嗜高温酶及其耐热机制

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　　除了核酶及脱氧核酶以外,其他酶的化学本质都是蛋白质。酶蛋白的一个重要性质就是遇热变性并失去催化活性。可是有些酶能在80 ℃以上的条件下发挥功能,这类酶叫做嗜高温酶。嗜高温酶主要存在于嗜热菌与超嗜热古生菌中, 它们之所以能在70 ～
110 ℃的温度范围内生长,关键在于这类细菌的类脂、蛋白质、酶及核酸等生物大分子的热稳定性。由于嗜高温酶在高温发酵、PCR 技术以及钻井采油等方面具有广泛的应用前景与开发潜力,所以研究它们的结构特点及其耐热机制,寻找或设计新的嗜高温酶是生产与科研共同关注的热点问题。虽然现在还没有彻底阐明嗜高温酶的耐热机制,但是从目前的研究结果来看,嗜高温酶的抗热性是由于酶本身稳定的天然结构以及嗜热菌胞内含有的热稳定因子对酶蛋白的保护作用。此外,钙、锌等金属离子对嗜高温酶也有热稳定作用。
1 　嗜高温酶的结构及其耐热机制
由于早期地球是高热缺氧的极端环境,故只有嗜热的专性厌氧生物才能生存。超嗜热古生菌的耐热及专性厌氧等特点符合早期地球地质的化学条件,因此这类细菌很可能是地球早期的生命形式。如果生命开始于生存在热环境中的嗜高温微生物,进化过程则是使嗜高温酶转变成嗜常温酶及嗜低温酶。研究引起嗜高温酶变化的因素,比较同源酶的结构差别,对于了解生命起源与进化,设计新酶以及认识嗜高温酶的耐热机制都会提供重要的启示。
人们对嗜高温酶和嗜常温酶的氨基酸序列差异进行了大量的研究,发现大多数嗜高温酶与同源嗜常温酶的氨基酸序列同源性很大,只有某些关键区域少数氨基酸的变化,但也有些同源酶的氨基酸序列同源性较小,出现大量的氨基酸取代或插入。不管属于哪种情况,酶蛋白的一级结构都对其本身的抗热性具有重要作用。因为维持蛋白质高级结构的次级键(氢键、离子键及疏水键等) 都是由氨基酸序列中的侧链基团参与形成的,故嗜高温酶的一级结构改变就会引起这些次级键变化或者增加了次级键的数量,从而使酶分子的结构更稳定,因而也更具抗热性。
Tesfay HS 分析比较了嗜热脂肪芽孢杆菌( Bacil2lus stearothermophilus) 的热稳定性3 - 磷酸甘油醛脱氢酶- GPDH - ST ( 80 ℃保温10min 仍保持活性) 和Bacillus coagulans 的热不稳定的3 - 磷酸甘油醛脱氢酶- GPDH - CO(55 ℃保温5min 就失去95～100%的活性) 的氨基酸序列,这两种酶都含有335 个氨基酸残基,其序列同源性高达91. 6 %。这就暗示酶的耐热性是由少数氨基酸的变化而引起的。GPDH - ST 与GPDH - CO 的氨基酸序列的差别体现在28 个氨基酸残基上,它们主要分布在肽链中间的三分之一处。其中有5 个是GPDH - ST 中的脯氨酸代替了GPDH -CO 中的丙氨酸。脯氨酸的结构熵比其他氨基酸小且更容易折叠,但是一旦折叠就需要更多的能量才能解开。每个脯氨酸代替丙氨酸后能为折叠提供约1Kcal/mol 的自由能,故5 个脯氨酸代替的加合作用就极大地提高了酶的抗热性。
由热球菌( Thermcoccus litoralis ) 产生的Vent TMDNA 聚合酶和水生栖热菌( Tnermus aqustics) 产生的Taq DNA 聚合酶都是嗜高温酶。它们不仅为PCR 技术大量体外扩增DNA 提供了条件,而且也使PCR 技术得到了迅速发展与广泛应用。将Taq 聚合酶的大片段( Klentaq1) 与大肠杆菌( Escherichia coli ) DNA 聚合酶I 的Klenow 片段( Klenow pol I) 进行比较,其序列同源性只有49. 6 %。进一步分析它们的结构后证明,两·4 · 生物学教学2002 年(第27 卷)第4 期者C - 末端的折叠结构相似,而N - 末端的结构不同。Klentap1 N - 末端功能区的氨基酸序列与构象重排形成了一个疏水性更强的核心,同时消除了不利于热稳定的静电相互作用。其原因是Klentaq1 N - 末端功能区含有13 个脯氨酸,占总氨基酸数目的10 % ,大量地代替了Klenow pol I 中的丙氨酸。这种一级结构的变化使Klenraq1 中形成了一个富含脯氨酸的袢结构代替了Klenow Pol I 中的A 螺旋。Klenow Pol I 中的有静电相互作用的残基被Klentaq1 中的疏水或芳香残基代替。尽管维持蛋白质三、四级结构的力有各种次级键,但是疏水力是最主要的力,故增加疏水有利于稳定酶蛋白的结构并提高了耐热性。
现已从嗜高温原生细菌( Pyrococcus f uriosus Pf ) 中分离出了红氧还蛋白,醛铁氧还蛋白及铁氧还蛋白,并且测定了红氧还蛋白和醛铁氧还蛋白的晶体结构,确定了铁氧还蛋白的二级结构。虽然因缺乏与之对应的嗜常温酶而无法通过比较而得知醛铁氧还蛋白在100 ℃时稳定的确切原因,但是通过比较与醛铁氧还蛋白分子大小相近的30 种嗜常温酶后发现,醛铁氧还蛋白的表面积相对较小。说明它的分子结构比较紧密,同时这种形态可减少溶剂反应并增加酶的热稳定性,嗜高温细菌Thermotoga 的3 - 磷酸甘油醛脱氢酶与嗜常温酶的分子大小相近且结构相似,可是表面积与体积的比也比较小。
由于酶的热变性是因破坏次级键而引起构象破坏并失去生物活性的过程,故人们试图通过研究嗜高温酶的构象与次级键来了解其耐热机制。到目前为止,还没有发现嗜高温酶中有维持构象的特殊键,只是这些键的数量与嗜常温酶不同。Pf 的红氧还蛋白和铁氧还蛋白特别耐热,在118～125 ℃时才发生热变性。通过核磁共振与晶体结构图分析表明,嗜高温的红氧还蛋白与已知的嗜常温红氧还蛋白的晶体结构很相似。
由此看来蛋白质的耐热性不是因为总体结构的差别,而是与其分子表面几个氨基酸的置换有关。与嗜常温的铁氧还蛋白相比,嗜高温铁氧还蛋白有三股β- 折叠而不是二股β- 折叠,还有较短的环,较长的α- 螺旋,在肽链两端的氨基酸之间有特异的离子反应,这些反应有助于防止温度升高引起的肽链末端开链并提高了酶的稳定性。
2 　热稳定因子的保护作用
在体外,大多数有机溶剂可降低酶的热稳定性或使酶变性失活,可是甘油、蔗糖及乙二醇溶液往往可增加酶的热稳定性。在体内,超嗜热古生菌通过代谢过程合成的高浓度的2 ,3 —二磷酸甘油酸可溶性物质对蛋白质、酶及核酸都有保护作用,可防止高热条件下的变性失活过程。对于DNA 来说,它们还能合成与真核细胞组蛋白密切相关的DNA 结合蛋白。这种蛋白质与DNA 结合后能保护并防止DNA 在高温条件下的解链变性过程。
超嗜热古生菌中的热网菌属( Pyrodictium) 的细菌最高能在110 ℃的条件下生长。在这种温度条件下,它们能合成占细胞蛋白质总量80 %的一种蛋白质。这种蛋白质具有两种酶活性:一种是催化合成ATP 的活性,另一种是具有分子伴侣的活性。当环境温度达到最高生长温度并接近胞内蛋白质与酶的变性温度时,这种分子伴侣通过重新折叠来保护其它蛋白质及酶对高热的稳定性。但是在接近热网菌的最适生长温度105 ℃的100 ℃时,细胞仅合成少量分子伴侣。说明在一定温度条件下,细菌能主动调节代谢并使合成分子伴侣的量随着温度的升高而增加。只有在最高生长温度时才能合成大量的分子伴侣,用于保护蛋白质与酶的活性,从而使自身适应高温环境。
3 　金属离子
C2 +a 能提高许多热稳定性酶的耐热性。在C2 +a 存在的条件下,几乎一半以上的碱性蛋白酶能在65 ℃的条件下维持15min。嗜高温中性蛋白酶的热稳定性更加依赖于C2 +a 。从云南西双版纳分离筛选的菌号为HY- 69 的耐热菌株产生的含钙中性蛋白酶特别耐热,最适活性温度为85 ℃,且80 ℃保温3h 仍保持63 %的活性。如用透析法完全除去该酶中的C2 +a ,80 ℃保温10min 就完全丧失活性。嗜热菌蛋白酶( ther2molysin) 也是一种耐热的含钙中性蛋白酶。它含有4个C2 +a ,从酶分子中除去3 个或4 个C2 +a ,不影响酶的催化活性,但热稳定性明显降低。尽管还不了解C2 +a提高酶抗热性的作用机制,但是推测C2 +a 对稳定酶分子的三维结构有重要作用。此外,锌离子与钾离子对某些耐热酶也有热稳定作用。根据嗜热古生菌特殊的生活条件与地球生命起源初期的环境条件有许多相似之处,推测嗜常温酶可能起源于同源的嗜高温酶。随着环境条件的变化,又迫于保持功能与自然选择的压力,因此在不影响功能的前提下,酶分子中可变区的氨基酸发生变化,致使构象与热稳定性也发生变化,但是仍保持原来的功能。当然可能有其他的进化途径。
    综上所述,尽管人们对嗜高温酶进行了大量的研究并取得了一些成果,但是还不足以说明嗜高温酶的结构与耐热机制之间的详细关系,有许多问题还有待于进一步探讨。相信随着研究的不断深入,会逐步加深了解嗜高温酶的耐热机制,同时也会为设计与表达新的嗜高温基因重组酶提供理论依据。

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也就是说，如果我们的技术足够发达的话，每一种酶都是可以改进成为耐热的！