不同制粒温度下植酸酶活性的变化及畜禽饲养对比试验研究

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　　不同制粒温度下植酸酶活性的变化及畜禽饲养对比试验研究

　　李富伟 汤海鸥 汪勇

　　摘要：试验将含有制粒专用植酸酶制剂的日粮样本在四种温度条件下进行制粒，制粒后的饲料应用植酸酶国标法进行酶活测定，结果表明：制粒专用植酸酶在调制温度70℃左右，蒸汽压力不高的情况下酶活基本没有丧失，酶活性能比较理想;当制粒温度达到了80℃以上时，酶活出现明显的降低，但总体都能保持在500U/Kg以上，制粒用植酸酶仍具有较好的耐热性能。经过动物饲养试验表明，肉鸡和育肥猪饲养对照组和处理组之间的平均日增重和料肉比差异都不显著(p>0.01)，这说明在添加制粒专用植酸酶后，对磷酸氢钙的量进行调整并不会影响肉鸡和育肥猪的生长性能，且同样能达到普通植酸酶在粉状饲料中的应用效果。
　　关键词：制粒专用植酸酶;酶活;肉鸡;育肥猪
　　Study on variations of Phytase Activity at Different Pelleting Temperature and Comparison Experiments on Pig and Poultry Feeding
　　Li Fuwei，Tang Haiou, Wang Yong
　　(Feed research institute of CAAS，Beijing Challenge Bio-technology Limited Company，Beijing，100081)
　　在日粮中添加植酸酶不仅可提高动物对植酸磷的利用率，而且还能降低磷在粪便中的排出量。但植酸酶为了达到功效必须在到达胃肠道时具有生物活性。由于饲料制粒机中蒸汽的加入和通过压模机处理时的摩擦，提高了饲料温度，使植酸酶的结构在热的条件下易出现结构不稳定性[1]。但是随着对植酸酶应用研究的不断开展，在提高植酸酶耐热性方面的研究工作目前已经得到长足的发展，从最初用固相载体稳定化处理酶发展到应用稳定剂结合包衣加工工艺，从基础的菌种筛选到应用分子生物学诱变，这些技术很大程度上消除了逆性因子对饲用酶的破坏作用，使植酸酶能保持较高活力在畜禽体内发挥生物水解作用。本试验就挑战制粒专用植酸酶的在制粒过程中的酶活变化情况和在肉鸡及育肥猪中的饲养效果进行研究，以便考察此酶的实际应用效果。
　　1 材料与方法
　　1.1 植酸酶
　　采用北京挑战生物技术有限公司特节磷制粒专用植酸酶5000型，每克含植酸酶5000 U以上(样品在底物浓度为5.0mmol/L、温度37℃、pH值5.50的条件下，每分钟从植酸钠中释放1mmol无机磷，即为一个植酸酶活性单位，以U表示)。
　　1.2 试验动物
　　21日龄的艾维因肉鸡;杜×长×大三元杂交猪。
　　1.3 试验方法
　　1.3.1 制粒试验
　　下表1是植酸酶添加到饲料时参数的设定，“条件一、二”设定对象是正常肉鸡饲料，“条件三”是正常肉鸭饲料，“条件四”是正常育肥猪饲料。在设定的所有饲料制粒前加入挑战特节磷制粒专用植酸酶120g，然后按照表1制粒条件进行实际的颗粒饲料生产，最后随机收集四种条件下颗粒饲料样品，对其进行植酸酶活性的检测。
　　
　　1.3.2 饲养试验
　　1.3.2.1 肉鸡饲养试验
　　选鸡400只，按体重一致、公母各半原则随机分为两组，每组5重复，每重复40只。第一组为对照组，饲喂正常颗粒饲料，总磷含量为0.65%，第二组为处理组，按“条件二”情况进行饲料制粒，在对照组日粮基础上减少氢钙添加量0.7%，总磷含量为0.55%，添加石粉使钙达到对照组水平，剩余空间用沸石粉补充，肉鸡自由采食饮水，试验期21天，试验期间测定具体日增重和料肉比，结果应用SPSS软件分析。具体配方和营养水平见表2：
　　
　　1.3.2.2 育肥猪饲养试验
　　选用体重27.00±1.00 kg 的杜×长×大三元杂交猪42头，每头猪戴耳标，随机分成对照组和试验组，每组21头猪，每组分3个重复组，每个重复组7头猪。第一组为对照组，饲喂基础日粮，总磷含量为0.65%，第二组为处理组，按“条件四”情况进行饲料制粒，在对照组日粮基础上减少氢钙添加量0.35%，总磷含量为0.56%，添加石粉使钙达到对照组水平，剩余空间用沸石粉补充。试验共55d，其中预饲期23 d，试验期32 d。试验期间测定具体日增重和料肉比，结果应用SPSS软件分析。具体配方和营养水平见表3：
　　
　　1.4 植酸酶检测方法
　　饲用植酸酶活性的测定——分光光度法(GB/T 18634—2002)[2]，每个试验因子都同时作两个平行两个分解，结果以平均数±标准差表示。
　　2 结果与分析
　　2.1 制粒试验结果
　　根据试验设计方法，对制粒后饲料进行酶活测定，结果见表4：
　　
　　从试验设计可以看出，在饲料中添加120克5000U/g的植酸酶，理论上颗粒中植酸酶含量应该为600U/Kg。但从结果可以看出，在“条件一”的环模压缩比、调制温度和蒸汽压力三项参数值都比较低情况下，添加植酸酶的饲料经制粒后酶活却达到了625±22 U/Kg，这比理论值还要高。分析其中原因可能有两点：第一，为了确保产品的酶活含量在一些不理想的条件(如储运温度比较高、保存时间有些长等)下仍能达到标记值，生产植酸酶产品时的出厂酶活要高于5000U/g;第二，植酸酶测定是一种比较精细的工作，且受外界因素干扰比较厉害，测定可能会出现略微偏高的现象;所以制粒后的测定值略高于理论值属于正常情况。同时从“条件一”的测定结果也可以说明，制粒专用植酸酶在调制温度70℃左右，蒸汽压力不高的情况下酶活基本没有丧失，酶活性能比较理想。
　　对比“条件二、三、四”的测定结果，出现“条件三”的各项参数都比较高的情况下酶活值却变大的情况，但与“条件二、四”测定值相对差值很小，理论分析其原因可能是由混合均匀度、试样采集和酶活测定等误差造成。三种条件下温度都达到了80℃以上，蒸汽压力都有所提高，而相对理论值酶活却出现明显的降低，但总体都能保持在500U/Kg以上，这也说明在80℃左右的制粒条件下该植酸酶仍具有较好的耐热性能。
　　2.2 饲养试验结果
　　2.2.1 肉鸡饲养试验结果
　　根据试验设计测定饲养肉鸡具体日增重和料肉比结果如下表5：
　　
　　注：同列数据肩标相同字母表示差异不显著(P>0.01)，下同。
　　从试验结果可以看出，对照组和处理组之间的平均日增重和料肉比差异都不显著。这说明在颗粒料中添加制粒专用植酸酶后，对磷酸氢钙的量进行调整并不会影响肉鸡的生长性能，且同样能达到普通植酸酶在粉状饲料中的应用效果。
　　2.2.2 育肥猪饲养试验结果
　　根据试验设计测定饲养育肥猪具体日增重和料肉比结果如下表6：
　　
　　从试验结果可以看出，育肥猪的饲养结果对照组和处理组之间的平均日增重和料肉比差异同样都不显著，这也说明制粒专用植酸酶在育肥猪养殖上同样具有很好的功效。
　　3 讨论
　　3.1 制粒对植酸酶酶活性的影响
　　酶的化学本质是在氨基酸顺序排列成一级结构的基础上，通过二硫键、氢键、盐键、疏水作用和静电作用等化学力，再折迭成对活力发挥起关键作用的二、三级结构构象，而酶的稳定性就取决于酶是否以最小自由能的构象存在。在制粒的过程中，植酸酶既要承受干热处理，又要承受湿热的处理，植酸酶不仅吸收热量导致构像发生变化，同时水分子和酶分子内氢键相互作用的破坏，使得植酸酶的构像更容易发生变化。但是，植酸酶作为生物催化剂在饲料工业上应用，不仅仅需要具有酶解植酸磷的作用，还应使植酸酶能达到工业制作对稳定性的要求。
　　因此，科研工作者们想尽办法从多方面研究提高植酸酶耐高温性能的方法。首先，从植酸酶生产的菌种出发，通过从极端环境中分离纯化新菌种和进行人工改造菌种基因的方法获得。香港大学的Tye AJ等(2002)从Bacillus subtilis 168和B.licheniformis中发现两种新型热稳定性的植酸酶，即使在Ca2+浓度很低、pH值中性的条件下，95℃保温10min后仍能恢复80%的初始酶活[9]。Luis Pasamonts等(1997)将烟熏曲霉的热稳定性植酸酶基因导入Asp.niger中，并在其中过量表达植酸酶，该植酸酶在100℃以下经过20分钟，活性丧失10%，在90℃下120分钟，仍有20%活性[10]。Pasamontes L等(2002)将Asp.fungi植酸酶基因与载体连接后再进行基因重组，结果得到的酶在90℃下处理80分钟，活性仍保留40%[11]。Lutz Jermutus等(2000)利用A.niger的植酸酶基因，基于酶的二级结构原理在A.terreus的植酸酶表面进行离子交互作和氢键搭桥实现了分子酶定向进化，提高了酶的耐热性[12]。
　　其次，从生产方式出发，通过包被和添加稳定剂的方式可以提高植酸酶的耐热性能。苏东海等(2004)考察了不同种类的糖、盐及浓度在干热及湿热的情况下对植酸酶残存酶活的影响，通过正交实验得到包埋颗粒，其包埋率为82.8%，包埋后水分活度大于0.35时，包被酶在干热的情况下残存酶活比原酶有较大的提高，残存酶活提高8.7%，湿热的情况下，残存酶活提高58.3%，胃蛋白酶对其的损坏作用也明显减小[3]。Ha等研究一种新的热稳定性的植酸酶部分或充分结合Ca2+时的晶体结构，也发现Ca2+对于该酶的活力和热稳定性有重要作用。在Ca2+高亲和力结合位点结合两个Ca2+，连接酶分子氨基酸序列上的远距环状片段，该酶的热稳定性显著提高(使热变性温度提高了30℃)[13]。
　　3.2 制粒植酸酶在动物生长上的应用
　　目前，普通植酸酶产品经过多年的推广应用，其在动物非高温制粒饲料上使用功效已经得到了广泛的证明[4,5,6]。而对于耐高温植酸酶，如果在饲料制粒后仍能保持很好的活性，则其对动物的生产功效同样应该会得到有效的发挥。从本研究可以初步证明，在添加耐高温植酸酶产品的肉鸡和育肥猪料经制粒后进行饲养试验，肉鸡和育肥猪的生产性能未出现显著变化。何丹林等(2006)研究表明，以作正对照的含磷酸氢钙1.60%的高钙磷饲粮、作负对照的不含磷酸氢钙的低钙磷饲粮和在负对照饲粮中添加耐高温植酸酶而得的植酸酶饲粮等三种能量蛋白水平相同的饲粮，对2日龄粤黄鸡开展60d 的饲养试验和屠宰试验， 结果表明三组鸡的软腿率、死亡率和屠宰指标的差异均不显著(P>0.05)，植酸酶组的生产性能与正对照的差异不显著(P>0.05)，但显著地高于负对照组的(P<0.05)，其中增重较负对照组的提高了11%[7]。目前，耐高温植酸酶的开发应用已经得到了的快速发展[8]。相信随着广大科研工作的努力研究，耐高温植酸酶产品必将会得到广泛的开发和应用。
　　参考文献：
　　[1] 吴远征，车程川，李纪顺，等.植酸酶的耐热性及其耐热机理的研究进展[J].饲料工业，2005，26(22)：22-24.
　　[2] 农业部全国饲料工业办公室等. 饲用植酸酶活性的测定——分光光度法(GB/T 18634—2002).饲料工业标准汇编(2002)[M].北京：中国标准出版社，2002.
　　[3] 苏东海，刘萍，郑亚安，等.包被工艺条件对植酸酶热稳定性的影响[J].生物加工过程，2004(3):40-45
　　[4] 付建福，瞿明仁，张含. 植酸酶在猪生产中的应用[J].饲料博览，2007(23):26-28.
　　[5] 高峰，江芸，周光宏，等. 猪禽饲料中应用植酸酶研究进展[J].畜牧与兽医，1999，31(6)：40-41
　　[6] 杜凤国，于艳利. 植酸酶在养殖业中的应用[J].畜牧与饲料科学，2007(1)：47-50.
　　[7] 何丹林，温刘发，吴新，等. 耐高温植酸酶代替磷酸氢钙对黄羽肉鸡的饲用效果[J].养禽与禽病防，2006 (6)：14-16.
　　[8] 邢自力，陈华友，谢芳，等. 植酸酶及其热稳定性研究进展[J].中国生物工程杂志，2003，23(5)：31-35.
　　[9] Tye AJ, Siu FK. Appl .Microbiol. Biotechol., 2002,59(2~3):190-197.
　　[10] Luis Pasamontes, Monika Haiker, Markus Wyss, et al. Clong, purification, and characterization of a heat-stable phytase from the fungs Aspergillus fumigatus. Applied and Environmental Microbiology[J]. 1997, 63:1696-1700.
　　[11] Pasamontes L, Mnaiker, Wyss M. Gene cloning, purfication, and characterization of a heat-stable phytase from the fungi Aspergillus[J]. Appl. Environ, Microbial, 1997,63(5):1696-1700.
　　[12] Lutz Jermutus, Michel Tessier, Luis Pasamontes. Structure-based chimeric enzymes as an alternative to directed enzyme evolution: phytase as a test case[J]. Journal of Biotechnology, 2001,85(1):15-24.
　　[13] Ha NC, Oh BC, Shin S, et al. Crystal structures of a novel, thermostable phytase in partially and fully alcium2 loaded states[J]. Nat Struct Biol, 2000, 7(2):147-153.

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