O78型鸭大肠杆菌的分离鉴定及免疫试验

xiaomeng_024

取菌种，用灭菌接种环致密划线于琼脂平板表面，用无菌镊子将各种抗菌药物圆纸片分别贴于培养基表面，各片距离要相等37℃培养24小时观察结果。

1.2.4
血清学鉴定

挑取麦康凯上的菌，以马丁肉汤扩大培养，121℃灭活30min,用禽源大肠杆菌O型单因子血清进行平板凝集反应。

毒力试验摘要：2008年从四川某鸭厂发生的以心包炎肝周炎为特征的病鸭群中分离获得1株革兰氏阴性杆菌，定名为SC-2008。经分离培养、形态学检查、生理生化试验、血清学鉴定、毒力实验，分离菌株被鉴定为O78型鸭大肠杆菌。用该菌株进行液体培养制备的油乳剂灭活疫苗，可使鸭获得较好的免疫力，能有效的预防本病的发生。

关键词：鸭大肠杆菌；鉴定；免疫

大肠杆菌可引起鸭败血性传染病，病鸭病变特征为心包炎、肝周炎、气囊炎等，近年随着规模化养鸭业的不断发展，鸭大肠杆菌病的发生有越来越严重的趋势，成为目前危害养鸭业最严重的传染病之一。

1材料与方法

1.1材料

培养基：麦康凯和改良马丁，自制；病鸭来源：四川；生化反应管：杭州微生物试剂有限公司

1.2方法

1.2.1
细菌学检查

根据临床症状、发病鸭剖检，主要病理变化有心包炎、肝周炎、胆囊充盈、全身败血症。无菌采取该鸭的脑和肝脏，常规处理，在麦康凯和改良马丁上划线，放入37℃培养箱培养24h，镜检后，挑选单个菌落,继续划线培养。挑取麦康凯平板上的单一菌落，按常规方法进行革兰氏染色。

1.2.2
生化试验

取细菌的纯培养物分别接于微量发酵管，37℃培养24小时，观察结果。

1.2.3
药敏试验

1.2.5

1.2.5.1
半数致死量

将菌液稀释至16×104CFU, 8×104CFU, 4×104CFU, 2×104CFU, 1×104CFU, 0.5×104CFU和 0.25×104CFU细菌，将19日龄肉鸭随机分成8组，每组5只，分别于腿部肌肉攻毒1ml/只，生理盐水设为对照组。

1.2.5.2
哺乳动物接种试验

	小鼠	豚鼠	兔子
剂量	10亿/只	100亿/只	1000亿/只
注射部位	腹腔	皮下	皮下
体重	30—35g	350—400g	1200—1500g

1.2.5.3
SPF鸡接种试验

取15只21日龄SPF鸡，随机分成三组，将菌液稀释成2.5×105CFU，1×106CFU，5×106CFU，肌肉注射，1 ml/只。

1.2.6
疫苗制备

1.2.6.1
菌液制备

将细菌接种到液体改良马丁培养基，于37℃摇床培养7h，活菌计数，将菌液加入4‰的甲醛于37℃灭活24小时，将菌进行无检、安检。

1.2.6.1
灭活疫苗的制备

取灭活后检验合格的菌液加吐温-80制成水相，与混合油相一起乳化制备灭活疫苗。

1.2.6.2
疫苗性状测定

对制备的油乳剂灭活苗进行物理性状检验、剂型试验、稳定性试验、有效期测定等。

1.2.6.3
灭活疫苗效力检验

用试制的疫苗皮下接种于5日龄健康易感肉鸭40只，0.3ml/只（含一个免疫剂量），于免疫后7d、10d、14d、28d，分别随机选取10只攻毒，另选10只未免疫做空白对照，攻50倍半数致死量的量，计算保护率。

2结果

2.1
菌体形态

接种麦康凯培养基平板上，37℃培养24小时，肉眼观察为粉红色，隆起，表面光滑边缘整齐的S型菌落。代次间菌落大小，光滑度，隆起度，色泽度，边缘整齐度肉眼看不出差别。涂片为革兰氏阴性，两端钝圆的杆菌。

2.2
生化试验

鸟氨酸（+）、甘露糖（+）、甘露醇（+）、木糖（+）、阿拉伯糖（+）、果糖（+）、山梨糖（+）、鼠李糖（+）、半乳糖（+）、棉子糖（+）、麦芽糖（+）、葡萄糖（+）、乳糖（+）、山梨醇（+）、水杨素（—）、七叶苷（—）、枸櫞酸（—）、硫化氢（—）、蔗糖（—）、木糖醇（—）、卫茅醇（—）、肌醇（—）、侧金盏（—）、明胶22℃（—）、糊精（—）、尿素（—）。从结果上看100%符合大肠杆菌的生化特性。

2.3
药敏试验

共做了38种药敏片，主要是氨基糖苷类敏感，其余都有或多或少的耐药性

有效果的主要为：

药物种类	多粘菌素B	头孢曲松	磷霉素	卡那霉素	新霉素
抑菌圈大小	1.1cm	2.0cm	1.65 cm	1.7cm	1.9cm
敏感度	中度敏感	中度敏感	敏感	中度敏感	敏感

2.4血清学鉴定

O78血清凝集为阳性

2.5动物攻毒

2.5.1半数致死量

经计算：LD50=0.37万/只，MLD=4万/只

2.5.2哺乳动物接种试验

攻毒16h小白鼠和豚鼠死亡，40h兔子死亡，兔子在攻毒16h体温平均升高2℃，对照健存。均出现皮下出血，肝脏出血，肠道出血，水肿，胶冻样，心脏冠状出血，肺脏出血，胰脏出血，胃出血。取肝脏和心脏细菌分离，均分出大肠杆菌。

2.5.3 SPF鸡接种试验

48小时均出现症状，注射1×106CFU，5×106CFU，鸡在96小时发生死亡，对照正常，剖检均有腿部肌肉出血，心包炎，肝周炎，肠道出血，肺脏出血，气囊混浊胆囊充盈，取肝脏和心脏细菌分离，均分出大肠杆菌。

2.6疫苗制备

2.6.1疫苗性状测定

该油苗为乳白色乳剂,剂型为油包水型。以3 000 r/min离心15 min,疫苗不出现分层现象；在

37℃左右条件下放置21 d，不破乳；2~8℃及室温存放6个月，基本不出现分层现象。保存期测定，2~8℃冷藏保存，有效期为1年；粘度测定时间为3.6 s，适于注射。

2.6.2免疫产生期和免疫持续期试验

免疫7d保护率即达到100%保护，对照鸭全部死亡。到28d保护率未发生变化。

3讨论

3.1对分离的细菌进行形态观察、生化试验及血清学鉴定为O78型大肠杆菌，据报道，与禽病有关的大肠杆菌最常见的是O1、O2、O35、O78等[1]。此株菌可用于制备流行株的疫苗。

3.2分离出大肠杆菌O78对鸭、鸡、小白鼠、豚鼠和兔子具有较高的毒力，在生物学上应引起重视。

3.3由于大肠杆菌带有可传导的抗药性质粒和菌株[2]，加上大肠杆菌病防治中，抗生素的普遍使用，使得大肠杆菌的耐药谱越来越宽，，防治效果越来越差；此外，药物防治的成本不断提高，并造成鸭胴体内药物残留而影响公共卫生[3]。因此应用药物治疗大肠杆菌病有一定的局限性。从结果可看出分离株的免疫原性很好，本试验制备的油乳剂灭活疫苗是针对某些地区的疫情而研制生产的，因而在使用过程中能在早期很快地形成群体免疫，具有针对性强、免疫期长的特点，且在使用时不存在散毒问题，安全、可靠。

3.4大肠杆菌是条件性致病菌，普遍存在于鸭群中，当环境改变和抵抗力下降时容易发生此病。因此建议根据当地流行株进行针对性免疫，平时还需要加强环境管理，此为长期预防大肠杆菌病的关键。

参考文献：

[1]
宋立,宁易宝,张秀英,等.中国不同地区禽大肠杆菌血清型分布和耐药性比较研究[J].中国农业科学,2005,38(7):1466-1473.

[2]
Van Den Bogaard , A E , N London , et al . Antibiotic resistance of faecal Escherichia coli in poultry , farmers and poultry slaughterers[J] . J Antimicrob Chermother , 2001 , 47 : 763-771.

[3]
Caya F , J M Fairbrother , L Lessard , et al . Characterization of the risk to human health of pathogenic Escherichia coli isolates from chicken carcasses [J] . J Food Prot , 1999 ,62 : 741-746.

[4] 李玲,汪铭书,程安春,等.雏鸭致病性大肠杆菌的分离鉴定药敏试验及耐药分析[J].中国兽医杂志,2007,43(12):34-36.

amypx

收藏啦