饲用植酸酶活性的测定——分光光度法》新旧国标变化及解读

牧马祁连

由于植酸酶在配合饲料中的混合均匀度相对较差，饲料原料配方的复杂性、差异性会干扰添加植酸酶的配合饲料酶活检测结果的准确度、精确度及稳定性。5.5.3 对于加酶饲料样品中酶的提取新标准中规定：“使用超声波溶解器上超声溶解15min，再放入回旋式振荡器中振荡30min。

从2009年10月1日起，GB/T 18634-2009《饲用植酸酶活性的测定——分光光度法》标准正式实施。 　　随着植酸酶的大规模应用，饲料企业如何选择和鉴别植酸酶产品的问题，已经成为使用者的当务之急。在众多影响使用效果的因素中，产品本身的原因主要包括酶的种源、含量、温度稳定性、容重、pH特性及体内水解效率等，其中酶活含量是最重要的质量指标。 　　GB/T 18634-2002《饲用植酸酶活性的测定——分光光度法》是在参考了AOAC方法的基础上制定的，在国标颁布之初，由于市场上的植酸酶菌种相对单一，国标检测方法具有普遍的代表性，对植酸酶的生产、应用和检测起到了很好的指导作用。随着植酸酶的逐渐普及，特别是在2004年以后，国内对植酸酶的研究开发进展迅速，有大量采用不同菌种发酵的植酸酶相继问世，GB/T 18634-2002在检测新型植酸酶产品上显现出缺陷和不足，直接影响到检测结果的准确性。这次标准的修订为植酸酶的制造、贸易、应用甚至纠纷仲裁、以及加酶饲料的质量控制和检测方法的统一都提供了充分的依据，也是植酸酶发挥效果的基本前提。下面结合生产检测实际 ，谈谈新旧国标的主要区别： 　　1 缩小了方法的适用范围 　　新标准（GB/T 18634-2009，以下同）适用范围删去原国标（GB/T 18634-2002，以下同）中规定的“添加有植酸酶的浓缩饲料和添加剂预混合饲料”。修订为：“本标准适用于饲料添加剂用植酸酶产品、也适用于添加有植酸酶的配合饲料”。 　　预混合饲料、浓缩饲料中金属离子浓度高，成分复杂，对样品干扰大，随着样品保存时间的延长，酶的活性很不稳定，用现行的提取条件不能将酶活提取完全，检测结果不准确。因此，新国标适用范围中去掉了“添加剂预混合饲料、浓缩饲料”，保留“添加剂用植酸酶产品、配合饲料”。后两类产品按照新标准的方法检测均能达到较好结果。 　　2 调整了最低检出限量和添加植酸酶的配合饲料样品两次试验的允许差 　　方法最低定量限由原标准的“90U/g”调整为“130U/g”。扩大了添加植酸酶的配合饲料样品两次试验的允许差，由原标准的“≤10%”调整为“≤15%”。 　　由于植酸酶在配合饲料中的混合均匀度相对较差，饲料原料配方的复杂性、差异性会干扰添加植酸酶的配合饲料酶活检测结果的准确度、精确度及稳定性。尽管此次标准在最低检出限量和试验允许差这两方面做了调整，但并不能从根本上提高添加植酸酶配合饲料样品酶活检测的准确度、精确度。实际检测过程中，我们发现不同化验室间对添加植酸酶配合饲料中植酸酶检测结果存在较大差别也是一种较为常见的现象。 　　3 删除了相对法 　　原标准中绝对法是不借助中间物质和步骤，直接使用烘至恒重的磷酸二氢钾作为基准物绘制工作标准曲线，测定植酸酶含量。但是方法本身先天的因素造成测定精度低。为了保证准确度，必须加大测定的重复数，靠取平均数的办法获得可靠的测定值。所需时间长，费用高。绝对法适用于法定的质量认证及仲裁机构标定植酸酶标准品含量，为一般单位常规提供基准物质。相对法是借助已知准确含量的植酸酶标准对照品作为工作标准曲线，间接获得样品的植酸酶含量。相对法结果的准确性对标准品质量的依赖性较大。其测定结果精度高，速度快，费用低。高精确度是通过精确测定条件来达到的。适用于一般有日常测定需要的机构、企业使用。由于精度高，减少了重复次数，可以增加同一测定批次的样品数。两种方法的根本区别就在于对照品不同。 　由于相对法使用的植酸酶标准品不易确定和不易采购，新标准删除了相对法，但由于绝对法对环境、设备条件要求较高，为了降低不同化验室间检测结果的误差，必须使用新标准8.2.2中的建议：“在测定样品时附加一个已知活性的植酸酶参考样，便于检验整个操作过程是否有偏差。”对于在国内使用的植酸酶参考样应在获得国家权威质量监督部门授权的国家级实验室间进行重复测定；如果是在国际范围使用的植酸酶参考样，则要在不同国家的权威实验室间进行重复测定。 　　4 改变了缓冲溶液的配制方法 　　4.1 标准中使用无水乙酸钠代替原标准中的三水乙酸钠 　　4.2 用曲拉通X-100和牛血清白蛋白代替吐温20做为增溶剂 　　因吐温20只对少数一两类特定的植酸酶浸提效果较好，但由于目前市场销售的植酸酶菌种和生产工艺的不同，各单位检测中使用的玻璃器皿质量的不同等原因，使得大部分植酸酶使用吐温20增溶效果较差，检测中部分植酸酶会附着在容量瓶和试管壁上，因此，用曲拉通X-100和牛血清白蛋白（BSA）代替吐温20作为增溶剂配制缓冲液，检测结果重复性较好。 　　5 其他区别：细化了测定过程中的操作步骤 　　5.1 明确了植酸钠的相对分子质量和纯度，细化了溶液的配置 　　底物溶液的配制中新标准规定：先用冰乙酸调节pH值5.5±0.01后，再定容。以上步骤有效确保了植酸酶酶活定义规定的植酸钠浓度为5.0 mmol/L和pH为5.5的反应条件。 　　5.2 缓冲液和植酸钠溶液pH调节由原标准中使用“盐酸调节”修订为使用“冰乙酸调节” 　　5.3 细化了试样的制备 　　新标准中对固体样品和液体样品分别进行了描述。 　　5.4 对制做标准曲线的稀释顺序进行了调整 　　新标准中标准溶液的配制使用了由低向高进行配制的方法，更好的确保标准溶液浓度的准确性。 　　5.5 细化了试样溶液的制备过程 　　5.5.1 新标准对酶制剂样品中酶的提取和加酶饲料样品中酶的提取分别进行了描述。 　　5.5.2 原标准中对于酶制剂样品中酶的提取仅使用“在磁力搅拌器中高速搅拌30min”提取方式，新标准增加了酶提取的新方案：“超声波溶解器上超声溶解15min，再放入回旋式振荡器中振荡30min。”用这两种提取方式均可达到检测要求。 5.5.3 对于加酶饲料样品中酶的提取新标准中规定：“使用超声波溶解器上超声溶解15min，再放入回旋式振荡器中振荡30min。” 　　5.5.4 在使用磁力搅拌器进行提取的方式中，新标准规定了“先定容再放磁力棒”的操作顺序。此方法确保了试样浓度的准确性。 　　这次标准的修订充分说明了行业主管部门对植酸酶质量监督的高度重视 ，也是为了适应当前植酸酶行业出现的新发展，更好地维护广大消费者的权益，对植酸酶生产企业来说则有利于实现公平竞争条件下的优胜劣汰。新标准的出台为更科学地评价、检测和使用植酸酶提供了较好的指导作用。

zhou7550

这个复制下载学习了，谢谢楼主解读