请大家帮我看看酶活低原因在哪

wy0351

请教大家，帮我看看为什么我5000U的植酸酶测出来总是2000多一些，我用的挑战的植酸酶。

1、溶液配制：

1.1.乙酸缓冲液(1)：称取20.52g无水乙酸钠于1000 ml烧杯中，加入900ml蒸馏水溶解，用冰乙酸调节pH至5.50±0.01，移至1000ml容量瓶中，蒸馏水定容至刻度。室温下存放2个月有效。

1.2.乙酸缓冲液(2)：称取20.52g无水乙酸钠，0.5 ml TritonX-100, 0.5g牛血清白蛋白于1000ml烧杯中，加入900ml蒸馏水溶解，用冰乙酸调pH至5.50±0.01，移至1000ml容量瓶中，蒸馏水定容至刻度，室温下存放2个月有效。

1.3.硝酸溶液：1+2水溶液。

1.4.钼酸铵溶液：称取10g钼酸铵于100ml容量瓶中，加蒸馏水溶解（微加热），加入1ml氨水(25％)，用蒸馏水定容至刻度。

1.5.偏钒酸铵溶液：称取0.235 g偏钒酸铵于100mL棕色容量瓶中，加50ml蒸馏水微加热溶解，待溶液冷却后加入2 mL硝酸溶液(1.3)，用蒸馏水溶解定容至刻度。避光条件下保存一周有效。

1.6.显色终止液：移取2份硝酸溶液(1.3)，1份钼酸铵溶液(1.4)，1份偏钒酸铵溶液(1.5)混合后使用，现用现配。

1.7．植酸钠溶液：（sigmaP0109）称取0.69g肌醇六磷酸钠(C6H6O24P6Na12)于100mL容量瓶中，用乙酸缓冲液(2)溶解并定容至刻度，现用现配(实际反应液中的最终浓度为5.0 mmol／L)。


1.8基准物：准确称取0.6804g在105℃烘至恒重的基准磷酸二氢钾于100ml容量瓶中，用乙酸缓冲液（1）溶解，准确定容至刻度（浓度为50.0µmol/ml）。

2、测定步骤：

2.1.标准曲线：

按下列图表用乙酸缓冲液(2)稀释成不同浓度，与待测试样一起反应测定

标准稀释比例

标液序号	稀释倍数	浓度/（µmol/ml）
1	0.5→16	1.5625
2	0.5→8	3.125
3	0.5→4	6.25
4	1→4	12.5
5	1→2	25

2.2.样品溶液制备：

准确称取植酸酶试样1g，置于100ml容量瓶中，加入乙酸缓冲液（2）摇匀并定容至刻度，放入磁力棒，在磁力搅拌器上高速搅拌40min，将提取后的试样在离心机上以4000r/min离心15min，取上清液1ml于100ml容量瓶中，用乙酸缓冲液（2）定容至刻度，使样液浓度保持在0.5U/ml左右，待反应。

2.3．反应步骤：

取9支刻度试管，按下面顺序进行操作，标准空白加0.2ml乙酸缓冲液(2)，

反应顺序	样品、标准	样品空白（标准空白）
1、乙酸缓冲液1（ml）	1.8	1.8
2、待反应液（ml）	0.2	0.2
3、混合	√	√
4、37℃水浴预热5min	√	√
5、依次加入底物溶液（ml）	4	4（第二步）
6、混合	√	√
7、37℃水浴水解30min	√	√
8、依次加入终止液（ml）	4	4（第一步）
9、混合	√	√

2.4．样品测定

反应后将试样在常温下静置10min，出现浑浊，然后在离心机上以4000r/min离心15min，取上清液以标准空白调零，在分光光度计波长为415nm处测出各个吸光值。

以吸光值为横坐标，摩尔量为纵坐标作图。Y=kx+b

3.计算公式：

    U=yn/0.2mt

U——试样中植酸酶的活性，U／g；
y——根据实际样液的吸光值由直线回归万程计算出的无机磷的量，（μmol）
n——试样溶液反应前的总稀释倍数,10000；
m——试样质量g；
t——反应时间min。30min

海上龙卷风

不同测定方法下酶活表现不一样

liyunhuddt

要看你是不是和对方提供的检验方法一样

xyy169

植酸酶是有国标方法的，你这个好像就是国标。
但酶制剂的检测，不仅只是检测方法的问题，更要注重的是操作细节，一个细节可能就是上几倍，十几倍的差距。
注意一下以下几个方面：1、酶的溶出过程，包括时间，方法；2、缓冲液2中的牛血清白蛋白等是否有加（对有些植酸酶的影响非常大）；3、确定一下反应温度，可另用温度计测试；4、加底物量是否一致，包括间隔时间等细节多注意一下。
另外你拿一个你可以检测到5000单位的标准样品进行对比检测，以确定你的操作和仪器是否正确等。

wy0351

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楼上的，您好，我测的是直接的植酸酶，高速磁力搅拌40min，不加热的。缓冲液2中的牛血清白蛋白，去痛100我也都加了。水浴锅温度控制在37.0℃。加底物和终止液都是用的1~5ml量程移液枪加的。唯一一个间隔的时间我没有太在意。我感觉连续加，时间不会差多少吧。难道就是这个在影响吗？

tianfangxu

您好，我也是做酶制剂检验的，上次我也做了植酸酶，没做出来，我把做曲线和做样的曲线加的缓冲溶液加的搞错了，我做曲线不是加的缓冲液，我加的蒸馏水。我希望我们可以多多交流酶制剂方面的问题。我最近又在纠结糖化酶......



补充内容：
您稀释的是10000倍吧，您测的植酸酶活性是多大的？

wy0351

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我测的是5000U的植酸酶，稀释10000倍

wy0351

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我前一段做一几天糖化酶。。。

hxz001

4楼的意见比较客观

akenuma

我们检测稀释800倍