化验工作方法的验证

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检定方法的验证
一个实验室在建立一个新方法或第一次使用一个新方法时，都要对该方法的适
用性和可靠性进行测定，这就是验证。验证就是证明某一程序、生产过程、设备、
物料、活动或系统确实能达到预期结果的有文件证明的一系列活动(1)。WHO 在1992
年的GMP 中对验证的定义是能证明任何程序、工艺、设备、物料、活动、或系统确
实能导致预期结果的文件证明的行为（2，3）。
在我国GMP 文件中明确指出，药品生产验证包括厂房、设施及设备安装确认、
运行确认、性能确认和产品验证。因此，在使用前均应对检定方法、仪器、设施
系
统（如：空气、水、蒸汽）、工艺（如：生产工艺、清扫、灭菌、无菌分装、冻
干）
等进行验证。对于部分和整体的验证的要求是不同的，如对于冻干机的验证和冻
干
过程的验证是不同的；清扫玻璃器皿和清扫设施的验证也是不一样的；对灭菌过
程
和无菌试验也要采用不同的验证要求。对于一个过程来讲，对其中每一部分的验
证
应不同，如一个试验、试验中的试剂和仪器的验证要求是不同的。
一、 验证的分类
一般根据产品和工艺、方法的要求以及设备变更、工艺修订等特点可以把验证
分为4 种类型。
1.前瞻性验证：
前瞻性验证就是在方法正式投入使用前按照预定的方案进行研究，来收集实验
数据，以证实检定方法达到预期要求的行为。该验证方法是一种最好和常用的验
证
方法。
2.同步验证：
就是已经在生产中实施的某项工艺运行中同时进行的验证。在这种情况下验证
数据的收集来源于工艺的实际运行过程中，一般要通过几次运转才能获得足够的
数
据来证明工艺的可靠性。采用这种验证方式的先决条件是：
- 有完善取样计划，即生产及工艺条件的监控比较充分；
- 有经过验证的检定方法，方法的灵敏性及特异性/选择性比较好；
- 对所验证的产品或工艺已经有相当的经验及把握。
3.回顾性验证：
如果某一产品已经生产了很长一段时间，但没有按照前瞻性验证的要求进行过
验证，而又不能进行同步验证（如储备的原液可以使用几年或设备正用于其他的
用
途），此时可以采用回顾性验证。通过对产品、生产步骤和检验步骤进行检测和
分析，
以证明生产步骤和生产工艺的一致性和完整性。一般不采用这种验证方式。对于
检
定方法，如果有足够的数据也可以采用这种验证方式。
4.再验证：
当影响产品质量的主要因素，如工艺、质量控制方法、主要原辅料、主要生产
设备等发生改变时，以及生产一定周期后，应进行再验证。它是旨在证实已验证
状
态没有发生漂移，表明该工艺仍能达到预定的要求。
一旦一个系统或一个工艺得到了验证，在操作过程未发生改变时，则认为达到
了原定的要求。当发生改变、或出现错误、或更换设备或设备位置发生改变时，
则
需要进行再验证。
验证分三个级别(1)除建立方法的实验室外还有二个或二个以上的实验室进行验
证；(2)除建立方法的实验室外还有一个实验室进行验证；(3)只有建立方法的实
验室
进行验证。理论上讲所有的方法都应进行协作研究的验证，虽然做起来非常困难，
一般情况下也没有这样做，然而应朝这一方向努力。对于一个方法只需进行一次
验
证，如果对方法进行了修改或扩大了应用范围，都需要进行再一次的验证。
若采用体外法来代替体内的效力试验，则需要在一开始验证时就应测定一个低
效价的疫苗，以便在早期就确定此新方法可以区别合格的和合格线以下的制品。
验证实验也要证明在最差状态下操作时，系统仍能达到原预定要求。
二、检定方法的验证
检定方法的验证就是根据方法的需要测定该方法的准确性、精密性、直线性、
测定范围、测定限度、测量限度、特异性和耐用性（或可靠性）等几个指标中的
一
个或几个(4)。对于理化测定方法已有了确定的要求和判定标准（5-10），而生
物学
测定的结果具有更大的可变性，一般要使用动物或细胞，这些有机体本身就具有
较
大的可变性，因此生物学测定的要求和合格标准要松一些。
1．检定方法的种类
测定生物制品的方法一般可分为三大类，即结合试验、细胞测定试验和动物试
验，对某些复杂的方法同时需要以上二种类型的测定方法。
1）、结合试验：
是指包括2 个或多个分子间结合的实验。免疫结合即是一例，结合试验一般用
于纯化过程的监测或清洁的验证试验。由于在结合试验中测定的分子不一定都是
具
有生物活性的分子，所以它一般不用作制品的效力测定。一般讲结合试验结果的
变
化在5～20%间。
2）、细胞测定试验：
是指制品可以诱导细胞产生可测定的应答，如细胞聚集、裂解、融合或产生特
异的化学物质。细胞测定试验比结合试验具有更大的可变性，因此应精心操作以
保
证试验结果的一致性。细胞测定常用于制品的效力测定。一般讲细胞测定结果的
变
化在50%以上。
3）、动物试验：
更复杂并且包括饲养、管理和操作动物。它需要时间长并且具有更大的可变性，
一般测定一个药物的生物活性是通过与已知的标准品或未处理（未免疫）的动物
进
行比较而得。一般用于热原质、一般安全试验和效力试验。由于试验成本高，使
用
动物数目多费时和可变性大，因此动物效力试验一般用于成品签发时的测定。一
般
讲动物测定结果的变化在50%以上。
在验证过程中，应根据试验用途来确定验证哪些参数。WHO 和一些管理部门及
药典已经出版子许多关于分析方法验证的一些要求（4-10）。
一般国家检定实验室使用的检定方法分为以下4 种。
1)、标准方法：
是指已经被多家实验室进行了广泛的研究，尽管某些方法可能是一个比较老的
方法，但一般认为是最佳的实验方法。这类方法都进行了彻底的研究和验证。
2)、正式的方法：
是指政府部门或国际组织（WHO、国家管理当局或药典）要求国家检定实验室
使用的方法，这些方法在被确定为正式方法以前，也经过了适当的验证。
3)、来自参考文献的方法：
是指在专业杂志上发表并介绍的方法，一般要认真对待这类方法，并需要进行
彻底的验证。
4)、自己建立的方法：
是指为了提高检测方法或为了达到某一特定要求而开发的或对原方法进行了修
改的方法，这类方法需要进行严格的验证。
如果某实验室需要采用已经过彻底验证的标准方法和正式方法，在第一次应用
前需要进行验证以证时实验操作达到了要求。如果采用新开发的或修改了的方法
作
为常规检定方法，除需要进行一系列的验证外，同时还应考虑以下几个问题：
(1)该方法是否达到了特定的要求？
(2)该方法的灵敏性、重复性、准确性和精密性方面是否达到了要求？
(3)该方法在技术上是否要求很苛刻？
(4)实验室是否具有应用该方法的专业知识？是否需要培训？
(5)该方法是否需要特殊的设备？
(6)该方法是否造价很高？
(7)该方法是否需要时间过长？
2．验证时应考虑的问题
首行要确定方法的适用性，该方法首先可以得到可重复的、可信的实验结果，
要考虑在以下几个参数：准确性、精确性、灵敏性、特异性和耐用性（可靠性）。
第
二，要与已知的方法进行对比试验，以考查二者间的相互关系。
如果在该实验室内无可对比的老方法，则首先建立标准的方法，用含一定范围
浓度的样品进行测定，以标准方法所得结果作为标准，用统计学的方法进行对比
处
理，得出二种方法间的相关系数。对于一个新建立的方法则需要进行协作研究对
其
适用性进行验证。
3．验证中需测定的参数
验证实验中需对以下几个参数进行测定。
1）、准确性（accuracy）
表示测定值与真实值之间的一致性或接近的程度。一般采用填加和回收试验来
测定准确性，即将已知量的样品加到空白中进行测定，比较测定值与真实值之比。
准确性一般表示为偏差（bias）或测定值与真值之间的错误率（回收率）（即测
定值
/真实值×100%）。一般对于生物制品而言，因为没有纯的标准品，所以准确性
不太
实用。生物制品测定时一般与同时进行的参考品进行比较而得，此时的合格标准
一
般是测定出的参考品值的合格范围或样品与参考品之间的比值。
2）、精密性（precision）
表示测定值之间的一致性或接近的程度，一般表示为变异系数(CV%)，变异系数
即是测定值的标准差与测定值的比值。精密性分几种：一种是实验内的精密性（即
重复性 repeatability），它是在同一次试验内同一个样品多次测定结果间的变
异系数。
另一种是实验间的精密性（或叫intermediate precision），它是在同一实验
室内不同
次试验间对同一样品多次测定结果间的变异系数。实验室之间的精密性即重现性
(reproducibility)，一般可通过协作研究得到，此参数不适合生产设施的验证。
3）、耐用性（robustness/ruggedness）
是通过有效地改变实验方法的参数，来测定此改变对试验结果的影响，即实验
结果不受影响的承受程度。参数的改变可以是室温或培养温度，或湿度、或改变
培
养时间，或对试剂的pH 进行较小范围的调整等。在每种试验条件下，对准确性、
精密性、或其他参数进行测定，以确定试验方法的耐受或承受能力。
4）、直线性（linearity）
是测定结果与样品中测试物浓度的正相关性，该参数的测定将确定检测方法的
测量范围，它可以表示为回归直线的斜率和离散性，或者相关系数R 和测定系数
R2 。
5）、测量范围（Range）
是指当准确性和精密性都能达到要求时所能测得的样品中待检物的最高浓度，
它就是测定直线性的上限，如果剂量和反应间的关系不成直线，测量范围可以通
过
校正曲线来测得。
在《中华人民共和国药典》中规定测量范围是指能达到一定精密度、准确性和
直线性，测定方法适用的高低限度或量的区间（11）。
6）、选择性/特异性（Selectivity/Specificity）
是指当检测方法对测试样品中含有制品中应有的其他化合物时，测定待测物的
能力。本参数用于鉴别试验、浓度或效力试验和纯度试验的测定，以确定使用该
检
测方法所测定的结果是否准确地反映了制品的鉴别、效价或纯度。选择性（特异
性），
就象准确性一样，一般用偏差或测定值与已知值之间的错误率（%）来表示。
7）、测定限度（Limit of Detection）
是指能够测定出的样品中测试物的最低量。该量并不一定要定量测出其准确的
含量或浓度，它是检查限度实验中最重要的一个参数。
8）、测量限度（Limit of Quantitation）
是指在准确性和精密性都能达到要求时能够定量测定出的样品中测试物的最低
量。LOQ 是检查测定药品中不纯物方法的一个参数。
根据WHO 关于测定方法验证试验的文件，用于不同检定目的的实验方法需进
行不同参数的测定。下表给出了不同检定方法需验证的参数。
不同测定方法应进行的验证的参数
杂质检查 参 数 鉴别试验
定量 限度
效价测定 组成测定
准确性 + + +
精确性 + + +
耐用性 + + + + +
直线性和测定范围 + + +
选择性（特异性） + + + + +
测定限度 + +
测量限度 +
另外，由于生物测定的持续性、复杂性、以及参考品和样品贮存时间较长的特
性，除了上述验证参数外，对于生物测定有另外几个参数也非常重要，包括：
1)、试验顺序（front-to-back test）的影响：它是测定在一个较复杂的试验中，
先测和后测对试验参数的影响。这是由于它们相对于对照品的测定时间不一样而造
成的。
2)、冻融稳定性的影响：将样品反复冻融，以确定对测定结果的影响。
3）、批间的精密性：测定不同批细胞、血清、或其他具有较高变化性的物质对
测定方法精确性的影响。
4．验证实验中参数测定的具体操作和要求
1）、准确性：
对于某些尚无纯品的生物测定来说可能不适用。对于某些已达到敏感性和特异
性要求的方法来说可以不测定该参数。下述方法只适用于免疫分析。
目的：确定该方法测量预定值的能力。
步骤：至少配制3 个不同浓度填加到空白中的测试物
每一浓度配制2 份样品
每1 次试验对6 份样品重复测定3 次
比较测定值和真实值
求出回收率（%），即偏差
2）、精密性
（1） 试验内精密性
目的：确定在同一个试验内同一个样品在测量范围内的不同浓度时测定的精密
性。
步骤：配制3 个稀释度的样品（测量范围内的高、中、低浓度）
每一个稀释度重复测定10 份（同一试验内）
计算每一浓度测定结果的均值和SD
计算每一浓度的CV 值
（2） 试验间精密性
目的：确定在不同试验间对测量范围内同一个样品在不同浓度时测定的精密性。
步骤：配制3 个稀释度的样品（测量范围内的高、中、低浓度）
在3 个试验中对每一个稀释度重复测定3 份
测定不同工作日间的变化
测定不同批号的试验材料间的变化
测定不同实验员间的变化等等
计算每一试验中每一浓度测定结果的均值和SD
计算试验间每一浓度的CV 值
3）、测定限度
对于生物测定，LOD 就是产生始终如一的比空白对照强的反应的最低浓度。产
生比空白对照高2-3 个SD 的反应一般认为是满意的测定限度。下述步骤是以免疫测
定的OD 值作为例子。
目的：确定比空白对照高3 个SD 的值
步骤：配制一份适当浓度样品
配制一份不含样品的空白对照液（0 浓度）
按照SOP 至少测定3 次，每次要重复2 孔
测定样品和空白对照的OD 值
计算空白对照的SD 值
LOD=3×对照的SD 值/（样品OD/样品浓度）。
另外，在某些测定中采用2：1 或3：1 的信/噪比作为测定限度；若用标准误来表
示则为3.3SD/b，其中SD 为标准误，b 为对照样品线性回归的直线斜率。
测量限度采用10：1 的信/噪比；或10SD/b（12）。
4）、直线性和测定范围
目的：测定观测值的直线拟合度
步骤：在测量范围内配制6-8 个稀释度
每一稀释度测定3 次，每次重复测定3 份
计算每次试验的测定值、真值和回收率%
分析线性回归并计算每次试验的相关系数R
另一种方法：
计算每一稀释度的准确性和精密性
测定范围即是能够得到满意的准确性和精密性的最高和最低浓度。
总之，生物制品的测定由于其生物测定的变异性，因此，不同的测定方法和反应原
理时在验证中应根据具体情况进行不同参数的测定，有时还要对样品冻融等因素对测定
结果的影响等等。在对测定方法的验证中主要应对方法的适用性和可靠性进行测定，以
确定该方法在本实验室内能够得到准确和重复的实验结果，并且在测定范围、测定限度
和特异性等方面达到了测定的要求，确保实验数据的准确与可靠。