸取代，使红细胞的形状变成镰刀型而引起溶血。
（三）活性肽一级结构与功能
活性肽是一类分子量小于6000，构象松散，具有多种生物功能的小肽，其主要功能是传递信息，调节代谢和协调器官功能。
包括多肽激素、组织激肽、神经肽等，其一级结构的改变可使活性升高、降低或消失。
根据这一特点，可对其结构进行改造或人工合成。
三、蛋白质分子构象
蛋白质分子构象又称高级结构或空间结构指蛋白质分子中所有原子在三维空间的分布。
为研究方便将蛋白的结构划分为不同的层次，分为一级结构和空间结构，空间结构又分为二级结构、超二级结构、结构域、三级结构和四级结构。
主链构象
1．α-螺旋
（1）多肽链以α-碳原子为转折点，以肽链平面为单位，通过两侧结合键的旋转，形成稳定的右手螺旋；
（2）每圈螺旋有3.6个氨基酸残基，螺距为0.54nm，每个氨基酸残基围绕螺旋中心轴旋转100o，上升0.15nm；
（3）相邻两个螺旋之间形成链内氢键，其方向与螺旋轴平行，氢键由第1个氨基酸残基N原子上的H与其后第4个氨基酸残基羰基的O原子之间形成。
（4）各氨基酸残基测链R基团均伸向螺旋外侧；
（5）α-螺旋有左手和右手两种，天然蛋白质绝大多数为右手螺旋。
2．β-折叠
存在于大量丝蛋白和β-角蛋白中。
有两条或多条伸展的肽链借助链间氢键形成的折叠片层结构，氢键与链垂直，-碳原子处于折叠角上，侧链交替出现在片层结构的上下方，并与片层垂直。
有顺式平行、反式平行或顺反平行交替。
3．β-转角
多肽链180o回折形成的特殊结构，由4个氨基酸残基组成，第1和第4之间形成氢键。
4．发夹结构
伸展的多肽链弯曲、彼此靠近并呈反向平行的发夹状结构。
5．Ω环
由6-16个氨基酸残基卷曲形成的Ω型结构。
6．无规则卷曲
主链形成没有规则的卷曲。
7．三股螺旋
由三条左手螺旋的多肽链相互缠绕形成右手三股螺旋。
侧链构象
1. 疏水区
多肽链中具有非极性侧链的氨基酸，其侧链有疏水趋势，当许多这类非极性侧链聚集在蛋白质分子内部时变形成疏水区。
许多球蛋白分子中都存在这种疏水区，与蛋白质的功能有关，如与配基的结合。
2．亲水区
氨基酸的极性侧链趋向于分布在球蛋白分子的表面，形成一个亲水区，有助于稳定球蛋白的构象并增加蛋白质的水溶性。与蛋白质的功能有关，如酶的活性中心。
二级结构
指多肽链主链骨架全部或部分按一定规律排列形成的空间结构，不涉及侧链构象，如α-螺旋、β-折叠、β-转角等。
二级结构的类型主要是α-螺旋，其次是β-折叠，在不同的蛋白质中这两种结构所占的比例不同，多数蛋白质具有α-螺旋、β-折叠的混合结构。
超二级结构和结构域
1．超二级结构
蛋白中存在由若干相邻的二级结构单元按一定规律组合在一起，形成在空间上可彼此区别的结构单位，称超二级结构。主要涉及α-螺旋和β-折叠在空间的组合、排布。
（1）αα：由两股或三股右手α-螺旋缠绕形成的一种紧密的左手超螺旋。
（2）β×β：由两段平行的β-折叠链借助一段连接链组成，连接链可以是无规则卷曲或α-螺旋。最常见的组合包含3段平行β-折叠和2段α-螺旋。
（3）βββ：由反向平行的β-折叠组成的超二级结构，主要包括β-迂回和回型拓扑结构。β-迂回中的β-折叠链通过紧凑的β-转角连接，回型拓扑结构中的β-折叠是通过一般的肽链越过反平行β-折叠形成的圆筒结构相连。
2．结构域
在蛋白质结构中，一条多肽链上常存在一些紧密的、相对独立的区域，称结构域。
结构域是蛋白质结构的功能单位和折叠单位，是在二级结构和超二级结构基础上形成的特定区域，参与蛋白质结构的装配，并与蛋白质的许多功能有密切关系。
蛋白种结构域的数目不等，一种蛋白质分子中的几个结构域，有的十分相似，有的完全不同。
蛋白质中结构域之间的连接不尽相同，彼此独立的球状结构域之间可借柔性肽链松散连接，有些结构域之间接触紧密而又广泛，每个结构域所具有的表面就是肽链构象外表面的一部分。
结构域的类型：
（1）α-螺旋域：主要是α-螺旋，由4个接近等长的α-螺旋依次与其邻近的螺旋相连形成的近四方体结构。
（2）β-折叠域：由反平行的β-折叠构成。常见的是由回型拓扑结构形成的圆筒构象。
（3）α+β域：由α-螺旋和β-折叠不规则堆积形成的。
（4）α/β域：α-螺旋和β-折叠和交替出现。
（5）无αβ域：结构域中不含α-螺旋和β-折叠。
结构域对蛋白质构象和功能的意义：
（1）多肽链先分别折叠成几个结构域，再进一步形成完整的构象，比直接折叠成天然构象在动力学上更合理。
（2）结构域之间通过共价键连接，可仅借助一条或少数几条柔性的肽链而连接，在结构上具有可运动性。
（3）结构域之间连接的相对灵活性有利于蛋白质空间构象的运动性，可直接或间接地参与蛋白质的多种功能，如分子识别和相互作用等。
（4）结构域是蛋白质的结构和功能单位，不同结构域有不同的功能，可完成底物结合、催化反应、亚基间的相互作用及调节活性等多种功能。
（5）结构域可作为重要折叠单位，在新生肽链形成特定空间结构的过程中起重要作用。
（五）蛋白质分子的三级结构
具有特定氨基酸序列的多肽链，在形成空间构象时，先由相邻的氨基酸残基形成一些有规则的结构单元，并由相邻的的二级结构聚集形成超二级结构，进而折叠成一些相对独立的结构域，最后构建成完整的、具有生物活性的构象，这种构象称蛋白质的三级结构。
1．球状蛋白质的结构的特征
（1）多肽链借助各种结构单元、超二级结构等折叠成紧密的球状构象，构象中的螺旋以右手α-螺旋为主，肽链转折处为β-转角，有较多的无规则卷曲连接各种结构单元。
（2）非极性侧链位于分子内部的疏水区，极性侧链位于分子表面形成亲水区。
（3）分子表面由内陷的疏水空穴，是蛋白质进行识别和结合的关键部位，参与蛋白质的多种功能。
（4）同类球蛋白具有基本相同的三级结构，不同种类球蛋白具有完全不同的三级结构。
（5）球蛋白分子结构既具有专一性，又具有灵活性， 二者的高度协调统一是球蛋白功能的多样性和复杂性的结构基础。
2．肽的构象
分子量较大的多肽构象与蛋白质接近，由于主链和侧链相互作用和制约较少，其构象不如蛋白质稳定，具有很大的灵活性，有助于其参与体内多种功能的调节。
（六）蛋白质分子的四级结构
亚基：分子量较大的球蛋白分子由两条或多条多肽链通过非共价键连接形成，其中每条肽链都有独立的三级结构，称为亚基。
四级结构：各亚基间相互作用并组装成有生物活性的特定构象称四级结构。
单体：蛋白质聚合物中的一个蛋白分子。
亚基必须通过非共价键组装成完整的具有四级结构的蛋白质才具有生物活性，寡聚蛋白可由相同或不同的亚基组装，如不同亚基组装的蛋白质分子可出现多种亚基结合形式，如乳酸脱氢酶。
四、蛋白质构象与功能的关系
一）、分子识别
是指蛋白质与蛋白质、核酸、脂等分子之间特异的辨认。对机体完成许多过程至关重要，如抗原—抗体、酶—底物的特异结合、基因表达调控等。
蛋白质分子识别的机制
以往的概念认为，抗原—抗体、酶—底物、激素—受体等蛋白复合物的形成中是相互作用的两个分子之间整个互补界面的相互作用，涉及整体空间构象的识别与契合。
近年来的研究认为，结合的两个分子之间的相互作用来自少数几个关键基团之间的次级键，用含有这几个关键基团的线形肽可模拟相应完整蛋白质的作用。这表明蛋白质生物大分子之间的相互作用可能主要局限在几个关键基团的相互作用。通过研究小肽片段的特异性相互作用，可能会揭示蛋白质分子识别乃至复杂的超分子体系的自我组装等问题，并为小肽分子药物和疫苗的设计提供依据。
小肽片段与生物大分子之间的识别，并不意味着含有这种小肽片段的蛋白质就可以与相应的大分子结合，只有具有一定构象的小肽序列才可与大分子结合。提示在蛋白质分子识别和相互作用过程中，识别区域的构象也起着关键作用。
2．蛋白质与核酸的识别
1）、调控蛋白的结构域
蛋白质与核酸的识别和相互作用是基因表达的关键环节。真核生物转录调控蛋白与DNA识别和结合的模式有多种类型，主要决定于调控蛋白的 DNA结合结构域的不同。
I、螺旋—转折—螺旋
两段螺旋被一段β-转角分开，其中一段辨认螺旋，直接与暴露在DNA大沟中的碱基对接触结合。辨认和结合的作用力包括氢键、离子键、范德华力。这种结构主要以二聚体形式与DNA结合。
在真核细胞的转录调控蛋白中幼儿还存在同源（异型）结构域，主要以单体形式通过螺旋—转角—螺旋与DNA进行多位点结合，以保证识别的特异性。
II、锌指结构
一个Zn++与4个Cys或2个Cys、2个His靠配位键结合，有一个疏水核心和极性表面，并有象手指一样伸出的肽段，其数目为一个或多个。
锌簇结构：存在于真菌转录因子中，在其DNA结合区有60个左右的氨基酸残基，由6个Cys与2个Zn++形成锌簇的核心。
锌扭结构：存在于高等动物细胞内类固醇激素受体家族、受体蛋白与DNA相结合的区域，该区域约含150个氨基酸残基，直接与DNA结合的有40-60个氨基酸残基，其中有8个Cys与2个Zn++通过配位键形成2个四面体结构，有15个残基将2个Zn++隔开，形成扭形的DNA结合位点。
III、亮氨酸拉链
是α-螺旋中一段富含有规律出现的亮氨酸残基的片段，能形成2个α-螺旋，即螺旋的一侧是以带电荷的氨基酸残基为主，具有亲水性；另一侧是排列成行的亮氨酸，具有疏水性，称亮氨酸拉链。
具有亮氨酸拉链的蛋白质都以二聚体的形式与DNA结合。
IV、螺旋—环—螺旋
2个α-螺旋的中间被一段非螺旋的环分隔。与DNA结合性质与亮氨酸拉链相似，易形成二聚体。α-螺旋氨基端有碱性区，是结合DNA所必须是，螺旋区是形成二聚体所必须的。
2）、蛋白质与DNA识别机制
与DNA结合并调节基因转录的蛋白因子主要包括转录因子和转录调控因子。
蛋白因子与DNA识别的机制目前尚不完全清楚，但已获得某些特点与规律：（1）、蛋白因子以二聚体的形式结合特异的DNA序列，异源二聚体的亲和力大于同源二聚体。
（2）、蛋白因子的识别结构域与DNA的大沟或小沟识别位点结合。其中一个螺旋为专一性结合，另一个螺旋为非特异性结合。
（3）、识别螺旋有几圈，其氨基酸残基分为与DNA接触的残基、与DNA主链磷酸基团接触的残基和与蛋白其他部分接触的残基。这些特定残基决定螺旋在DNA大沟内的倾斜状态，对识别有重要作用。
（4）、DNA上的结合有几个碱基对。蛋白质可诱导DNA构象发生变化有助于结合。
（5）、蛋白质—DNA间的相互作用主要为极性作用，同时也有疏水作用，识别的特异性主要来自氨基酸与碱基间的化学接触。
（二）蛋白质的折叠
1．新生肽链折叠的特点
根据烟草花叶病毒外壳蛋白与核糖核酸在体外生理条件下能自组装成感染活性的病毒这一现象，人们曾认为新生肽链在细胞内可在一级结构的基础上，自动地折叠成天然构象，不需要其他分子或能量的支持，但近年来的研究发现了两种帮助蛋白折叠的辅助蛋白和酶，因而现在的观点认为：细胞内新生肽链的折叠是需要帮助的。
I、折叠启动：有三种假说
疏水塌缩启动折叠：肽链中的疏水作用力可导致肽段中形成疏水簇，再进入折叠中间状态。
二级结构生成启动折叠：小肽在水溶液中可形成稳定的二级结构，在蛋白质中可作为折叠的起始点。
特殊作用力启动折叠：对蛋白质空间结构稳定有重要作用的化学键的形成可启动蛋白质折叠。
II、中间状态
目前已发现多种折叠中间状态，如与二硫键有关的中间态、脯氨基顺反异构中间态及熔球态等。其中熔球态是蛋白质折叠中最主要的一类折叠中间态。
III、折叠途径
有人认为是能量优化的单一折叠途径；有人认为是涉及复杂动力学过程的多折叠途径。
2．分子伴侣
是一类相互之间没有关系的蛋白质，其功能是帮助含多肽链的其他结构组分在体内以非共价键组装，且不存在于组装后发挥功能的结构中。
目前已确认的分子伴侣分为三个蛋白家族：伴侣素60家族、应激蛋白70家族和应激蛋白90家族。
分子伴侣与新生肽链识别、结合及解离以完成新生肽链折叠的机制目前尚不清楚。
3．帮助新生肽链折叠的酶
目前已确定的有两种：蛋白质二硫键异构酶（PDI）、肽酰脯氨酸顺反异构酶（PPI）。
4．蛋白质折叠在跨膜转运中的作用
蛋白质合成之后需要运送到细胞的各部分，这一过程需要经历跨膜转运。在转运之前蛋白质必须处于解折叠状态，转运之后在进行折叠。这种解折叠与再折叠过程中可有分子伴侣参与。
5．蛋白质的折叠模式
许多问题尚不清楚，如一级结构同源，空间构象存在相似性；一级结构不同源，空间构象存在相似性（功能相似或功能不相似）。
6．蛋白质折叠家族
根据蛋白质氨基酸顺序和功能的相似性，把某些蛋白质划分为家族。一个蛋白家族一般属于同源蛋白质，在进化上有一定联系，在空间结构上有相似的折叠方式。
（三）蛋白质空间结构的测定和预测
蛋白质空间结构的测定是研究蛋白质功能的基础和关键，也是当前结构生物学研究的重要内容之一。
蛋白质空间结构测定方法：晶体蛋白——X射线晶体衍射技术
溶液蛋白——核磁共振结构分析技术
此外还有质普法、中子衍射技术等。
蛋白质构象的预测是根据分子构象理论及已知空间结构蛋白质表现出的一些构象规律，用概率统计方法来预测大量已知一级结构蛋白质的构象，可为设计具有特定空间构象的蛋白质提供理论依据，目前主要集中在对二级结构的预测。
利用定点突变等分子生物学技术，改变组成蛋白质分子的某个氨基酸残基，对现有蛋白质加以定向改造，是蛋白质工程的主要研究内容。这一工作是建立在对蛋白质构象预测基础上的。如果能预测出产生某种特定新功能的蛋白质构象应具有的氨基酸序列，可减少蛋白质工程的盲目性。
蛋白质工程最引人注目的是从头设计和构建新的蛋白质分子，创造自然界中不存在的优良蛋白质。
（四）蛋白质的变性
1．变性的定义
蛋白质变性是指蛋白质分子受到某些理化因素作用后，天然构象发生改变，生物活性丧失、某些理化性质发生改变的过程。
物理性质：溶解度下降、沉淀、粘度增加、紫外和荧光光谱发生改变。
化学性质：易被蛋白酶水解，可与多种试剂发生反应。
2．变形因素与作用机制
理化因素，不同因素引起的变性机制不同。
热变性：温度升高使分子内振动增强，破坏了维持空间构象稳定的次级键及某些二硫键。
超声波：直接破坏某些次级键。
酸、碱：使蛋白质所带的电荷发生改变，离子键断裂，从而导致构象松散。
尿素、盐酸胍：是常用的蛋白质变性剂，可能是破坏了蛋白质分子中的氢键和分子内的疏水力。
表面活性剂（如SDS、Triton X-100）：表面所带的负电荷改变了蛋白质的电荷分布，使分子构象发生改变。
有机溶剂：改变蛋白质分子中的静电引力、氢键和疏水作用力，使构象发生改变。
3．变性过程
包括寡聚蛋白分子解离成亚基，肽链从紧密的三级结构转变为松散状态，再从有序的二级结构变成无规则的线团。
但酶在变性时活性丧失在先，分子整体构象变化在后，这表明活性部位先发生构象变化。
4．可逆变性与不可逆变性
变性的蛋白质由于一级结构并未受到破坏，在除去变性因素后，有些蛋白质在适当条件下可由变性状态恢复为天然构象并表现出生物活性，这种变性称为可逆变性。不能恢复的称为不可逆变性。
SDS、巯基乙醇、尿素引起的变性属于可逆变性，大多数变性是不可逆的。
表明变性蛋白质的体外重折叠与细胞内蛋白质的折叠有相当大的差别，变性的蛋白质无法重新折叠成天然构象。
5．复性
没有活性的变性蛋白质在适当条件下重新折叠成有活性的天然构象的过程称为复性。复性的实质是多肽链在体外的重新折叠。
重新折叠的机制目前仍不清楚，有些蛋白质可在几秒钟内在体外重新折叠而恢复天然构象、生物活性；有些蛋白质的复性需要较长的时间，而大多数蛋白质无法复性。
蛋白质的无法复性可能是由于在体外的重新折叠导致了错误的折叠。
（五）蛋白质的变构
蛋白质在发挥功能时由于分子内的相互作用导致蛋白质分子构象发生改变。
变构蛋白都属于寡聚蛋白，除血红蛋白和变构酶外还包括细胞膜上的某些蛋白质及基因调控蛋白等，具有许多重要功能。
血红蛋白的变构效应：血红蛋白与肌红蛋白结合氧的特性不同，以氧分压为横坐标，氧饱和度为纵坐标，可得到两种蛋白的氧结合曲线。血红蛋白为S型曲线，肌红蛋白为双曲线。
血红蛋白的S型氧合曲线反映了它与氧结合的特点。血红蛋白分子由于4个亚基间的相互作用，四聚体与氧刚开始结合时亲和力远低于肌红蛋白，分子中的α亚基对氧的亲和力比β亚基大，能首先与第一个氧分子结合，导致α亚基的构象发生变化，并进而使相临的β亚基构象也发生变化，从而增加β亚基对氧的亲和力。当血红蛋白结合上第一个氧分子后，它与氧的结合能力由于变构作用而逐渐增加，呈现S型曲线。
肌红蛋白由于只有一条多肽链，与氧的亲和力较大，在很低的氧分压下即接近饱和。
波尔效应：增加CO2的压力或H+的浓度都能降低血红蛋白对氧的亲和力，使血红蛋白的氧结合曲线右移，促进氧的释放；而高浓度的氧可促使血红蛋白分子释放H+和CO2，这种现象称为波尔效应。
五、蛋白质的分离纯化与鉴定
（一）蛋白质分离纯化的一般程序
分离纯化的一般步骤：
1．选择一种目的蛋白含量丰富，稳定性好的样品材料。
2．将蛋白质从样品中抽提出来。
3．确定分离纯化的方法，使粗品的纯度达到预定要求。
4．建立灵敏、特异、精确的检测手段，分步测定蛋白质的含量，检验蛋白质的纯度。
5．在操作分析过程中注意保护蛋白质的稳定性，防止变性。
（二）前处理
1、生物样品的选择与处理
生物样品选择的原则是：有效成分含量丰富、稳定性好、来源丰富、保持新鲜、实验条件恒定、取材工艺简单、有综合利用价值等。
选择好样品后应及时使用或在-20℃以下冰箱保存。
2．细胞破碎
I、机械破碎法
II、物理学方法：超声波、挤压、反复冻溶等
III、化学法：有机溶剂或表面活性剂
IV、酶学法：用适当的酶破坏细胞壁
3．抽提
用适当的溶剂和方法，使有效成分充分溶解到溶剂中的过程。抽提液具备的条件：对有效成分溶解度大、破坏性小、对杂质不溶解或溶解度很小、来源广泛、价格低廉、操作安全。
抽提过程中应注意的因素：
1）、溶剂的pH值：应偏离蛋白质的等电点，但不宜过高或过低。
2）、溶剂的离子强度：用离子强度较低的中性盐溶液，盐浓度在0.02-0.5mol/ml范围内。与脂质结合牢固的蛋白质用有机溶剂抽提。
3）、温度：抽提温度不宜高，应控制在0-10℃。
4）、抽提液的体积：抽提液一般为抽提物的3-5倍。
5）、添加保护剂：加巯基乙醇或EDTA保护巯基形成二硫键或与金属离子结合。
（三）蛋白质的分离纯化方法
1．利用溶解度不同的分离纯化方法
I、盐析法
在稀盐溶液中蛋白质的溶解度随盐浓度的增加而升高，这种现象称为盐溶。而当盐浓度增加到一定量时其溶解度逐渐下降，直到某一浓度时从溶液中析出，称为盐析。
用于盐析的中性盐常用硫酸铵，不同蛋白质盐析时所需的盐浓度不同，调节盐的浓度可适当地将蛋白质分离。对含有多种蛋白质的混合液可采用分段盐析的方法分离纯化。
II、等电点沉淀法
III、有机溶剂沉淀法：（1）降低水的介电常数，使蛋白质分子中带相反电荷的基团吸引力增大、凝集。（2）与蛋白质争夺水膜，使蛋白质凝集并沉淀析出。（3）破坏氢键，引起构象改变。
IV、聚乙二醇沉淀法：其分子量在400-6000之间。
2．利用分子大小和形状不同的分离纯化方法
I、透析和超滤
II、密度梯度离心
蛋白质颗粒在具有密度梯度的介质中离心时，可根据其分子量和密度的不同进行分离，每种蛋白质颗粒沉降到与自身密度相等的介质梯度时，即停止不前，最后各种蛋白质在离心管中被 分离成各自独立的区带。
常用的梯度介质为蔗糖。
III、凝胶过滤
3．利用电离性质不同的分离纯化方法
I、离子交换层析
II、聚焦层析
III、制备电泳：电泳后使分离区带从聚丙烯酰胺凝胶管下端流出，用洗脱液洗脱到部分收集器中。
4．利用吸附能力不同的分离纯化方法：吸附层析
5．利用生物功能专一性的纯化方法：亲合层析
（四）蛋白质的纯度鉴定
1．电泳法
醋酸纤维素薄膜
琼脂糖凝胶电泳
聚丙烯酰胺凝胶电泳
SDS-PAGE
梯度PAGE
等电聚焦电泳
双相PAGE
印迹转移电泳：通过凝胶电泳分离的蛋白质再次经过电泳转移到固相载体表面，然后进行染色分析电泳带。常用的载体为硝酸纤维薄膜，醋酸纤维薄膜等。常用于检测DNA、RNA、蛋白质等之间的相互作用。
毛细管电泳：快速、分辨率高、样品用量少。
2．免疫法
免疫扩散、免疫电泳、酶联免疫吸附、免疫印迹
3．分光光度法
4．超速离心
5．高效液相层析
第二讲 酶学
一、酶的催化机理
（一）酶的化学结构与活性中心
1、酶分子的结构特征
酶的化学本质是蛋白质，其一级结构和空间结构与蛋白质的相同。除少数单体酶外，大多数酶是由多个亚基组成的寡聚体。多数情况下每个亚基有一个活性部位，有些酶的活性部位是由一个以上亚基组成的，对于多功能酶来讲不同的亚基有不同的功能。
酶分子中除活性中心外，还有其他的功能部位，如抑制剂、激活剂、别构效应剂结合部位，亚基相互识别、相互结合部位等。
2、酶的活性中心与必需基团
酶分子上和酶活性有直接关系的特异氨基酸残基，集中在酶分子的一个特定区域，即为酶的活性中心或活性部位。
酶分子活性中心的化学基团，实际上是某些氨基酸残基的侧链或肽链末端氨基或羧基，它们的一级结构距离较远，但空间结构相对集中。
活性中心内的化学基团是酶发挥催化作用及与底物直接接触的基团，称为活性中心内的必需基团。活性中心外的一些基团，虽不直接参与催化作用，但对维持整个酶分子空间构象及酶的活性是必需的，称为活性中心外的必需基团。
活性中心内的必需基团又分为催化基团和底物结合基团。
催化基团和结合基团是相互联系的整体，催化效率的高低很大程度上取决于底物结合的位置是否合适，只有结合基团正确地结合底物，提供催化基团发挥作用的最优构象，才能有效发挥催化作用。
3、酶活性中心的结构
同一酶或功能相近的酶，其活性中心附近的氨基酸序列具有惊人的相似性，而序列的差异常发生在远离活性中心的地方。不同的酶，其活性中心虽有某些共同的氨基酸残基，但它们邻近的氨基酸残基序列却很少相同。
酶活性中心出现频率最高的氨基酸是Ser、His、Cys、Tyr、Asp、Glu、Lys。
活性中心的氨基酸残基在结构上都具有一些特殊的侧链基团，如巯基酶类的-SH、丝氨基酶类的-OH、组氨基酶类的咪唑基。
酶活性中心有一个疏水的三维环境，具有一定的柔性，在底物诱导下可发生构象的改变，以适宜结合底物的状态。
辅助因子对酶活性中心的构象和酶的催化性质都有重要影响作用。
酶活性中心研究的方法有：化学修饰法、亲和标记、动力学分析法、X-射线衍射分析法、基因定位诱变法。
（二）酶降低反应活化能的机理
1．活化能与过度态
对任何活化反应，反应物分子或底物分子在转变成产物之前都必需获得一定的能量成为活化态或过度态。反应物转变为产物的关键步骤是原来的化学键断裂和新化学键的形成，而过度态正是这种转变的中途点。初始反应处于基态能阶，产物处于另一基态能阶，过度态与反应物的能阶之差称为活化能。
初始反应物要发生反应，必须具有高于或等于活化能的能阶水平才有可能进入过度态，因此要使一个化学反应速度加快，一是增加反应物转化为产物的机率，二是降低反应的活化能水平。
催化剂降低反应活化能的效应是通过改变反应途径来实现的，使反应沿着低活化能的途径进行，即使反应途径分成若干步进行，而各步的活化能都不太大，总的活化能水平较低。
2．酶—底物复合物的生成与酶催化
酶作为生物催化剂之所以能发挥高效的催化性，在于酶和底物反应过程中形成了特殊的酶—底物复合物，此过度态的复合物很不稳定，可即刻转变成相应的产物，使反应的总活化能降低。
3．降低活化能的因素
过度态中间复合物的形成，导致活化能的降低是酶催化反应的关键。
（1）、酶的邻近效应和定向效应
邻近效应：是指酶由于具有与底物有较高的亲和力，从而使游离的底物集中于酶分子表面的活化中心区域，使活性中心的底物有效浓度得以极大的提高，并同时使反应基团之间相互靠近，增加亲核攻击的机会，从而提高反应速度。
定向效应：指底物的反应基团和催化基团之间或底物的反应基团之间正确地取向
产生的效应。
反应基团的正确取向和定位增加底物的激活，从而加快反应。
对酶催化来说，邻近和定向效应是共同产生催化效应的。
（2）、底物分子形变或扭曲
酶受底物诱变发生构象改变，活性中心的基团发生位移或改向，但同时酶活性中心的基团可引起底物形变，削弱有关的化学键，使底物由基态转变为过度态，有利于反应进行。
（3）、酸碱催化
酶由于活性中心存在酸性或碱性氨基酸，可作为酸碱催化剂，即可作为催化性质的质子受体或供体，有效地进行酸碱催化。
（4）、共价催化
酶活性中心存在亲核基团和亲电子基团，可对底物进行亲核和亲电子反应，形成不稳定的共价中间复合物，降低反应活化能，加速反应进行。
（5）、活性中心的低介电性
酶活性中心是一个疏水的非极性环境，其催化基团被低介电环境所包围，催化反应在低介电常数介质中的反应速度比高介电常数介质中的快得多。
二、酶促反应动力学
（一）底物反应动力学
在酶促反应中，尽管酶必须参加反应，但酶不被消耗，而只起循环作用，反应速度只依赖于反应物。在其他条件不变，[E]恒定条件下，酶促反应速度与底物浓度之间呈双曲线关系。
当[S]很低时，V随[S]增加而迅速增加，V与[S]成正比；当[S]很高时，V随[S]升高而加速，但V的增加不如[S]低时那样显著；当[S]增加到一定值后，再增加底物，V不再增加，达到一恒定值。
这种双曲线关系是由于底物在转变成产物之前，必须先与酶形成中间复合物，再转变成产物并释放酶。
1931年Michaeleis和Menten在中间产物学说的基础上建立了V与[S]关系的双曲线方程，即米氏方程：v=Vm/（Km+[S]）
酶反应速度是衡量酶活性大小的指标，用单位时间内产物的增加或底物的减少来表示。
用[p]对t作图得酶促反应速度曲线。曲线的斜率即为反应速度，表示单位时间内[p]的变化。曲线上某一点的斜率即为该时刻的反应速度。
根据米氏方程，Km等于反应速度为最大反应速度一半时的底物浓度，即Km=[S]。
Km在酶学、药物代谢研究和临床工作中都有重要作用和应用价值。
（1）、鉴别酶的最适底物
Km的大小可近似地表示酶和底物的亲和力，即Km=[E][S]/[ES]。
Km值大表示酶与底物的亲和力小，反之则大。具有最小Km值的底物即为该酶的最适底物或天然底物。
（2）、判断在细胞内酶的活性是否受底物抑制
如果测得离体酶的Km远低于细胞内的底物浓度，而反应速度没有明显变化，表明该酶在细胞内常处于被底物所饱和的状态，底物浓度的微量变化不会引起反应速度有意义的变化。
（3）、催化可逆反应的酶
当正、逆反应Km值不同时，Km值小的底物所表示的反应方向为该酶催化的优势方向。
（4）、多酶催化的连锁反应，确定各酶的Km可寻找代谢过程的限速酶，在底物浓度相似时，Km值大的酶为限速酶。
（5）、由于存在Km值不同而功能相同的酶，从而发现同工酶。
（6）、测定不同抑制剂对某个酶Km及Vm的影响，可区别该抑制剂是竞争性抑制剂还是非竞争性抑制剂。
（7）、测定不同菌株天冬酰胺酶对天冬酰胺的Km值。选用Km值较小的酶，可评价和筛选药用酶。
Km和Vm的求取：
因酶促反应的米氏方程有双曲线特征，[S]对V作图不能准确获得Vm和Km，所以常用双倒数作图法将此方程转换成直线方程，有作图的直线斜率、截距求得Km和Vm值。
（二）抑制反应动力学
1．抑制作用的分类
酶分子与配体结合后常引起酶活性改变，使酶活性降低或完全丧失的配体称为抑制剂，这种效应称抑制作用。
抑制作用分为不可抑制作用和可抑制作用两大类，不可抑制作用又分为专一性抑制和非专一性抑制；可抑制作用分为竞争性抑制、非竞争性抑制、反竞争性抑制和混合性抑制。
2．不可抑制作用
抑制剂与酶分子上的必须基团共价结合，不能用透析、超滤等物理方法解除抑制，必须通过化学方法才能解除机宜作用，称不可抑制作用。抑制程度决定于抑制剂浓度及酶与抑制剂间的接触时间。
专一性抑制剂是一些具有专一化学结构并带有一个活泼基团的类底物，与酶结合时活泼的化学基团可与酶活性中心残基或辅基发生共价修饰而使酶失活。
非专一抑制剂可对酶分子上每个结构残基进行共价修饰而导致酶失活，这类抑制剂主要是一些修饰氨基酸残基的化学试剂及重金属离子等。
（1）、有机磷化合物
神经毒气和有机磷农药通过与胆碱酯酶丝氨酸的羟基结合而破坏酶的活性中心，使酶丧失活性。由于乙酰胆碱的堆积而引起神经症状。
有机磷化合物属于不可逆抑制剂，可用含C-CH=NOH的肟化物将其从酶分子上取代下来，使酶恢复活性。常用做解毒剂，如解磷啶。
（2）、有机汞、砷化和物
这些化合物能与许多巯基酶的巯基结合而使酶活性丧失，如路易士气、吡霜类等。
这类抑制剂对巯基酶的抑制作用可通过加入过量巯基化合物，如Cys、还原型谷胱甘肽、二巯基丙醇等使酶恢复活性。
巯基化合物常称为巯基酶的保护剂，被用做砷、汞等重金属中毒的解毒剂。
（3）、重金属离子
重金属盐类Ag+、Hg+、Pb+等与酶的巯基、羟基、咪唑基结合，对大多数酶活性具有强烈抑制作用。
金属离子螯合剂EDTA、Cys可解除其抑制，使酶恢复活性。
（4）、烷化剂
主要是含卤素的化合物，如碘乙酸、碘乙酰胺等，可使酶中的巯基烷化。从而使酶失活。常用做鉴定酶中巯基的特殊试剂。
（5）、氰化物
氰化物能与含铁卟啉的酶中的Fe++结合，使酶失活而阻止细胞呼吸。
（6）、自由基对酶类的作用
自由基是指能独立存在的含有一个或几个以上未配对电子的原子、原子团、分子或离子。
由于具有未配对电子，所以其性质不稳定，有变为成对电子的倾向，易发生失电子或得电子的氧化—还原反应。
生物体内最多的自由基是含氧自由基，如O2-.、OH.、O1/2.，生理条件下这些自由基不断产生，不断清除。过量自由基的产生可造成机体细胞非特异性氧化损伤，如引起DNA碱基修饰、链断裂、酶蛋白变性失活等，从而产生多种病理过程。
自由基可攻击酶活性部位的基团使酶失活；使生物膜磷脂中的不饱和脂肪酸氧化，产生氧化物，而对细胞产生毒性。
机体的抗氧化防御体系包括抗氧化酶类和非酶类抗氧化剂。抗氧化酶主要是SOD、过氧化氢酶、谷胱甘肽还原酶等，可清除细胞内产生的自由基和过氧化物。
非酶类抗氧化剂主要指VE、类胡罗卜素、抗坏血酸等，主要是清除体内产生的自由基。
3．可逆性抑制作用
抑制剂与酶非共价结合，用透析等物理方法可除去抑制剂使酶恢复活性。
（1）、竞争性抑制作用
抑制剂与底物结构相似，可竞争性地结合于酶的活性中心。酶不能同时和S和I结合。
（2）、非竞争性抑制
抑制剂与底物结构不相似，不竞争酶的活性中心，而是和活性中心以外的部位结合，使酶的活性受到抑制。酶能同时和S、I结合形成EIS复合物。
非竞争性抑制在生物体内多表现为代谢中间产物反馈调控酶的活性。
（3）、反竞争性抑制
抑制剂只能与ES结合形成无活性的EIS三元复合物，而不能与游离的酶结合。
（4）、混合性抑制作用
主要表现为非竞争性抑制的混合或非竞争性抑制与反竞争性抑制的混合。
（5）、可逆性抑制作用的应用
I、磺胺类药物与抗菌增效剂
细菌在生长时不能利用现成的叶酸，只能利用对氨基苯甲酸合成二氢叶酸，然后再转化成四氢叶酸，参与核酸合成。
磺胺类药物与对氨基苯甲酸结构相似，可竞争性地结合细菌上午二氢叶酸合成酶，抑制二氢叶酸的合成，使核酸合成受阻，从而抑制细菌生长。
抗菌增效剂与二氢叶酸结构类似，可竞争性地抑制二氢叶酸还原酶，使四氢叶酸合成受阻。
II、叶酸类似物
叶酸类似物，如氨基喋呤、氨甲喋呤可竞争性抑制二氢叶酸还原酶，阻止叶酸还原成二氢叶酸和四氢叶酸，阻断嘌呤核苷酸的合成而抑制癌细胞生长。
III、嘌呤类似物
嘌呤类似物主要是次黄嘌呤和鸟嘌呤的衍生物，可阻止次黄嘌呤核苷酸转化为AMP，干扰癌细胞核苷酸及蛋白质的合成。
IV、嘧啶类似物
与嘌呤类似物作用相似，抑制癌细胞DNA合成，如抗癌药物5-氟尿嘧啶。
V、氨基酸类似物
如重氮丝氨酸、6-重氮-5-正亮氨酸，它们的化学结构与谷氨酸相似，可与天然谷氨酸竞争结合氨基转移酶类，从而抑制嘌呤核苷酸的合成，具有抑菌作用。
三、酶活性的调节
酶作为生物催化剂的特点：催化的高效性和专一性、反应条件温和、活性的可调节性。
动物机体代谢调节的本质是通过对细胞内的酶促反应进行有效调节控制来实现的。
酶的调节有两个方面，一是对已有酶活性的调节，二是对酶的合成与降解的调节。
（一）别构调节
代谢物分子（底物、中间产物、终产物）不直接作用于酶的活性中心，而以非共价键结合活性中心以外的别构部位，通过构象的变化而改变酶的活性，这种调节称为酶的别构调节或变构调节。
此种酶称别构酶或变构酶，能使酶分子发生别构的物质称别构效应物或别构效应剂。能使酶活性增强的称别构激活剂，反之称别构抑制剂。
1．反馈调节
别构调节是通过反馈方式来实现的，如代谢终产物对原始酶的直接或间接的反馈抑制。
反馈可分为正反馈和负反馈两种。正反馈使代谢过程加快或酶活性提高，称正反馈或反馈促进；反之称负反馈或反馈抑制。
反馈调节是代谢调节中最广泛最主要的机制，反馈调节还包括代谢途径以外的任何因子对酶的特异调节。
（1）、反馈抑制的形式
单价反馈抑制：反应过程是直接进行的，不发生分支反应，如长链脂肪酸对 乙酰CoA羧化酶的反馈抑制。
B、多价反馈抑制：在分支途径中两个或两个以上的终产物共同存在时，抑制共 同途径的起始步骤的酶活性，但终产物单独存在时不表现抑制作用。
C、协同反馈抑制：几个终产物同时过量存在时可抑制其共同途径的第一步骤酶活性，当几个终产物单独过量存在时只抑制相应分支途径的酶活性。
D、顺序反馈抑制：当终产物E过量时，对EC抑制，此时中间产物C浓度增加，促进反应向G方向进行，致使另一终产物G增加，此时由于G过量对Ed酶抑制，结果C又过剩，于是对酶Ea抑制，最后使A到B反应减慢。
E、积累反馈抑制：几个终产物中任何一个过量时都能对共同途径的某一个酶产生部分抑制作用，各个抑制作用之间互不干扰，当几个终产物同时过量时它们的抑制作用是积累的。
（2）、反馈抑制的特征
是产物本身来控制产生自己的速度，是控制产物浓度最准确、最经济的方式。
2．别构酶与别构效应
别构酶是由两个以上亚基组成的寡聚体，在结构上有明确的调节部位和催化部位，两个部位可在同一个亚基上，也可分别位于不同的亚基上，彼此能相互影响产生协同效应。底物和别构剂能各自专一地与同一酶结合，别构剂结合在别构部位，结合后调节部位和催化部位发生构象改变，主要指亚基间严紧型与松弛型间的转变。
别构酶底物具有协同效应。当配体（底物与小分子效应剂）与酶蛋白结合后，影响另一配体和酶蛋白的结合，导致酶催化活性的改变。这种效应称协同效应。协同效应是多亚基别构酶的基本特征。
根据两个配体是否相同和影响是促进还是减慢协同效应分为同促和异促、正协同和负协同效应。
别构酶的动力学特征与调节：
别构酶的动力学曲线不服从米氏方程，酶反应初速度与底物浓度不是矩形双曲线，而是呈S形曲线。
别构酶的S形曲线表明，对别构酶来说酶反应速度对底物浓度的变化极为敏感。因此在细胞内当底物发生很小变化时别构酶可以极大程度地调节反应速度。
3．别构调节机理
（1）、MWC模式——能反映正协同效应
别构酶是由两个以上亚基组成的寡聚酶，各亚基占有相等的、物理位置相对称的排列。
每个亚基对一种配体只有一个结合位点。
每种亚基都以松弛型和严紧型两种构象状态存在，并保持平衡。
两种构象状态可以互变，构象转变采取同步协同方式。
构象状态转变时分子对称性不变。
多个配体结合到酶的特异结合部位上，各个配体与R型和T型结合的位点都相等。
（2）、KNF模式——正负协同效应
A、当配体不存在时别构酶只有T型一种构象状态存在，而不处于R、T的平衡状态；只有当配体与之结合后，才诱导T型向R型转变。
B、构象改变是序变方式进行的，而不是齐变。当配体与第一个亚基结合引起该亚基构象变化，并导致邻近其他亚基发生构象改变。
C、亚基间的相互作用可能是正协同效应，也可能是负协同效应。
4．别构调节的生理意义
同促效应是对底物浓度改变作出的调节效应。
同促正协同效应时酶具有S型动力学性质，对较小的底物浓度变化，酶反应能作出灵敏的应答，在代谢途径中只有关键地位的酶调节具有重要生理意义。
同促负协同效应时酶具有表观双曲线动力学性质，反应速度对底物浓度的变化相对不敏感，这一特点对体内那些和条代谢途径有联系的酶来说，可保证其能稳定正常地工作。
（二）酶的化学修饰
酶蛋白肽链上某些残基，在另一种酶的催化下发生可逆共价修饰，而引起酶活性改变的过程，称酶的化学修饰。
酶的化学修饰包括：磷酸化与脱磷酸化，乙酰化与脱乙酰化，腺苷化与脱腺苷化，-SH与-S-S-互变，尿苷酰化与脱尿苷酰化，ADP-核糖基化，甲基化与脱甲基化等。其中磷酸化与脱磷酸化在代谢调节中最为重要和常见。
蛋白激酶催化磷酸化，特异的磷酸酶催化脱磷酸。被修饰的酶在活性形式与非活性形式之间互相转变。通过共价修饰改变酶的构象，调节酶的活性。
化学修饰的特点及意义：
（1）、绝大多数修饰调节酶具有无活性与有活性两种形式，它们互变反应中正逆两个方向由不同的酶催化。
（2）、此种酶促反应是级联反应，修饰因子使第一个酶发生酶促共价修饰后，被修饰的酶又可催化另一种酶分子发生共价修饰，每修饰一次，就可将调节因子的信号放大一次。
（3）、磷酸化是最常见的酶促共价修饰反应，是生物体调节酶活性经济而有效的方式。
（4）、化学修饰调节常与别构调节相互协作，增强了调节因子的作用。别构调节是细胞的基本调节机制，对维持代谢和能量平衡很重要。但当别构效应剂浓度很低时而不能发挥足够的调节作用，即可通过化学修饰反应 ，引起有效酶活性的迅速改变和相应的生理反应。
（5）、酶的化学修饰是生物体内快速而普遍的调节方式，对糖代谢、细胞生长和发育、基因表达、神经递质的合成与释放有主要作用。
（三）限制性蛋白水解对酶活性的调节
限制性蛋白水解是一种不可逆且高特异性的共价修饰调节系统，如酶原的激活、血液凝固、补体激活等，在蛋白质合成过程中起着切除、修饰和加工等重要作用。
调节的特点：
（1）、受这种调节的酶都以酶原形式合成和分泌，当需要时被相应的蛋白酶切除小肽链而激活。
（2）、由酶原转变为酶是不可逆的。
（3）、激活过程显示协同级联、快速的放大效应。
（4）、被激活的酶在完成其特定功能后，能及时地从靶部位被解除。
（5）、受这种调节的酶主要是一些消化酶和执行防御功能的酶。
四、核酶的催化作用
核酶是由Cech和Altman（1989年度诺贝尔化学奖）1982年提出的，具有催化作用的mRNA。
一）、概述（与蛋白质酶相比较）
（1）、化学本质：是RNA，其催化活性及催化特异性都为其结构和特性所决定。由A、C、G、U四种碱基组成，以碱基互补方式与底物结合。
（2）、底物：主要为RNA。
（3）、反应特异性：具有严格的碱基特异性。
（4）、催化效率：催化效率较低。
（5）、产物：集底物、产物于一身。
（60、在生命活动中起重要作用。
2、核酶的分类
（1）、根据催化反应的种类分为四类：I类内含子的自我剪接
II类内含子的自我剪接
自身催化的剪切型
异体催化的剪切型
（2）、作用机制：I、剪接型：催化自身剪接，具有内切酶和连接酶两种活性。
II、剪切型：催化自身RNA或异体RNA一段RNA的剪除，具有内切酶活性。
（3）、作用底物：I、自身催化：以自身为底物进行自我剪切和剪接。
II、异体催化；以异体为底物。
二）、剪接型核酶
其作用机制是通过既剪又接的方式除去内含子或居间序列，连接外显子，生成成熟RNA。
内含子是各种RNA初级转录产物前体待剪接序列。
1、内含子的自我剪接：存在于真核细胞一些RNA前体。
（1）、剪接机制
rRNA前体中内含子的环化。
第一次转酯反应：鸟苷化合物中G的3’-OH作为亲核基团向5’外显子与内含子5’剪接点的磷酸酯键进行亲核攻击，5’外显子脱落，3’外显子与内含子相连。
第二次转酯反应：5’外显子的3’-OH作为亲核基团攻击3’外显子与内含子的3’剪接点连接的磷酸酯键，形成新的磷酸二酯键，而外显子相连生成rRNA，同时释放内含子。
L-19内含子的形成：释放的IVS可进行自身环化，即线性内含子的3’—OH攻击其5’端的磷酸二酯键，从5’端脱下15个核苷酸片段，并连接为环状中间产物，开环后再剪切下4个核苷酸，最后得到一个丢失19个核苷酸的线性IVS，即L-19 IVS。L-19内含子具有多种酶的活性，可催化多种以RNA为底物的反应，如核苷酸转移反应、磷酸转移反应、RNA限制性内切反应等。
（2）I类内含子的二级结构
包括P1-P10的碱基对区，P、Q、R、S序列，突环、单链区，剪接位点，结合位点。不同的I类内含子序列的相似性很小，但都有一系列短的保守序列，P/Q，R/S配对区和P、Q、R、S未配对序列，在P1和P10处有5’端和3’端剪接位点，由IGS碱基对组成。G结合位点主要成分是在P9的G-C碱基对。
2、II类内含子的剪接：II类内含子存在于植物的线粒体、叶绿体及真菌中。
（1）、剪切机制
套环形成：内含子中位于3’剪接位点的饿一个A的2’-OH作为亲核基团对5’剪接位点的磷酸酯键进行亲核攻击，使5’剪接位点断开。由2’,5’-磷酸二酯键连接形成套环结构。
外显子连接：5’外显子的3’-OH作为亲核基团对内含子3’剪接位点进行亲核攻击，两个外显子以3’,5’-磷酸二酯键相连，形成成熟的RNA，并释放带有套环的内含子。
（2）、II类内含子的二级结构
II类内含子的二级结构由6个结构域组成。结构域I有两个保守的外显子结构序列，分别与两个内含子结构序列相互配对，有5’和3’端边界序列GUGYG和AY。结构域V高度保守，为催化活性所必需，并与结构域I结合，形成催化核心。结构域VI是一个含有套环分支点的螺旋结构。
三）、剪切型核酶
1、自身催化剪切型RNA
（1）、锤头结构
由三个双螺旋区包括有13个核苷酸残基是保守序列的中心区或核心结构，及连接碱基对的任意发夹环组成。由催化部分和底物部分组成。
（2）、发夹结构
由4个螺旋区和数个环状结构组成。螺旋区有6个碱基对组成，II由4个碱基对组成，III由5个碱基对组成，IV有5个碱基对的螺旋结构区，需要有3对配对碱基存在，有两个内部环将I、II区与III、IV区分开。剪切位点有5个碱基组成，GUG是最常见的剪切部位，剪切反应发生在GUG的5’端。
（3）、斧头结构——人肝炎病毒HDV
有三个碱基对的茎（I、II、III），在III处有一个单链的RNA开放区。茎II发夹环处起分为酶及底物部分。
2、异体催化剪切型
核糖核酸酶P（RNase P）是内切核酸酶，能剪切所有的tRNA前体。
RNase P由M1 RNA和蛋白质亚基组成。单独的M1 RNA具有催化活性，但单独的蛋白质则不具有催化活性。
第三讲 核酸化学
一、核酸的结构
（一）DNA的结构
1．DNA的一级结构
动物染色质DNA是双螺旋线型。线粒体、细菌及某些病毒是双螺旋环状。少数几种病毒是单链线型或环状。
DNA主要由A、G、C、T和少量稀有碱基如m5C组成。各种生物碱基组成规律：
腺嘌呤与胸腺嘧啶完全相等。G与C完全相等。嘌呤总数与嘧啶总数完全相等。A+C=G+T A/T=G/C。
碱基组成具有种的特异性，既不同的物种DNA具有自己独特的碱基组成。
碱基组成不具有组织器官特异性，同一生物各组织器官具有相同的碱基组成。
年龄、环境、营养状态不影响DNA碱基组成。
DNA的一级结构是4种脱氧核苷酸按一定的方式、数量、排列顺序形成的多核苷酸链。
一个脱氧核苷酸的C3’-OH与一个C5’-P以3’—5’磷酸二酯键相连形成糖-磷酸骨架，碱基在内侧，3’端为-OH，5’端为-P，书写时按5’→3’方向。书写用缩写式如dACGT或5’ dACGT3’等，表式脱氧核苷酸的结构。
真核生物DNA一级结构中，常有一些重复序列。
①高重复序列： 重复频率高，从几十万次到几百万次，重复序列较短，5~300bp，多数为5~15bp。重复序列中有些是反向重复序列，即该片段碱基顺序在互补链方向正读反读都相同，称回文结构。
有些反向重复序列中间被一些不相关的顺序隔开，形成十字形结构，在十字形两头形成发夹环。
高重复序列中还有一种由简单重复单位组成的重复序列，重复单位由2~10 bp，成串排列。
高重复序列碱基组成不同于其它部分，可用等密度梯度离心法将其与主体部分分开，称为卫星DNA。根据重复频率和重复序列长度不同又分为小卫星DNA和微卫星DNA。卫星DNA是一种较好的分子遗传标记。
高重复序列可参与DNA复制及基因表达调控。
②中重复序列：重复频率和序列长度有很大差异，平均长度为6×105bp，平均重复350次，在DNA一级结构中可成串的排列在一个大的区域，也有的与单拷贝序列间隔排列，有些序列不编码蛋白质，有些序列编码蛋白质。
中重复序列具有种的特异性，可作为探针区分不同种哺乳动物细胞DNA。
③低重复序列——单拷贝序列
序列不重复或只重复几次、十几次，长度大于1000bp，携带大量遗传信息，编码多种蛋白质，有的是基因间隔序列。
2、DNA的二级结构
DNA的二级结构是Waston和Crick于1953年提出的双螺旋结构模型。其要点如下：
①主链：有两条反向平行的脱氧多核苷酸链组成。双链围绕螺旋轴以右手方向盘绕成双螺旋。磷酸-脱氧核糖位于螺旋的外侧，构成螺旋的主链，碱基位于螺旋的内侧。
②碱基对：两条链的碱基通过氢键联系在同一平面上形成碱基对，A--T,G--C。两种碱基对氢键间的距离、碱基两侧与其C-1’连接之间距离及C-1’与核苷酸构成的角度相同。
③螺距：双螺旋螺距为3.4nm，包含10个碱基对。每两个相邻碱基平面的垂直距离为0.34nm，直径为2.0nm 。相邻碱基对之间的螺旋角度为36°。
④大沟和小沟：两条主链和碱基并不充满双螺旋的空间，表面形成大小两条凹下去的槽，称大沟和小沟。这是由于碱基对上下大小不同及碱基对两侧的脱氧核糖是不对称的而形成的。两种沟内都具有形成氢键的氢供体和受体，但结构不同。大沟比小沟宽而深，易与DNA蛋白质酶等相互作用。
这种模型为B-DNA，随着DNA分析技术的发展，DNA的双螺旋不是均匀的，整个螺旋不是垂直而是弯曲的，许多结构参数是随碱基序列的不同而有一定范围的波动，如旋转角度等。
稳定双螺旋结构稳定的因素有：互补碱基间氢键，碱基堆积力（碱基平面之间的范德华力和疏水作用力），离子键（外侧磷酸基的负电荷与介质中的阳离子之间形成的离子键）。
DNA双螺旋的多态性：
DNA在不同条件下存在有不同的双螺旋结构，具有多态性。如：A、A’、B、B’、C、C’、D、E、Z等。
①A-DNA：
DNA纤维钠盐在湿度为75%时，B-DNA转变为A-DNA。
A-DNA的右手螺旋比B-DNA大且较平，每转一圈的螺距为2.8nm，每一圈的碱基对数为11，碱基距离0.255nm，碱基旋转33°。碱基平面与中心轴不垂直，而成20°倾斜，大沟窄而深小沟浅。
②Z-DNA
结构特征：
a：以二聚体dGC或dCG为一个单位，由六个这样的单位构成一个左手螺旋。磷酸基团走向成Z型。螺旋直径为1.8nm。每转一圈包括12个碱基对，螺距为4.5nm。
b：G--C碱基对不是对称的位于螺旋轴附近移向边缘，G位于DNA分子表面成六面对称排布，表面有窄而深的小沟。
影响Z-DNA形成与稳定的因素：
①单价、二价金属离子有利于Z-DNA的形成与稳定。多胺等促进Z-DNA的形成与稳定。
②具有嘧啶、嘌呤交替相间的序列有利于Z-DNA的形成。
③胞嘧啶或鸟嘌呤的甲基化可形成稳定的Z-DNA。
④组蛋白H2A、H2B、H3、H4稳定Z-DNA而组蛋白H1和H5不利于Z-DNA的形成。
⑤在有适当碱基序列的部位解旋时，促进Z-DNA的形成。
三螺旋DNA的结构分为分子间、分子内、和平行三螺旋DNA三类
三螺旋DNA的结构分为分子间、分子内、和平行三螺旋DNA三类.
①碱基组成及配对：
三螺旋是在双螺旋的结构基础上形成的
三链区的三条链均由同型嘌呤或同型嘧啶组成。根据碱基组成及结构的不同分为嘧啶-嘌呤-嘧啶型（Y。RY型）：TAT、CGC，嘌呤-嘌呤-嘧啶型（R。RY型）：AAT、GGC。碱基配对方式，第三个碱基以A--T、G--C配对只形成两对氢键，在R。RY型上还存在G--G、A--A每一型中碱基配对具有高度的序列特异性。
②分子间三螺旋DNA：
合成的脱氧多核苷酸在一定条件下DNA双螺旋的特定区插入双螺旋结构的大沟内，通过氢键的形成局部的分子间三螺旋结构，并与双螺旋一起旋转。
③分子内三螺旋DNA：
DNA双螺旋特定区通过氢键作用发生自身折叠形成局部分子内三股螺旋结构，同时游离出一段DNA单链。如H-DNA，其内的主要序列成为H-回文序列。
④平行的三螺旋结构：
三螺旋结构中的第三条链的序列，方向与第一条链的相同称为R-DNA。
近年来的研究表明，在真核细胞染色质中，发现许多基因的调控区和染色质的重组部位含有三螺旋DNA结构，应用单链DNA片段可将切割剂携带到DNA的特定位点，从而达到选择性切断有害基因或病毒基因的转录。对三螺旋DNA的研究有助于认识真核基因结构，复制、转录、调控和重组的机理。
3、DNA的三级结构
DNA的三级结构是指DNA双螺旋进一步扭曲盘绕所形成的构象。包括线型双链中的扭结、超螺旋、多重螺旋、分子内局部单链环、连环等。超螺旋是最常见的一种。
①超螺旋
环状DNA、线形双螺旋两端连接进一步扭曲可形成负超螺旋。向右手扭曲形成正超螺旋。
天然存在的超螺旋多为负超螺旋。如细菌质粒、噬菌体、大肠杆菌染色体DNA、真核细胞染色体DNA的。
自然界中大多数DNA分子都以超螺旋结构存在。其意义在于：1、密度大、体积小，在细胞中所有体积较为经济；2、能影响双螺旋的解链程度，因而影响DNA分子与其他分子的相互作用，参与DNA的复制、重组、转录等功能。
（2）染色体DNA的三级结构
真核细胞染色体DNA的二级结构是线性双螺旋，三级结构是双螺旋盘绕在组蛋白上的负超螺旋结构。这种以组蛋白为核心，盘绕以DNA片段的颗粒称核小体。
核小体是染色体的基本结构单位，每一个核小体上的DNA熟练是因生物种类和组织不同而异。完整的核小体由核小体核心与连接蛋白组成，核心是由组蛋白H2A/H2B、H3/H4与DNA结合形成的八聚体，连接蛋白由组蛋白H1和20-80bp的DNA构成。许多核小体形成念珠线形结构的核小体链，然后盘绕形成染色质纤维，再进行盘曲形成染色单体。
线粒体DNA的结构
线粒体DNA是双链环状分子，两个链的碱基组成显著不同。重链含有较多的G，轻链含有较多的C。有一个长度不同的D环。D环含有2个启动基因（P1、P2），3个保守序列CSB（I、II、III）和一个终止序列；有2个复制起始点（OH、OL）；重链是2种Rrna、14种Trna和12种多肽的模板，轻链是8种Trna和1种多肽的模板。线粒体基因排列紧密，没有间隔区，基因长度变化小，两端不存在非编码序列，很少有重复序列，无内含子。
4、DNA的理化特性。
①分子大小：分子量104~107，碱基对107bp。长度可达数厘米，由于分子很长，有一定脆性，极易受剪切力的作用而折断。
②紫外吸收特性：由于嘌呤和嘧啶碱基形成共轭双链而具有紫外吸收性质，最大吸收波长260nm，此特性可用于测量核酸的浓度及其纯度。
③变性与复性：
变性：能破坏氢键和疏水键的因素都能导致双螺旋的破坏。
变性因素：加热、极端pH、有机溶剂、尿素、酰胺等。
DNA由双螺旋结构转变成无规则卷曲单链，称DNA变性。变性理化性质发生很大变化，260nm处紫外吸收值增高、黏度下降、沉降系数增加、浮力密度上升等。
热变性在较窄的温度范围内发生，引起DNA变性温度称熔点（Tm）。DNA Tm在70~85度之间。
溶液离子种类和强度影响DNA的稳定性，离子强度低时，Tm值低，熔点范围较窄；离子强度高时 ，熔点范围较宽。
DNA分子碱基组成的均一性和分子中G+C的含量可影响其Tm 值。均一性DNA Tm值较窄，非均一性DNA Tm值较宽。G+C含量高的DNA，Tm值较高。亦较稳定，所以，Tm值可作为测定DNA样品均一性的指标，及推算DNA碱基组成。
复性：
除去变性因素后，变性DNA的两条链重新结合起来，恢复到原来双螺旋结构的过程称为DNA复性。
复性后DNA的一系列理化性质得到恢复，真核DNA重复频率高的序列复性速度快，重复频率低的则慢。序列简单、浓度高、片段大的DNA复性快。
（4）核酸分子杂交：
相同或不同来源的两个DNA或DNA和RNA分子如果含有彼此互补的序列，混合在一起，通过变性和复性处理，DNA-DNA同源序列间及DNA-RNA异源序列间形成DNA-DNA或DNA-RNA杂交体，称为核酸分子杂交。
核酸探针（基因探针）：有目的合成从基因组中分离一段已知序列的DNA，使带上标记，竟变性后成为单链，在一定条件下与待测DNA单链杂交，如两序列有同源性即互补，形成带有标记的双链DNA分子，以达到探测位知DNA的目的。
（二）RNA结构
1．RNA的结构特征
（1）碱基组成：A、G、C、U及少量稀有碱基，碱基含量没有A--U、G--C的比例关系。
（2）一级结构：四种单核苷酸按一定方式、数量和排列顺序形成多核苷酸链称为RNA一级结构。细胞RNA分子一般为线形单链分子。
（3）RNA构象：RNA二级结构由双螺旋或碱基对区、内部环、单碱基突起和突环、发夹环或多分支环、单链区、甲结构成。
双螺旋区：RNA单链迂回折叠形成，一个或数个长短不一的局部双螺旋结构。
内部环：RNA链中不互补的碱基突出形成环状突起。内部环的碱基数目可以是对称的也可以是不对称的。
单碱基突起：在一个连续的双螺旋中突起一个碱基。
发夹环：对于双螺旋末端两面连接的双链区域，类似发夹结构。
多分支环：是连接三个以上螺旋的环区。
甲结：是二级结构中环区再加上碱基配对形成。是几个螺旋区交叉的一种形式。
单链区：位于RNA分子的端部。
（4）RNA的空间结构：
单链RNA分子通过折叠形成二级和三级结构。二级结构既有单链区又有双链区。种类和功能不同的RNA有其特征的二级或三级结构，种类和功能相同的RNA二级或三级相同或相似。
2．mRNA
二级结构没有共同的形态和规律。原核生物和真核生物mRNA结构不同。
（1）原核生物mRNA的结构。
典型的多顺反子结构即一个操纵子编码的几条多肽链。5’端无帽子结构，没有修饰核苷酸，不含稀有碱基，3’端没有多聚A序列，二级结构存在丰富的自身回折形成的双链区，有发夹结构。
（2）真核生物mRNA结构
含有少量稀有碱基，由5’的帽子结构、5’非编码区、编码区、3’非编码区和3’多聚A尾组成。
①5’帽子结构：是5’存在甲基化核苷，即：m7GpppNm.，对mRNA的翻译活性很重要。
②3’多聚A结构：存在于3’端的多聚A结构，是转录后由腺苷酸聚合酶催化加上的，对mRNA的稳定、翻译效率有调控作用。
③编码区：带有特异性蛋白质遗传信息的翻译区，是肽链氨基酸序列的编码序列。
④非编码区：存在5’和3’端，两个非编码区分别包括5’帽子结构、起始密码和终止密码、多聚A结构，非编码区参与翻译过程和起调控作用。
3．tRNA
（1）tRNA一级结构特征
①单链小分子
②含有较多的稀有碱基或修饰碱基，其中以甲基化碱基较多；
③3’端都是…CCA-OH结构；
④5’端总是磷酸化的，大多数为小pG；
⑤表现出进化的保守性，有二十多个位点上的核苷酸是不变的；
⑥大多数tRNA第54到57位存在TΨCG序列。
（2）tRNA二级结构
是三叶草结构，有5个臂组成 ，即：氨基酸臂、二氢尿嘧啶臂、反密码子臂、胸苷假尿苷胞苷臂和可变臂。每个臂由两部分组成，一部分碱基配对形成双螺旋，另一部分以单链形式形成一个小环。①氨基酸臂：由7个碱基对组成的局部双螺旋区和3’端CCA-OH组成，可接受活化的氨基酸。
②二氢尿嘧啶臂由三个碱基对组成，短双螺旋区和由7到10个核苷酸形成的二氢尿嘧啶环。
③反密码子臂：由5个碱基对构成的短双螺旋区和7个核苷酸形成的反密码子环，其中三个核苷酸组成反密码子，与Mrna相应的密码子互补。
④胸苷甲尿苷胞苷臂：由5对碱基组成的双螺旋区和7个核苷酸围成的TΨCG组成。TΨCG环使Trna与腺粒体的大亚基相互结合。
⑤可变臂：有3到21个核苷酸组成的可变化的含量多者可形成小双螺旋。
5．hnRNA、snRNA、snoRNA
（1）hnRNA
又称不均一核RNA存在于真核生物细胞核中，分子量不均一，是mRNA的前体，在核质中由RNA聚合酶Ⅱ转录而成，初级转录产物不含5’帽子和3’polyA结构。在核质量经过加工修饰成有帽尾结构的hnRNA，再经剪接和甲基化修饰转变成成熟的mRNA.
hnRNA与蛋白体、结合成核内不均一的核糖核蛋白颗粒（hnRNP），参与mRNA剪接加工成熟过程。
（2）snRNA
又称作核内小RNA，是一类小分子RNA，分布于细胞核中，与蛋白质结合在一起形成小分子细胞核核蛋白颗粒（snRNA），与Mrna前体组成剪接体，参与Mrna的剪切，加工。
（3）snoRNA
又称作小分子核仁RNA，存在于真核生物细胞核内，参与Rrna的加工，影响Rrna，及其前体的形成等。
6．反义RNA
指能与有义mRNA互补结合的单链RNA。广泛存在于自然界。原核生物由反义基因转录而来。真核生物来自于mRNA同一DNA区。即由反链转录而来。
反义RNA是生物体内重要的调控物质，可在多层次对基因的表达进行调控。
二 DNA的复制
（一）DNA复制过程基本要点
1．半保留复制
复制过程中，DNA两条链分开，分别以每一条链为模板合成新的互补链，产生两个与原来DNA分子碱基顺序完全一样的子代DNA分子，每个子代DNA分子的一条链来自亲代DNA，另一条链是新合成的，这种复制方式称半保留复制。
1958年Meselson and Stahl用14NH4CL为氮源的培养基培养大肠杆菌时证实了半保留复制。
半保留复制是双链DNA的普遍复制机制。单链DNA在复制时，也要先形成双链的复制形式。
2．复制的起始点、方向和方式
复制是从DNA分子上特定位置开始的。这一位置称复制原点。方向大多以双向进行，也有一些以单向进行。复制正在发生的位点叫复制叉，双向复制可形成两个复制叉。
（1） 复制的起始点
原核生物只有一个起始点，真核生物有几个或多个复制起点。其共同特点是都富含A.T序列。是引发复制的蛋白因子结合的位点。不同生物中A.T序列长度不同。
（2） 复制的方向
复制从特定位置开始，大都双向进行，也有一些是单向的。向一侧单方向进行的复制称为单方向复制，向两侧进行的复制叫做双向复制，向两侧复制但移动是不对称的称不对称双向复制。
（3）复制方式
①眼型：复制区域形如一个眼睛，复制随眼形结构的扩张最终扩张到整个复制子，有单向和双向两种。
②θ型：复制眼形成类似θ结构，发生在环状DNA分子中。有双向和单向复制，多数为双向等速复制。
③D环型：线粒体DNA的复制呈现D环型。
线粒体DNA是环状双链DNA。两条链的复制是不对称的，先以新代分子中的负链为模板，合成一条新链，当合成进行到一定距离时，暴露本身一条链的复制点，从该点开始，以正链为模板，合成一条新链，两者的合成方向相反。由于起始点不在同一位置，所以合成的起始时间不同。复制是不对称进行的。
④滚环型：
某些病毒、噬菌体DNA复制时形成滚环型。当环型DNA分子复制时，先由一核酸内切酶从正面的一个位置打开一个缺口，使3’和5’端游离出来，3’端做为引物，在DNA聚合酶催化下，以负链为模板，连续合成一条新链，形成环状双链子代DNA，以原有的正链为模板连续或不连续合成一条负链最后形成一线形或环状双链分子。
3．复制的方向：从5’→3’。
4．复制的半不连续性
DNA复制在有条链上以5’→3’的方向连续合成，这条链成为前导链，在另一条链上，先按5’→3’方向合成许多与复制叉方向相反的岗崎片段（1968年，岗崎发现），随着复制叉的移动，许多不连续的岗崎片段在DNA连接酶的作用下，连接成一条完整的DNA链。这条链称随从链。
5．模板和引物
模板为DNA。
引物是在DNA的复制过程中，每段岗崎片段复制时都要先合成一小段RNA作为引物，复制才能进行，引物是引发DNA合成的。
6．引发和引发体
①DNA分子上一段短的区域发生熔解反应，双链分离成单链区域，由解旋酶使双螺旋解开，单链结合蛋白使双链解开，并覆盖在单链上。
②解旋酶沿DNA移动形成复制叉。
③在引物合成酶的作用下，形成一小段RNA引物，引发复制，引发过程中由若干蛋白和酶形成一个引发体。引发酶在随从链上向复制叉方向前进，在随从链上断断续续地引发生成随从链的RNA引物。在前导链上引发只进行一次。
7．链的延伸
链的延伸是在DNA聚合酶催化下，按模板的要求，在引物的3’-OH加上新的核苷酸。大肠杆菌DNA聚合酶有I、II、III三种。酶III是延伸的主要酶。
8．链的终止
在单向复制的环状分子中，复制的终点就是复制原点。在双向复制环状分子中没有固定的终点。
DNA链延长结束后，DNA聚合酶I的作用下切除RNA引物，该酶具有5’→3’外切酶的功能。去除引物后留下的空缺由酶I催化填补，然后在又DNA连接酶将DNA片段连接起来。
9．复制忠实性的保证
为了保证复制的忠实性，生物体内具有确保复制忠实性的机能。DNA聚合酶具有3’→5’外切酶活性，可专门水解不配对的碱基，该酶在聚合开始时具有选择正确碱基的能力，同时有一种校对作用，删去误配的碱基，保证复制的高度忠实性.
（二）复制过程所需主要酶类及相关蛋白
1．DNA聚合酶
DNA聚合酶的特点：
①以四种脱氧核苷酸三磷酸为底物；
②反应需接受模板指导；
③反应需有引物3’-OH存在；
④双链的伸展方向为5’→3’；
⑤产物DNA性质与模板相同。
（1）大肠杆菌DNA聚合酶
酶I：
①DNA聚合酶活性：通过核酸聚合反应使DNA链沿3’→5’方向延长。
②3’→5’外切酶活性：由3’端水解DNA链。
③5’→3’外切酶活性：由5’端水解DNA链。
3’→5’外切酶活性能切除单链DNA的3’末端。正常聚合反应中3’→5’外切酶活性受抑制，当出现错配碱基对，聚合反应停止，由3’→5’外切酶切除错配碱基，聚合反应才能继续进行。
5’→3’外切酶活性只用于双链DNA，从5’端水解下核苷酸或寡核苷酸，如岗崎片段中5’引物的切除。
酶II：
催化由5’→3’方向合成DNA反应，只有3’→5’外切酶活性，而无5’→3’外切酶活性。
其生理功能还不太清楚。
酶III：
与酶I一样具有3’→5’， 5’→3’外切酶活性。酶III在复制过程中起主要作用。其酶由多亚基组成的点不对称两臂的大分子。这样可适于同时复制复制叉的前导链和随从链的合成。随从链的模板在复制叉前进处围绕DNA聚合酶III的一个臂弯曲成环，使随从链片段在5’→3’合成时也于复制叉前进方向一致。当随从片段合成接近前导片段5’末端时，模板被释放，模板上的环消除，合成的随从链片段其5’→3’方向转为与复制叉方向相反。合成下一片段时，模板再成环、环再消除等。
（2）真核生物DNA聚合酶。
真核生物DNA聚合酶活性与大肠杆菌DNA聚合酶活性相似。有α、β、γ、δ和ε5种。
酶α：同与酶III，由多亚基组成，是真核生物DNA复制的主要酶。常伴有引物合成酶。引物可以是DNA或RNA。
酶β：能一人工合成的DNA为模板，引物为寡聚脱氧核糖核苷酸。可能在DNA的损伤修复中起作用。
酶γ：模板与引物与酶β相同，可能与线粒体DNA复制相关。
酶δ：天然DεNA需没Dnase处理活性后才能作为模板和因物。具有3‘→5‘外切酶活性。
酶ε：其性质与δ相似。
ε和δ的生物功能尚不清楚。
2．DNA连接酶
催化DNA切口处形成3’，5’-磷酸二酯键。目前应用的有大肠杆菌DNA连接酶、T4DNA连接酶。二者的区别：①辅助的因子不同（大-NAP；T4-ATP）。②底物不同，大肠杆菌DNA连接酶，只连接双链DNA中的单链缺口，只能实现粘接，不能实现DNA双链间的平接。T4DNA连接酶，既能实现DNA双链间的粘接，有能实现平接。
3．单链结合蛋白（SSB）
SSB能刺激同源DNA聚合酶的活性。使天然DNA熔点降低，单链DNA与其结合后，能抵抗核酸酶的水解，可与解开的两条单链结合，稳定单链以利于其发挥模板作用，促进复制进行。
4．DNA解旋酶
是一类通过水解ATP获得能量来解开双链DNA的酶。复制时DNA解旋酶可以沿着随从链模板的5’→3’方向随着复制叉的前进而移动。Rep蛋白前导链模板的3’→5’方向移动. Rep蛋白和DNA解旋酶在DNA两条链上协同作用,以解开双链DNA.DNA解旋酶还同时有引发酶的功能.
5．拓扑异构酶
酶I：①双链DNA超螺旋和送松弛态之间的转换。
②单链互补DNA的正链与负链形成双环结构。
③单链结状DNA和无结状DNA之间的转换。
④双链环状DNA的环连或解环连作用。
酶II：使DNA的正超螺旋转变为负超螺旋状态。使DNA两条链同时切开，同时利用水解ATP的能量，使双链结开，让一条DNA穿过断口，再将切断的末端重新关闭起来，形成负超螺旋。
6．引物酶
引物是一种特殊的RNA聚合酶，催化RNA引物的合成。引物酶作用需要有其他蛋白质因子存在，即需要有引发前体的存在。
引发前体包含多种蛋白因子PriA、B、C ,dnaA、B、D、T。引物酶与引发前体两者联合，组成引发体。
7．端粒酶
是一种核糖核蛋白酶，是一种特殊的DNA聚合酶，属于反转录酶。由RNA和蛋白质构成，以其中一段RNA序列为模板，延伸染色体的3’端解决DNA复制时引起的末端隐缩。
端粒酶RNA亚单位的结构在不同真核生物之间差别很大，其蛋白质组分至少有两个以上多肽亚单位组成。
端粒酶能把端粒序列加到染色体末端，以补充染色体末端的自然丢失。在缺乏有效延伸机制时，端粒在历经每次细胞分裂之后即缩短。
（三）原核生物DNA复制模型和真核生物DNA复制特点
1．原核生物DNA复制模型
凯恩斯模型（θ型）：
大肠杆菌和噬菌体DNA以此模型复制。
复制机制：①复制从双链特定的复制点开始。
②分别以正负两链为模板，以双向方式进行。
③正链膨大负链变形，逐渐形成θ型DNA分子。新生子链随母链正负链内外侧延伸。
④延伸到一定程度闭环，形成两个子代DNA分子
（2）滚换式模型
如φχ174噬菌体与单链环状DNA的复制。复制时先以单链正链为模板合成一条互补链，形成环状双链复制型。
复制机制：①双链DNA分子的正链被内切酶切开一个缺口，露出3’-OH和5’磷酸末端
②正链的一端固定在细胞膜上，以环状闭和的负链为模板，以正链的3’-OH为引物，复制新的正链
③负链随正链的延长而滚动，使模板上尚未复制的核苷酸转到正链的延伸点，使正链的复制持续进行。
④拉成现状的正链的5’端部分逐渐延长，并进行直线伸展的复制
⑤新生的子链延长到一定程度后，在连接酶作用下成环，线状伸展部分也卷曲成环，形成两个子代环状DNA分子。
这种双链DNA分子可在内切酶作用下在正链切一切口，使正负链分开，形成一个单链DNA分子。
2．真核生物DNA复制的特点
（1）同原核生物一样都是半保留复制。
（2）原核生物只有一个复制起始点，一个DNA分子就是一个复制子。真核生物DNA上有许多复制起始点，每个复制起始点，不固定在某一DNA序列处，每个起始点左右各有一个终止点，形成一个复制单位即复制子。不同生物，同一生物不同生长条件下，其复制子大小不同，同一DNA上其复制子大小不均一。
（3）从复制起始点开始向左右进行，形成复制叉。许多复制叉碰在一起，最后完成整个DNA复制过程，形成两个子代DNA分子。
（4）原核生物DNA复制可以双向进行，也可以单向进行。真核生物DNA复制绝大多数双向进行，少数单向进行。
（5）原核生物复制起始点可连续进行新的复制。真核生物DNA在完成生命复制之前 ，每个起始点不能开始新的复制。
（6）真核生物线粒体DNA的复制类似于凯恩斯模型，是单向不对称的半保留复制，即D环型。
（四）DNA的损伤修复
1．DNA的损伤：
由于某些物理和化学因素的作用引起DNA序列发生变化，造成DNA损伤。
这些变化包括：碱基的丢失、碱基的插入、碱基的变化、DNA链的断裂和交联、碱基二聚体的形成等。
2．DNA损伤的修复
（1）光复活：可见光激活了光复活酶，它能分解由紫外线照射而形成的嘧啶二聚体
这种修复由于高度专一性，只作用于由紫外线照射形成的嘧啶二聚体。从低等生物到鸟类都有，但高等动物没有。
（2）切除修复：在一系列酶的作用下，将DNA分子中损伤部分切除，并以完整的链为模板，合成出切除的部分，使DNA恢复正常结构的过程。
（3）重组修复：损伤的DNA片段上出现缺口，从完整的母链上将相应的核苷酸序列片段移至缺口处，然后用再合成的序列来补上母链的缺失。
（4）SOS反应：是细胞DNA受到损伤或复制系统受到抑制的紧急情况下 ，为求得生存而出现的应急效应。
SOS反应能诱导切除和重组修复中有关的酶和蛋白质的产生，加强切除和重组修复的能力。
SOS反应还能诱导产生缺乏校对功能的DNA聚合酶，能在DNA损伤部位进行复制而避免了死亡，却带来很高的变异率，在某种情况下允许错配，以增加存活的机会。
是原核和真核生物在不利环境中求得生存的一种基本功能。
（五）RNA 指导的DNA的合成——逆向转录
1．逆转录酶：由αβ两个亚基组成。催化活性与DNA聚合酶相似，具有三种活性：
（1）RNA指导的DNA聚合酶活性（逆转录）。
（2）DNA 指导的DNA聚合酶活性（合成双链 DNA）。
（3）3’→5’和5’→3’核酸外切酶活性。
由mRNA 3’-端polyA，可通过逆转录酶以mRNA为模板，转录出cDNA构建cDNA基因文库，筛选出特异的结构基因。
2．逆转录病毒
致癌RNA病毒逆转录酶，称逆转录病毒。
病毒双链DNA形成后即即时进入细胞整合到宿主DNA进行转录。
3．逆转录的生物学意义
（1）逆转录病毒和嗜肝经过逆转录，整合到宿主细胞后可引起癌症和肝炎，如果能寻找到逆转录酶的专一性抑制剂，可以防止致癌作用，为治疗肿瘤提供重要线索，同时对这类病毒进行改造，可成为向细胞内部引入外源遗传信息的工具，用于肿瘤和遗传疾病的基因治疗。
（2）AIDS病毒是一种逆转录病毒。研究这类病毒的逆转录过程可了解它的起因和寻找防治途径。
（3）真核生物基因组中RNA逆转录基因的发现，表明真核生物正常细胞内也存在逆转录过程。
三、基因转录与转录后加工
DNA的转录产物为mRNA、tRNA、rRNA。
编码mRNA分子的基因为结构基因，终产物为蛋白质。
编码tRNA、rRNA分子的基因为结构基因，终产物为tRNA、rRNA从不被翻译成蛋白质。
转录过程中与转录产物RNA分子序列相同的链为编码链；与编码链互补的DNA链在转录过程中作为指导RNA合成的模板，称为模板链。
启动子上转录合成为RNA的第一位碱基称为转录开始点。DNA上转录开始部位的特殊区称为启动子。转录终止的序列称终止子。
从启动子到终止子之间的全部DNA序列称转录单位。一个转录单位可包括多个基因。
转录开始点以前为上游，以后为下游。书写转录过程从左到右。
书写DNA仅写编码链。转录开始点为+1，开始点前为-1，下游方向计数增加，上游方向计数绝对值增加。
（一）原核生物基因的转录
1．RNA聚合酶
E.coli RNA聚合酶催化E.coli三类RNA的合成。RNA聚合酶的Vm比DNA聚合酶低的多。因此，DNA复制时速度快，链延伸仅在少数点进行。转录速度慢，可在很多点进行，其结果是细胞中富集的RNA分子比DNA多。
RNA聚合酶与DNA聚合酶模板的精确性不同。RNA聚合酶对模板的精确性低，因为RNA聚合酶缺乏外切核酸校对功能。
RNA聚合酶由2个α亚基，β、β’、δ和ω亚基组成，α亚基的功能是RNA合成的起始有关，β亚基的功能参与RNA合成的起始及延伸，β’亚基的功能是与DNA结合，δ亚基的功能是识别转录的启动子，增加核心酶与启动子结合的特异性，ω亚基的功能不清楚。除掉δ亚基的酶称核心酶。核心酶有催化活性，但没有特异性。
2．转录过程
（1）、转录起始
RNA聚合酶全酶与模板DNA非特异性结合，并向启动子移动，而后与启动子特异结合，形成紧密的启动子复合物，启动子处DNA双链解开，形成开放启动子复合物。
（2）、启动子识别
启动子位于DNA模板5’端大约10bp的富含A、T的起始序列中。起始序列中含有TTGACA和TATAAT两个保守序列。分别位于-35bp和-10bp处，称-35区和-10区。-35区和-10区的数个核苷酸是启动子上开放启动子复合物的主要接触点。
（3）、转录延伸
RNA聚合酶与启动子形成开放启动子复合物后，RNA聚合酶催化第一个核苷酸与DNA模板结合，链延伸起始，δ亚基从核心酶解离，核心酶沿DNA模板移动，同时解开模板双螺旋，暴露单链模板，当RNA合成大约12bp时，DAN双链再形成双螺旋，使转录产物与模板分离。
当RNA聚合酶到达DNA链终止信号处时，转录终止。
（4）、转录终止
细菌转录终止有两种方式，一种需要终止因子ρ的终止，另一种不需要终止因子的终止。
ρ因子与转录产物5’端特异位点结合，然后向转录产物的3’端移动，在解旋酶的催化下解开转录产物的3’端与模板间的双链，使转录产物释放。
不需要终止因子的终止方式的基因3’端具有两个特点，一个是在转录产物中有两个富含GC的片段，可形成茎环结构；另一个是其下游有4-8个A残基。
当RNA聚合酶遇到第一个富含GC的片段时，由于稳定的GC碱基对使模板很难解旋，RNA聚合酶暂停移动。转录产物中富含GC部分相互配对，由于A-U链的连接，使转录产物与模板间的连接作用减弱，导致转录产物从模板上解离下来，完成转录终止。
3．转录后加工
（1）、mRNA转化
原核生物初始转录产物mRNA在其自身合成过程仍在进行时就开始翻译，翻译后很快降解，因此mRNA不需要加工修饰。
（2）、rRNA和tRNA的转录后加工
rRNA和tRNA都分别是合成大的转录产物，然后对转录产物进行剪接，形成成熟的RNA分子。编码rRNA和tRNA的DNA总数不到基因组的1%。
rRNA的转录后加工：rRNA转录产物包括16S、23S和5SrRNA及1-4个tRNA序列，转录仍在进行时核糖体蛋白颗粒就可安装到RNA前体上，然后剪接成成熟的rRNA。
tRNA的转录后加工：转录出来的tRNA两侧有很长的序列，先在核糖核酸酶的作用下从5’-端剪切，形成tRNA 5’-端结构，然后核糖核酸酶D从3’-端剪切，形成tRNA 5’-端CCA结构，最后再进行甲基化、硫醇化等碱基修饰，产生稀有碱基。
（二）真核生物基因的转录
1．真核生物RNA聚合酶
（1）、酶I
位于核仁中，催化rRNA前体的合成，活性最强。
（2）、酶II
由8-12个亚基组成，其显著特征是最大亚基有羧基末端结构域（CTD）。CTD结构由多个7氨基酸残基的重复序列组成，原核生物及真核生物的其他RNA聚合酶没有此结构。CTD结构是RNA聚合酶II转录活性所必须的，如部分或全部CTD的重复单位丢失，则细胞不能存活。CTD的磷酸化和去磷酸化作用，可影响RNA聚合酶II的功能。
酶II位于细胞核包括转录mRNA前体及一些小核RNA。
（3）、酶III
由9-15个亚基组成。酵母RNA聚合酶III的两个大亚基与E.coli RNA聚合酶的β、β’亚基同源，两个小亚基与原核生物RNA聚合酶的α-亚基同源，有6个特有的小亚基，其中一个具有亮氨酸拉链结构，一个有酸性末尾，一个与酶的装配有关，其余的与tRNA的合成有关，大亚基与转录的终止有关。
酶III位于细胞核，负责转录tRNA前体、及一些小RNA。
2．真核基因启动子
（1）、RNA聚合酶I启动子
酶I识别的启动子是编码rRNA基因的启动子，核心启动子位于转录开始点的周围，从-45—+26bp处，促使转录起始。位于上游-180—-107bp处的控制元件可增加启动转录的效率。这两个启动子区有独特的碱基组成，富含GC碱基对。
酶I还需要两个辅助因子UBF1和SL1。UBF1与核心启动子和UCE的有关序列特异结合，SL1不与启动子特异结合，但协助UBF1的结合，延长覆盖DNA的区域。一旦两个因子结合，RNA聚合酶I就与核心启动子结合使转录起始。
（2）、RNA聚合酶II启动子
在所有组织中都表达的结构基因，其转录起始点的上游区有一个或多个拷贝的GC盒，其结构类似原核生物的启动子。只在一种或少数几种细胞中表达的结构基因，如珠蛋白基因等缺少GC盒，但含有与转录起始有关的特征序列：a、TATA盒，类似于原核生物启动子的Pribnow盒，决定转录的正确起始，但与原核启动子不同的是原核基因缺少Pribnow盒不能转录，而真核基因缺少TATA盒仍能转录，只是转录的效率下降，产物5’端不均一；b、CCAAT盒，位于TATA盒的上游，决定转录起始的效率；c、CACCC盒，位于CCAAT盒的上游，提供酶II结合位点及参与调控的结合蛋白的结合位点。
（3）、RNA聚合酶III启动子
酶III启动子不在转录起始点上游，而在基因编码区内。启动子分A、B两个区域，A区在5’端，B区在3’端，称断裂启动子。A、B区域内碱基发生突变，将会降低转录效率。但两者之间的距离不影响转录的起点和终点。
3．结构基因的转录与加工
（1）、转录的起始
真核生物结构基因的转录是在RNA聚合酶II的催化下进行的，起始过程中酶II与多种蛋白因子结合于启动子上形成转录起始复合物。
A、转录起始复合物
TATA盒结合蛋白（TBP）。TFII-B、F、E、H、D与酶II结合在启动子上形成转录起始复合物。酶II沿模板滑动时TFII-D留在转录起始位点上。
B、基因转录的通用因子
（1）TFII-D：由TBP与8种组分组成的蛋白质复合物，不仅决定RNA聚合酶II的转录起始位点，还参与CAAT盒等上游元件对基础转录速率的调节。
（2）TFII-B：是紧接在TFII-D后加入转录起始复合物的因子，具有参与俘获RNA聚合酶II的作用。
（3）TFII-F：由两个亚基组成，参与RNA链的延伸，并具有DNA解旋酶的活性。
（4）TFII-E：不直接与DNA结合，通过TFII-B与DNA结合，参与调节TFII-H的磷酸激酶活性。
（5）TFII-H：由多亚基组成，具有DNA解旋酶和蛋白激酶活性，参与RNA链的延伸和核苷酸剪切修复过程。在转录-修复的连接上发挥重要作用。
（6）TFII-A：对TFII-D与TATA盒的结合起稳定作用。
（2）、转录的延伸
在链延伸因子的作用下，酶II转录起始复合物脱离转录起始位点，RNA链开始延长。
（3）、转录后加工
转录出的前mRNA分子含内含子及旁侧区，就在核内经过加工之后转运到 核外进行翻译。
加工包括在3’-端加上Poly尾巴，约200个碱基，5’-端加上m7GpppNm帽子，及剪切掉其内所含的内含子，一些核酸snRNA参与剪接过程。
四、蛋白质生物合成
1．遗传密码的性质
密码子由三个碱基组成，代表一个氨基酸，翻译从起始密码子开始，从mRNA的5’端到3’端方向不重叠连续阅读密码子，一直到终止密码子停止。
4种碱基组成64种密码子，而体内只有20种氨基酸，多密码子代表一种氨基酸。UAA、UAG、UGA为终止密码子。
（1）、简并
简并指多种密码子编码同一种氨基酸，代表一种氨基酸的密码子称同义码或同义词。除色、蛋氨基酸只有一种密码子外，其他氨基酸均有两种以上密码子。AUG、GUG既是起始密码子又代表特定氨基酸。
（2）、密码子不同位置的碱基特异性
密码子的前两个碱基特异性强，第三个碱基具有一定灵活性，第三位的G和U在任何密码子中均没有特殊意义，A在氨基酸的密码子中也一样。
密码子的灵活性和简并性可使有些突变只是引起核苷酸序列的改变，而不引起蛋白质中氨基酸序列的改变，从而把突变对生物体的影响降低到最小。
（3）、通用与例外
在所有生物体内密码子几乎是通用的，但在人和牛的线粒体内存在例外：a、AUA是蛋氨酸而不是异亮氨酸；b、UGA不是终止密码子而是色氨酸密码子；c、AGA和AGG不是精氨酸密码子而是终止密码子；d、除AUG外，AUA、AUC、AUU也不做起始密码子。
（4）、密码子阅读方向与mRNA编码方向一致，从5’到3’。
（5）、密码子不重叠，无逗点。
2．密码子与反密码子的相互作用
tRNA的反密码子通过碱基反向配对识别mRNA的密码子。两者之间碱基配对不严格遵守碱基配对原则，而是摇摆配对，即前两对严格遵守标准的碱基配对原则，第三对（密码子的第三位与反密码子的第一位）允许有一定的自由度，可出现GU、IU、IC、IA配对。
因此，tRNA识别的密码子的数目由其反密码子的第一为碱基的性质来决定。
（二）核糖体
1．核糖体的组成
核糖体是蛋白质合成的场所，有RNA和蛋白质组成。
（1）、原核生物70S核糖体由50S的大亚基（16S rRNA和21种蛋白质）和30S的小亚基（23S rRNA、5S rRNA和34种蛋白质）组成。
（2）、真核生物80S核糖体由40S小亚基（16S rRNA和33种蛋白质）和60S rRNA（28S、5.8S、5S rRNA和49种蛋白质）组成。
2．核糖体的活性位点
核糖体可分为翻译区和逐出区，有A位、P位、转肽酶活性位点、EF-TU位点、EF-G位点、5rRNA位点、mRNA位点、逐出位点等9个活性位点。
（1）、mRNA结合位点：位于30S亚基头部，在S1蛋白等因子协同下与mRNA结合。
（2）、P位点：大部分位于30S亚基，与起始tRNA结合。
（3）、A位点：位于50S亚基，与氨基酸tRNA结合。
（4）、转肽酶活性位点：位于A位与P位连接处，具有转肽酶活性。
（5）、5SrRNA位点、EF-TU位点、转位因子EF-G结合位点、GTP酶活性位点
3．多聚核糖体
在生物体细胞内大多数核糖体处于非活性稳定状态而单独存在，少数核糖体与mRNA一起形成多聚核糖体。每一个核糖体上都单独合成一完整的多肽链。
（三）原核生物蛋白质生物合成的过程
1．氨基酸的活化与转运
活化的过程是氨基酸在酶的催化下，同ATP作用，产生氨基酰-AMP-酶复合物，即活性氨基酸。
氨基酸的转运是活化氨基酸在氨基酰-tRNA合成酶催化下转移给tRNA生成氨基酰-tRNA。
2．合成起始
合成起始是tRNA、30S亚基、50S亚基与mRNA结合形成70S起始复合物。
（1）、IF3促进70S亚基解离，并与30S亚基结合，然后mRNA与30S亚基结合。
（2）、IF2结合于起始tRNA，然后再于30S亚基结合，使起始tRNA进入30S亚基的P位。
（3）、50S亚基与30S亚基结合，GTP水解释放能量，形成70S起始复合物，同时IF2、IF3释放，A、P位处于正确的构象。
3．肽链的延伸
当70S起始复合物形成后，P位被起始tRNA占据，A位空着，然后相应氨基酰-tRNA进入A位，在延伸因子（EF-TU、EF-TS、EF-G）的作用下，转肽酶把P位上的氨基酰或肽基转移到A位，形成肽键，然后GTP酶水解将A位的肽基-tRNA移到P位上，同时将P位上空载的tRNA逐出核糖体，mRNA向前移动一个密码子。
每增加一个氨基酸，即重复该过程一次，从而使肽链不断延伸。
4．终止和肽链的释放
当mRNA模板上出现终止密码子，不能被tRNA所识别，但可被释放因子（RF1、RF2、RF3）所识别，肽链合成终止。在释放因子的作用下将合成的肽链从核糖体释放，并促使大小亚基解离及与mRNA模板脱离。
四、真核生物蛋白质生物合成
1．合成起始
真核生物蛋白质合成起始过程中需要蛋氨酰-tRNA、GTP、ATP和12种eIF参与。
（1）、起始氨基酰-tRNA与GTP和eIF2形成复合物，然后与40S亚基结合形成前复合物。
（2）、在起始因子的作用下消除mRNA 5’端非翻译区的二级结构，40S起始复合物与mRNA结合。
（3）、40S起始复合物由mRNA 5’帽子处沿非翻译区移动，直到第一个AUG处。起始氨基酰-tRNA识别起始密码子。
（4）、40S起始复合物在AUG处正确定位后，起始因子从40S亚基上解离下来。60S亚基与40S亚基结合形成80S起始复合物。
2．肽链的延伸
真核生物普遍存在延伸因子eEF-1、eEF-2，真菌中还有eEF-3。
eEF-1有单体和多聚体两种，单体的功能与原核生物的EF-Tu类似，多聚体的功能与原核生物的EF-Ts类似，eEF-2的功能与EF-G的相似。
肽链的延伸过程与原核生物类似，在eEF的参与下通过进位、肽键形成和移位三步反应循环进行，使肽链不断延长。
3．合成终止
真核生物有一种释放因子——eRF，能识别三种终止密码子。当核糖体移到终止密码子时，由于没有氨基酰-tRNA能识别，eRF因子识别终止密码子，并与之核糖体结合形成复合物，引起肽链释放，核糖体与mRNA解离，肽链延伸终止。
原核生物与真核生物蛋白合成的区别：
（1）、起始因子不同
原核生物：IF-1无专一功能，可增加IF-2、IF-3的活性；IF-2使起始氨基酰-tRNA选择性地与30S亚基结合，需要GTP；IF-3使30S亚基与mRNA起始部位连接，具有解离活性，使亚基保持解离状态。
真核生物：eEF-1无专一活性，参与多个步骤；eEF-2被GTP活化，使起始氨基酰-tRNA与40S亚基结合；eEF-2A参与起始tRNA与核糖体的结合；eEF-3促进核糖体解离成40S和60S亚基；eEF-4A与mRNA结合，具有解旋酶活性；eEF-4B刺激eEF-4F和eEF-4A的活性；eEF-4C促进40S亚基与mRNA及60S亚基的结合；eEF-4D功能不详；eEF-4F识别mRNA的帽子结构；eEF-5释放起始因子，结合60S亚基与核糖体；eEF-6保持60S亚基的解离状态。
（2）、起始复合物形成过程不同
原核生物；起始复合物为70S，由50S和30S亚基组成。起始tRNA为甲酰氨基酰-tRNA，需三种起始因子参与。起始复合物的形成顺序为：30S亚基与mRNA结合、起始tRNA与30S-mRNA复合物结合、40S亚基与30S亚基结合形成70S起始复合物、mRNA起始密码子前有起始序列。
真核生物：起始复合物为80S，由40S和60S亚基组成。起始tRNA为蛋氨酰-tRNA，需12种起始因子参与。起始复合物的形成顺序为：40S亚基与起始tRNA结合、40S-起始复合物与mRNA结合、60S亚基与40S亚基结合形成80S起始复合物。起始密码子前无前导序列。
（3）、延伸因子不同
原核生物：有三种。EF-Tu促进氨基酰-tRNA进入A位；EF-Ts促进GDP与GTP交换；EF-G促进移位反应。
真核生物：有两种。eEF-1单体与EF-Tu功能相似。eEF-1聚体与EF-Ts功能相似，eEF-2促进移位效应。
（4）、释放因子不同
原核生物：有三种。RF-2可识别UAA、UAG；RF-2可识别UAA、UGA；RF-3有刺激RF-1、RF-2的作用。
真核生物：只有一种。RF可识别三种终止密码子。
（五）蛋白质合成后的处理加工
1．肽链中氨基酸残基的共价修饰
包括乙酰化、甲基化、磷酸化、转氨基化、糖基化等。
2．除去N-端起始氨基酸
成熟的蛋白质N-端大部分不是起始的蛋氨酸或甲酰蛋氨酸，必须在相应酶的催化下除去。
3．信号肽的切除
在原核生物和真核生物中合成的蛋白质N-端都有一长为15-30氨基酸的信号肽，形成发夹状α-螺旋结构，在内膜表面的信号肽酶作用下切除信号肽。
4．肽链的折叠
肽链合成没有结束时折叠便已开始，三级结构的形成和肽链合成的终止同时完成。
5．切除前体中功能不必须肽段
合成的蛋白质前体中有些是功能不需要的肽段，在专一性蛋白水解酶的作用下，切除多余的肽段。
6．二硫键的形成
两个Cys的巯基氧化形成二硫键。
7．多肽链N端和C端的修饰
有些蛋白质合成后多肽链N端可被乙酰化修饰，C端被酰胺化修饰等。
六）、蛋白质生物合成的抑制剂
主要是一些抗生素如四环素、链霉素、氯霉素、红霉素、嘌呤霉素等。
五、基因表达的调控
在生活中并非所有的基因都一起表达，在特定的细胞或特定的时间内，许多基因都被关闭，只有少数基因被表达，决定某个特定基因是否表达的过程即基因表达的调控。
（一）概述
1．顺式作用元件和反式作用因子
基因活性的调控主要通过顺式作用元件与反式作用因子相互作用而实现。
顺式作用元件是对基因表达有调节活性的DNA序列，其活性只影响与其自身同处在一个DNA分子上的基因，这种DNA序列通常不编码蛋白质，位于基因旁侧或内含子中。
反式作用因子：通常是蛋白质，其编码基因与其识别、结合的靶核苷酸序列不在同一个DNA分子上，其作用是合成场所扩散到其发挥作用的其他场所。
2．结构基因和调节基因
结构基因是编码蛋白质或RNA的任何基因，其编码的蛋白质有结构蛋、酶和调节蛋白。
调节基因：参与其他基因表达调控的RNA和蛋白质的编码基因。
调节基因编码的调节物通过与DNA上的特定位点结合控制转录。调节物与DNA特定位点的相互作用能以正调控的方式调节靶基因，也能以负调控方式调节靶基因。
3．启动子和终止子
位于转录单位开始和结束位置上的序列为启动子和终止子。启动子位于基因转录起始点的上游，负责基因转录的起始。终止子终止基因的转录。
启动子和终止子是受同一类反式作用因子识别的顺式作用元件。
4．操纵基因和阻抑蛋白
阻抑蛋白阻止基因的表达，与操纵基因结合。
操纵基因与启动子相邻，是阻抑蛋白的靶位点。当阻抑蛋白与操纵基因结合时会阻止RNA聚合酶启动转录，基因表达被关闭。
5．转录子
参与转录正调控的反式作用因子是转录因子，转录因子是转录起始过程中RNA聚合酶所需的辅助因子。
在真核生物无转录因子时基因处于无活性状态，RNA聚合酶不能启动转录，转录因子在启动子附近有作用位点，转录因子与其作用位点的结合启动RNA聚合酶转录。
（二）原核生物基因表达的调控
1．乳糖操纵子
（1）乳糖操纵子模型
乳糖操纵子由调节基因、操纵基因和3个结构基因组成。结构基因z、y、a分别编码β-半乳糖苷酶、β-半乳糖苷透性酶和碱性半乳糖苷转乙酰基酶。
诱导物存在时三种酶水平增加，乳糖可自身乳糖操纵子。
（2）、乳糖操纵子调控
调节基因的产物是大分子阻抑蛋白，活性形式的阻抑蛋白可与DNA上的操纵基因结合，阻断转录。
阻抑蛋白上有诱导物结合位点，可结合诱导物。阻抑蛋白与诱导物结合后使阻抑蛋白失活，降低与DNA的亲和力，使结构基因转录。
乳糖及相似的诱导物可与阻抑蛋白结合，诱导结构基因的转录，这种调节是负调控。
（3）、葡萄糖对乳糖操纵子的调控
在含葡萄糖和乳糖的培养基中大肠杆菌首先利用葡萄糖作为能源，用完葡萄糖后激活乳糖操纵子，从而利用乳糖继续生长，这是一种转录激活过程。当葡萄糖水平低时，通过细胞内cAMP来实现控制。
当葡萄糖水平低时，cAMP水平升高，通过与CRP结合后增强了与DNA特定位点的亲和力，cAMP-CRP复合物与DNA上的特定位点结合，激活乳糖操纵子，从而促进转录。
2．SOS调节子
一系列受同一机制调节不相连接的基因称调节子。
SOS调节子中的控制成分是LexA和recA基因的产物。RecA蛋白在重组过程中刺激DNA链配对，参与重组修复。LexA是一阻抑蛋白，能与E.coli基因组中至少15种不同的操纵子结合，每个操纵子控制一个或多个蛋白质的转录，从而帮助细胞应答环境的伤害。这些蛋白质有的参与切割修复，有的参与控制细胞分裂。
在健康细胞中LexA和RecA表达的很少，有足够的LexA蛋白关闭SOS基因的合成。损伤后单链DNA引发SOS系统激活，RecA与裂口处结合，激活蛋白水解。细胞内LexA含量下降，解除了LexA对recA转录的阻碍。
3．色氨酸操纵子
色氨酸操纵子由启动子-操纵基因调节区和5个结构基因组成；调节区的前面有一个编码阻抑蛋白的trpR基因，在结构基因的前面有一个前导区，其内含有弱化子序列。
色氨酸可与阻抑蛋白结合形成复合物，是阻抑蛋白的活化形式，它与操纵子结合，阻断转录。
当细胞内色氨酸浓度低时，色氨酸-阻抑蛋白复合物解离，释放阻抑蛋白，阻抑蛋白离开操纵基因，激活转录。
当细胞内浓度高时，弱化子序列内形成茎环结构的转录终止子，转录在此处终止。
trpR系统和弱化子系统在不同细胞内色氨酸水平上发挥的作用不同，色氨酸浓度低时，以阻抑蛋白-操纵子相互作用调控为主，而色氨酸浓度高时，以弱化作用调控为主。
4．原核生物基因表达与翻译水平的调控
（1）反义RNA调控
反义RNA是以DNA编码链为模板转录出的RNA，能与mRNA配对，从而抑制mRNA的翻译。能控制一些原核和真核基因的表达。
（2）应急应答调控
细菌细胞环境中营养缺乏时采用应急应答调控，如当氨基酸缺乏时，从ATP和GDP合成一种新的化合物——5’-二磷酸-鸟苷-3’-二磷酸(ppGpp)、ppGpp可抑制操纵子转录的起始，使转录减慢。
（3）对mRNA半衰期的调节
原核生物mRNA的半衰期约为2-3min，许多因素可影响mRNA的半衰期，从而影响基因表达。降解速度决定mRNA半衰期的长短，mRNA的降解由3’外切核酸酶来完成。
（4）mRNA分子内二级结构对翻译的影响
mRNA本身的二级结构可通过影响翻译过程而调控基因的表达。
（5）蛋白质合成的自体调控
细菌内有些蛋白质能控制自身mRNA的可翻译性，这些蛋白质在mRNA上有结合位点，可控制翻译的起始或提前终止翻译来调控。
（三）真核生物基因表达的调控
真核基因表达的调控主要是转录起始水平的调控。
1．染色体水平上的基因活化调节
基因被转录激活后正常的染色体结构被打乱。转录前染色体结构发生变化是基因转录的前提。染色质由紧密的压缩状态“开启”为可转录的疏松结构，这种疏松结构的形成与DNA的结构、组蛋白的修饰及其他DNA结合蛋白的利用有关，其中主要是组蛋白的磷酸化和核心组蛋白的修饰。
2．基因转录的顺式调节元件
（1）启动子
RNA聚合酶II的启动子有含TATA盒的典型启动子和不含TATA盒的非典型启动子两种。
A、TATA盒启动子：有TATA盒的典型启动子是上游启动子和增强子产生诱导效应所必需的。有时一个基因上串联着两个TATA盒，可分别对不同的诱导物作出应答。在某些情况下，也参与组织特异性的选择。
B、非典型的启动子：少数基因没有典型的TATA盒启动子序列，有的无TATA盒启动子的序列富含GC盒，有的没有GC盒。
①富含GC，无TATA盒的基因转录
这种基因转录起始是不规则的，只有基础水平表达。持家基因是维持细胞正常结构、基本生命活动所需的蛋白质的编码基因。5’上游没有TATA盒，只有富含GC的序列，其中常有一个以上对基础转录的活化有主要作用。SP1结合位点有多个转录起始点。
②无TATA盒、GC盒的基因转录
TATA盒与转录起始子是决定转录起始位点的关键序列，在转录起始子上游加入TATA盒或GC盒可明显提高转录起始子的转录效率。
（2）增强子
增强子是真核细胞中通过启动子来增强转录的一种远端遗传性控制元件，可位于基因的5’-端、3’-端或基因内的内含子区，跨度为100-200bp。同启动子一样由多个独立的、具有特征性的核苷酸序列组成。
①增强子的特性：A、提高同一条DNA链上靶基因的转录效率；B、对同源或异源基因同样有效；C、位置可在基因5’上游、基因内或3’下游序列中；D、在DNA双链中没有5’与3’固定的方向性；E、可在远离转录起始点起作用；F、具有组织或细胞特异性；G、活性与其在DNA双螺旋结构中的空间方向性有关。
②增强子作用的机制
有三种方式：A、影响模板附近的DNA双螺旋结构，以蛋白质之间的相互作用为媒介形成增强子与启动子之间“成环”连接的模式活化转录；B、将模板固定在细胞核内特定位置，有助于DNA拓扑异构酶改变DNA双螺旋结构的张力，促进RNA聚合酶在RNA链上的结合和滑动；C、增强子区可以作为反式作用因子或RNA聚合酶进入染色体结构的“入口”。
③增强子的种类：细胞特异性增强子、诱导性增强子。
（3）沉寂子：是一种负调控元件，参与基因表达的负调控。
（4）转座元件：由于转座元件的插入会带来新的DNA结合蛋白的特异性序列及其结合位点，这些序列可以增强子的方式远距离调控。
（5）调控应答元件
受同一机制控制的基因有转录因子识别的类似的启动子元件，使基因应答此类因子的元件称应答元件，如热激应答元件、糖皮质激素应答元件、血清应答元件等。
应答元件含有保守序列，不同基因中的应答元件拷贝数很接近，但不完全相同。应答元件可位于启动子内，也可位于增强子内。基因受识别启动子或增强子中序列的特定蛋白质调控，这种特定蛋白质起转录因子的作用，是RNA聚合酶启动转录所必需的。
3．反式作用因子家族与其DNA结合结构域
同一类序列特异性调节因子一般由多基因家族编码特定的蛋白质结构，与具有保守性、序列相关的一组应答元件相结合。这些既有蛋白质结构同源性，又能结合相应特定序列的蛋白质称反式作用因子家族。反式作用因子序列中的基序都与DNA结合，基序通常很短，仅为蛋白质结构中的一部分。
（1）类固醇受体：是一组功能相关的蛋白质，每个受体都经与特定的类固醇结合而得到激活。
（2）锌指结构：锌指结构基序含一个DNA结构域。
（3）螺旋-转折-螺旋：一个螺旋位于DNA大沟内，另一个位于所穿过程DNA的一角。
（4）螺旋-环-螺旋：螺旋具有两亲性，一侧为疏水面，另一侧为亲水面。以二聚体形式与DNA结合，结合部位为碱性区。
（5）、 亮氨酸拉链：以二聚体形式与DNA结合。
可诱导的转录因子的调控方式：
（1）、合成转录因子：这种转录因子是组织特异性因子，可在特定细胞内合成。
（2）、修饰：一种因子的活性可通过修饰直接控制。
（3）、结合配基：一个因子的活性可通过结合配基而进行激活或抑制。
（4）、切割释放出转录因子：蛋白质被切割形成转录因子的活性形式。
（5）、抑制剂释放：转录因子在细胞内有时被抑制剂抑制。
（6）、与不同伴侣形成二聚体：转录因子有两个伴侣分子，无活性的伴侣分子可使它失活。
4．锌指结构——一种DNA结合结构域
锌指结构中保守氨基酸的小基团与锌离子结合形成蛋白质中相对独立的结构域。
锌指蛋白和类固醇受体具有锌指基序。
（1）、锌指蛋白：其基序根据锌结合位点凸出的氨基酸环命名，如Cys2/His2锌指。锌位于保守的Cys和His残基形成的四面体结构中，锌指本身约含23个氨基酸，锌指间通常有7-8个氨基酸。锌指结构通常串联重复排列在一起，有多个锌指存在，锌指的数目不等。
锌指与DNA结合时，每个锌指的C-端形成α-螺旋与DNA结合，N-端形成β-折叠，α-螺旋伸展进入DNA大沟，每个螺旋与DNA形成两个基序特异性接触，C-端的非保守性氨基酸负责识别特异的结合位点。
（2）、类固醇受体
类固醇受体锌指结构为Cys2/Cys2锌指，此类蛋白质中锌指是不重要的，DNA的结合位点较短，呈回文结构。此锌指结构中每个Cys四面体中央都有一个锌原子，两个锌指结构形成α-螺旋，再折叠成一个大球形结构域。α-螺旋的芳香侧链与连接两个螺旋的β-折叠一起形成疏水中心。螺旋的N-端与DNA大沟接触。
5．mRNA前体的选择性剪接
真核细胞中一个基因的mRNA前体分子中某个内含子5’的供点在特定条件下与另一个内含子的3’受点进行剪接，从而同时删除两个内含子及其中间全部外显子或内含子，这种按不同方式对mRNA进行的剪接称选择性剪接。
来自一个基因的mRNA前体因选择性剪接而产生多中mRNA，翻译出不同的蛋白质或组成一组相似的蛋白质家族。
选择性剪接的方式可因mRNA前体的外显子或内含子DNA序列中发生突变、缺失，影响5’、3’剪接点的数目和位置。
在锥虫、线虫及植物的叶绿体中还发生反式剪接，这种剪接发生在两个RNA分子之间，以两个不同来源的RNA分子前体为底物，经过剪接在成熟的mRNA非翻译部分5’端拼接一小段剪接前导序列的RNA片段，这些片段并不存在于相应的编码基因前面，而由其他DNA链转录而来。
6．RNA编辑
是在RNA分子上出现的一种修饰现象，主要指mRNA在转录后因插入、缺失或核苷酸的替换改变了DNA模板来源的遗传信息，从而翻译出氨基酸序列不同的多种蛋白质。
RNA编辑的机制主要包括核苷酸的替换，如C-U替换、A-I替换、读码框架的改变、向导RNA等。
7．mRNA稳定性的调控
真核生物mRNA的稳定性取决于分子内本身的结构特征、转录后修饰和所形成的RNP中蛋白质的种类。
真核生物mRNA比原核生物稳定，其核细胞中持家基因的mRNA的寿命较长，有些蛋白质的mRNA寿命较短。
mRNA寿命的延长增加了细胞内某种mRNA的有效浓度，提高了蛋白质合成的速度，这种翻译水平的调控方式称翻译扩增。
8．翻译的调控
翻译因子的磷酸化调控、酵母mRNA翻译的调控、转铁蛋白mRNA翻译的调控。
第四讲 基因工程的原理
基因工程是指在体外按既定的目的和方案，将一目的基因片段与载体结合，构成DNA重组体，然后引入受体细胞，随细胞繁殖而扩增，同时也可进行基因表达，产生特定的基因产物或新性状的遗传物质的技术。
基因工程又称遗传工程、DNA重组技术、DNA克隆或分子克隆技术。
一、工具酶
基因工程中应用的一些酶类称工具酶，如限制性内切核酸酶、DNA连接酶、DNA聚合酶I、碱性磷酸酶、S1核酸酶、逆转录酶、末端转移酶、T4多核苷酸激酶。
1、限制性内切核酸酶
是一类能识别双链DNA分子中特定核苷酸序列，限于切割其序列之间的键的核酸内切酶，主要发现于微生物中。
根据限制酶的结构，所需辅助因子及裂解DNA方式的不同，将其分为三型，用I、II、III表示。
（1）、限制酶的特性
三型限制酶都能切割双连DNA，有特定的识别序列和切割位点，催化反应都需Mg++参与等共同特性。
I、III型酶兼具限制和修饰两种特性，I型酶的识别位点与切割位点不一致。I、III型已很少应用。目前使用的主要是II型酶。
1）、识别特异性
a、识别序列具有纵轴对称结构或称回文序列，如EcoR I的识别序列。
酶的识别序列长度为4-6个核苷酸。四核苷酸识别序列的限制酶在DNA链上的切点多，产生片段数目多，长度短，酶的特异性较低；六核苷酸识别序列的限制酶在DNA上的切点少，酶的特异性强。
2）、第二活性
在非标准反应条件下，某些酶能切割与其特异性识别序列类似的序列，这种现象叫限制酶的第二活性，也叫星号活性。具有星号活性的酶常在该酶名称前加以星号（*）表示。
3）、切割位点及酶切片段的末端结构
限制酶切割的靶位点位于识别位点内或附近。切割时水解3’-5’-磷酸二酯键的3’方向的磷酸二酯键，产物的5’为磷酸单酯基团，3’为游离-OH。
切割后能形成良种末端，平头末端和粘性末端。在对称轴上切断产生平头末端，在对称轴左右对称点交错切割产生粘性末端。粘性末端有5’粘性末端和3’粘性末端两种。从5’端切产生5’粘性末端，从3’端切产生3’粘性末端。
有些酶有相同的识别序列，但有不同的切割位点；有些酶识别序列和切割位点都相同；有些酶有不同的识别序列，但切割后产生相同的粘性末端。
能产生相同粘性末端，而识别特异性不同的限制酶称同尾酶。
4）、识别序列的甲基化与限制酶活性
甲基化酶能使特异识别序列甲基化，保护该序列不被相应限制酶切割。
（2）、限制酶切图谱测定
限制酶切图谱称DNA物理图谱，是指某种DNA分子的限制酶切位点数目、片段长度和排列顺序的图谱。
常用的测定方法是部分酶解法和双酶水解法。
A、部分酶解法
选用某种限制酶将DNA分子完全水解，然后用电泳的方法测定完全酶解后片段的数目和整个片段的分子量。再用同一种酶对此DNA进行酶切，测定酶解片段的分子量。将酶切片段的分子量与完全酶解片段的分子量进行比较，排列出各片段的排列顺序及酶切位点。如用Alu1完全水解1030bp的线性DNA分子，完全水解时切成750、150、80、50bp四个片段；部分酶切时得到800、2230、130bp三个片段，然后将这些片段重叠比较，推断出完全酶解四个片段的顺序为150-80-50-750。
B、双酶水解法
选用两种限制酶分别对DNA分子进行完全水解，电泳分离求出各片段的分子量，然后再用这两种酶同时对此DNA分子进行完全水解，电泳分离后求出其分子量，分析两次结果的重叠情况，画出酶切图谱。
2、DNA连接酶
DNA连接酶催化相邻的5’-磷酸基和3’-OH间形成磷酸二酯键，使双链DNA单链缺口封合。
主要使用的有E.coli连接酶、T4噬菌体DNA连接酶，即T4连接酶。E.coli连接酶可实现粘接，T4连接酶可进行粘接和平接。
3、碱性磷酸酶
催化DNA和RNA 5’-磷酸基水解，产生5’-OH末端。目前使用的有两种：BAP和CIP，BAP耐热，CIP特异性强。
4、DNA聚合酶I Klenow片段
Klenow片段是DNA聚合酶I羧基端大片段，具有DNA聚合酶和3’到5’外切酶活性，主要用于平端连接。
二、基因工程基本过程
包括目的基因的制备、基因载体的选择、DNA重组、DNA重组体的转化、重组体的筛选和鉴定、外源基因的表达等。
1、目的基因的制备
目的基因可以是含基因的DNA片段，也可以是不含多余成分的纯基因。
（1）、直接从染色体中分离
先分离细胞基因组DNA，然后进行特异性的限制酶解或非特异性的随机切断。随机切断包括机械的、化学的及非特异性的酶降解。
（2）、人工合成
小分子多肽或蛋白质基因直接用化学合成即可制备，大分子蛋白质基因先合成特定的序列片段，再通过DNA连接酶催化连接。
（3）、逆转录合成cDNA
从mRNA到cDNA，对未知基因可先用此方法建立cDNA文库，再筛选目的基因。
建立cDNA文库的主要步骤包括：提取总RNA、分离mRNA并分级富集、逆转录合成第一链cDNA，再用Klenow片段合成第二链，得到双连DNA，连接于载体中并转化。
在分子克隆中cDNA文库比基因文库更有用。
（4）、构建基因文库，钓取目的基因
基因文库是含有某种生物体全部基因的随机片段的重组DNA克隆体。
构建基因文库时一般先建大片段的基因文库，再将已克隆的大片段剪切为小片段，然后再进行亚克隆。
（5）、聚合酶链反应制备特定基因
2、DNA重组
指外源DNA片段与载体DNA连接的过程。
DNA分子间连接的原则：
A、实验步骤简单易行；
B、连接点能被限制酶重新切割而便于回收插入片段；
C、有利于重组，避免载体自身环化；
D、对复制表达过程无干扰。
（1）、粘性末端连接
DNA分子的粘性末端有互补粘性末端和非互补粘性末端。互补粘性末端可直接进行连接，连接前用磷酸酯酶将载体的5’-端去磷酸化以减少载体的自身环化；非互补的粘性末端不能直接连接，经修饰成平头末端或部分平头末端，再进行连接。
（2）、平端连接
平端连接可用T4连接酶直接进行连接，连接后可产生一个新的酶切位点而有利于重组子的筛选鉴定。但其连接效率较低，常对平头末端进行改造，进行同聚物加尾，加上衍 或接头再进行连接。
（3）、定向克隆
使外源DNA按既定方向插入载体DNA分子中的过程叫定向克隆。
一般是利用外源DNA分子和载体DNA末端两种形式。一种是两端为非同源的互补粘性末端，另一种是一侧为互补粘性末端，一侧为平齐末端。
定向克隆能有效防止载体自身环化，提高连接效率。
（4）、人工接头连接
A、连接子：人工合成两条完全互补的寡聚脱氧核糖核苷酸，长8-12bp，内有一限制酶位点，与外源DNA片段连接后用限制酶产生粘性末端，再与同一限制酶分割后的载体连接。适用于平头末端的改造和连接。
B、适配子：是一条人工合成的寡聚脱氧核糖核苷酸，与另一适配子互补配对形成双链后具有突出的某种粘性末端，与外源DNA连接后产生粘性末端，再与载体连接。
（5）、多聚核苷酸连接
又叫同聚物加尾。在外源DNA和载体DNA分子中，分别加上多聚脱氧腺苷或多聚脱氧胸苷，根据dA/dT、dC/dG互补在连接酶作用下连接起来。
3、将DNA重组体导入宿主细胞
将质粒或重组质粒导入宿主细胞的过程叫转化；以噬菌体、病毒为载体构建的重组体导入细胞的过程叫转染；以噬菌体为媒介将外源导入细菌的过程叫转导。
不同的宿主，转移DNA的方法不同：E.coli：用CaCl2处理或电激法导入；酵母：原生质体或乙酸锂法转化；动物细胞：磷酸钙、DEAE、葡聚糖、原生质体、电穿孔法、显微注射法等。
（1）、用CaCl2处理进行转化
受体细胞应具有的条件：a、接受外源DNA的能力；b、限制酶缺陷型；c、重组缺陷型；d、使外源DNA复制；e、表达重组子提供的表型；f、非培养条件下难以生存。
转化的过程包括：用CaCl2处理E.coli，将重组体导入E.coli两步。
（2）、λDNA的体外包装
体外包装是指离体条件下将提取的包装蛋白与带COS位点的DNA混合产生噬菌体的过程。
λ噬菌体的包装是指λ噬菌体未成熟为感染颗粒时，其头部蛋白先组装成一个中空的头部前体，然后λDNA塞入其中，形成λ噬菌体基因组文库。
λ噬菌体的体外包装技术常用于构建cDNA文库和真核基因文库。
4、DNA重组体的筛选和鉴定
从转化的细胞中筛选出含重组体的细胞，并鉴定重组体的正确性是分子克隆的最后一道工序。
（1）、根据重组体的表型进行筛选（又叫遗传检测法）
A、利用载体提供的表型筛选
分子克隆载体携带的遗传标志包括抗药性标志、营养标志、报道基因标志等。
①利用基因插入失活是常用的筛选方法，当抗生素性基因前有一类调控序列时，可用插入该序列外源片段进行插入表达筛选。
②利用β-半乳糖苷酶显色反应进行筛选。
③利用病毒载体的标志基因进行筛选。
④用报道基因与哺乳动物启动子融合，测定基因表达和转染效率。
B、利用插入序列提供表型特征进行筛选
外源基因能对宿主细胞所具有的突变发生体内互补体反应，使转化子表现外源序列中基因编码的表型特征。
（2）、检测目的基因或相应的基因产物
A、核酸杂交
是根据同源性的两条核酸单链在一定条件下按碱基互补原则形成双链，其中一条链为探针，用于检测未知核酸片段。
①核酸杂交可分为DNA：RNA杂交；DNA：DNA杂交。
②检测DNA用Southern杂交，检测RNA用Northern杂交。
③杂交方法有膜上印迹杂交、斑点杂交、菌落原位杂交等。
④杂交常用的支持物有：硝酸纤维薄膜、尼龙膜、化学活化膜、滤纸等。
⑤杂交探针有基因组探针、cDNA探针、RNA探针、寡核苷酸探针等。
⑥探针的标记分为放射性标记和非放射性标记。放射性标记同位素有32P、3H、35S等；非放射性标记有生物素、地高辛、光敏生物素、辣根过氧化物酶、碱性磷酸酶等。
⑦标记方法有切口平移法、随机引物法、化学交联法等。
⑧把待检核酸转移到支持物上的方法有毛细管法（印迹法）、电转移法、真空转移法等。
B、利用免疫学方法筛选
免疫沉淀、酶联免疫吸附、固相放射免疫、免疫荧光抗体、Western杂交等。
Western杂交是将电泳分离后的蛋白质转移到硝酸纤维薄膜后，先用目的基因产物的抗体与之反应，再用标记的抗体检测。
C、翻译法筛选
影响特定mRNA在体外翻译体系中的翻译来筛选的方法分为阻断翻译杂交法和释放翻译杂交法。
a、阻断翻译杂交法
用转化菌落提取重组DNA，经变性后与未分级分离的mRNA杂交，回收核酸进行体外翻译，通过电泳与未经杂交mRNA体外翻译产物比较，这样目的基因编码的蛋白质由于翻译被抑制而筛选。
b、杂交释放翻译法
先将克隆DNA结合于硝酸纤维素滤膜上，再与未分级的mRNA或总RNA杂交，洗脱结合RNA进行体外翻译，用电泳和放射后自显影分析鉴定翻译产物。
D、物理筛选法
重组DNA与载体DNA电泳比较、R-环检测、限制酶切图谱法等。
三、基因载体的选择
载体是携带外源DNA片段进入宿主细胞进行扩增和表达的工具，其本质是DNA。常用的载体有质粒、噬菌体和病毒等。
1、质粒
质粒是染色体外能自主复制的双链闭环DNA分子。常用的质粒是来自E.coli 经过改造的质粒，如pBR322、pUC系列、pSP系列、pGEM系列等。
质粒一般克隆较小的外源DNA片段，用于基因工程的质粒应具备的条件：
①能高效地独立自主复制：质粒复制与宿主细胞的繁殖无关，在细菌染色体 DNA停止复制时，质粒仍可继续复制。
②有可供选择的标志，最好是双重标志：常用的标志有氨苄青霉素抗性基因，四环素抗性基因和E.coli的lac Z基因等。
③同一种限制酶只有一个切点，在复制子以外的适当部位，便于外源基因的插入。酶切位点最好位于筛选标志基因内部。
④分子量尽可能小，拷贝数多，一般在5kb左右，质粒较小，较稳定。
2、λ噬菌体
λ噬菌体是感染细菌的病毒。基因组是双链线性DNA，两端各有一个单链互补粘性末端，称cos位点。进入宿主细胞后粘性末端互补结合，形成环状DNA分子。
野生型λ噬菌体的基因组复杂，限制酶切位点多，不宜做基因载体。目前使用的是对其进行改造后构建的载体；一类是插入型载体，只有一个酶切位点，如λgt系列；另一类是替换型载体，有两个酶切位点，如EMBL3和EMBL4。
λgt系列常用于构建cDNA文库，EMBL系列常用于构建DNA文库。
3、粘粒
是一种特殊的质粒。在E.coli中以双链环形存在，含有ampr抗药性标志和复制起始点，有一个或多个酶切位点，具有cos位点。
4、M13噬菌体
是一种丝状单链噬菌体，在E.coli中以双链复制型存在。
M13噬菌体的特性：（1）、可包装大片段外源DNA；（2）、感染细菌后，复制环状单链DNA，经包装形成噬菌体颗粒，分泌到细胞外不产生溶菌。
改造后的M13mp系列特点：（1）、在M13基因4、2之间的间隔区可供外源DNA插入；（2）、有lac调控元件及lac Z作为选择标志；（3）、在lac Z氨基末端部位上连一个多位点接头，供克隆用。
5、动物病毒载体
上述4中载体：质粒、λ噬菌体、粘粒、M13噬菌体，只适合在原核生物中表达，不能在真核生物细胞中表达。用于真核生物基因表达的载体有猴病毒40（SV40），人类朊病毒，牛乳头状瘤病毒、逆转录病毒、疫苗病毒、昆虫杆状病毒等。
6、酵母质粒载体
目前应用的是酵母人工染色体构建的载体YAC系统，该载体可直接克隆大片段DNA，基因组包括端粒、复制起始点、筛选标志、核心序列及限制酶切位点。
7、载体功能分类
可分为克隆载体、穿梭载体和表达载体。
（1）、克隆载体
以繁殖外源DNA片段为目的，一般具有自我复制、克隆位点、筛选标志、分子量小、拷贝数多等特点。
（2）、穿梭载体
又称双宿主载体，可在两种不同宿主中复制。用于原核和真核细胞间的遗传物质转移。由原核序列和真核序列两部分组成，原核序列便于在E.coli中复制扩增；真核序列用于转染目的基因的真核细胞的筛选，并保证基因在真核细胞中表达。
（3）、表达载体
用来将克隆的外源基因在宿主细胞内表达蛋白质的。根据产生的蛋白质不同又分为融合型载体和非融合型载体。
四、基因表达
1、真核基因在E.coli中的表达
基因表达系统有原核表达系统和真核表达系统。目前广泛应用的是原核表达系统。
基因在原核表达系统表达应注意的问题：
（1）、要构建一个合适的或高效表达载体
原核表达载体的要求：
①有一个强的启动子及其两侧的调控序列；
②有SD序列及SD序列与起始密码子之间要有合适的距离；
③在克隆基因与启动子之间有正确的阅读框架；
④外源基因下游加入不依赖ρ因子的转录终止区。
（2）、编码基因要完整，没有插入序列；
（3）、将真核基因克隆到原核基因中，以保证产物表达的稳定性；
（4）、克隆基因中保留信号肽序列，使表达产物自细菌分泌到溶液中，有利于产物的分离纯化。
2、真核基因在哺乳动物细胞中的表达
由于在原核细胞中真核基因不能进行内含子的自我剪接，表达的蛋白质不能进行翻译后加工，不能进行正确折叠，使表达产物量少，活性低，因此目前倾向于用哺乳动物细胞表达系统表达大部分基因。
哺乳动物细胞表达真核基因应注意的问题：
（1）、根据研究目的选择合适的载体-宿主表达系统。
哺乳动物表达系统分为瞬时与稳定表达系统两类。瞬时表达系统用于根据产物活性来证实分离基因，从cDNA文库中筛选基因，诱变对蛋白质生物活性与功能的影响的分析等研究；稳定表达系统用于大量生产蛋白质产品。
（2）、选择合适的细胞系
不同的培养细胞系摄取和表达外源基因的能力相差非常大。同一基因在一种细胞系上有效，但在另一种细胞系中可能完全不表达。
（3）、外源基因
基因一般来自cDNA克隆或基因组。构建cDNA库时常引入辅助序列，基因表达是要去掉这些额外序列；基因组DNA不一定含有表达所需的调控序列，需要转换启动子或增强子；真核基因转录的起始密码子必须是转录物中的第一个起始密码子。
基因一般来自克隆或基因。
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发表于 2006-2-25 22:46:38
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楼主
发表于 2006-2-26 11:24:02
版主先生， 能否给大家一个舒心的面孔，所有人都得看着你这张难受的脸。实话实说了，
形象也是要加分的呦。
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