反相HPLC测定青霉素的方法改良

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　　反相HPLC测定青霉素的方法改良

　　刘维华 夏淑鸿 陈娟 赵娟 陈建蓉 高欣

　　[摘 要] 用0.9%氯化钠溶液取代水溶液溶解青霉素，按照CVP2005的
　　方法测定青霉素含量，得到相同的测定结果。该方法重复性好，对时间稳
　　定，优于药典的方法测定青霉素的含量，对批量样品自动进样测定误差
　　小，检验结果更可靠;对兽药典检验方法的制修订具有参考价值。
　　[关 键 词] HPLC 测定 青霉素
　　青霉素对大多数革兰氏阳性菌及阴性球菌、少数革兰氏阴性杆菌、螺旋体和放射菌有强大的抗菌作用，所以兽医临床上应用非常广泛。Fleming于1929年首先发现了青霉素，国内于1953年开始生产。本品经产黄青霉菌的杂交菌珠发酵玉米浆、乳糖和无机盐，反复转提、纯化而得。浓缩后的青霉素G游离酸的醋酸丁酯溶液中加入醋酸钾乙醇溶液既得青霉素G钾盐;再经醋酸丁酯转提，加入醋酸钠乙醇溶液即得青霉素G钠盐。青霉素分子由游离羧基、酰胺侧链、氢化噻唑环和β-内酰胺环合并的杂环构成，本品结构最不稳定的部分是β-内酰胺，在偏碱或偏酸条件下易发生水解和分子重排，在干燥条件下较稳定。本品含量测定经历了微生物法、羟胺法、碘量法、咪唑法、酸碱中和法、电位滴定法等演变和取代，《中华人民共和国兽药典》二○○五年版(CVP2005)规定的测定方法为液相色谱法。笔者在应用过程中发现其水溶液重现性不稳定，容易降解，对测定结果会造成较大偏差，结合兽医临床使用经验，用0.9%氯化钠溶液替代水溶解试样，得到较理想的结果。汇报如下：
　　1. 试验方法
　　1.1 主要仪器
　　Agilent 1100 高效液相色谱仪，配VWD检测器和ALS自动进样器
　　1.2 主要试剂
　　青霉素对照品：含量92.7%，批号K0251206，中国兽医药品监察所提
　　供;乙腈：色谱纯;磷酸二氢钾：分析纯;水为去离子水。
　　试样：市场抽检的青霉素钾样品5批，青霉素钠样品1批。
　　1.3 色谱条件
　　色谱柱(ZORBAX SB-C18,4.6×150mm);流动相：0.1mol/L磷酸二
　　氢钾溶液(用磷酸调pH值至2.5)—乙腈(70：30);柱温：20℃;流
　　速：1.0ml/min;进样量：10μL;检测波长：225 nm。
　　1.4 测定方法
　　取本品适量，精密称定，加溶剂溶解并定量稀释制成每1ml中约含0.5mg的溶液，摇匀，精密量取10ul，注入液相色谱仪，记录色谱图，按外标法以峰面积计算。青霉素钠测定结果乘以1.0658;青霉素钾测定结果乘以1.1136。
　　2. 试验结果
　　2.1 方法考察 分别以水、流动相、乙醇、0.9%氯化钠溶液4种溶剂为青霉素标准品稀释液，分别确定青霉素溶液现配、放置24h、放置48h、放置72h后液相色谱图中峰面积的变化，考察其重复性和稳定性，结果见表1、表2。
　　表1 改良方法与药典方法测定青霉素稳定性比较

使用方法	使用溶剂	测定时间	主成分含量（%）	降解物之和（%）	理论回收率（%）
药典方法	水溶解	现配溶液	100.0（n=6）	0	100.0
		放置24h	88.2（n=6）	8.2	88.2
		放置48h	43.3（n=6）	35.4	43.3
		放置72h	23.9（n=6）	75.7	23.9
改良方法	0.9%氯化钠溶液溶解	现配溶液	99.3（n=6）	0	99.3
		放置24h	99.3（n=6）	0	99.3
		放置48h	99.6（n=6）	0	99.6
		放置72h	99.1（n=6）	0	99.1

　　表2 不同溶剂溶解青霉素HPLC法测定色谱峰比较

溶剂名称	溶液状态	色谱图特征
		主峰数量（个）	降解物峰数量（个）	保留时间 （以主峰保留时间为1计）
水溶液	现配溶液	1	0	1
	放置24h	1	1	0.25；1
	放置48h	1	3	0.25；0.35；0.45；1
	放置72h	1	4	0.2；0.25；0.35；0.45；1
流动相	现配溶液	1	1	0.25；1
	放置24h	1	3	0.2；0.25；0.35；1
	放置48h	0	3	0.2；0.25；0.35
	放置72h	0	3	0.2；0.25；0.35
乙醇	现配溶液	1	1	0.2；1
	放置24h	1	1	0.2；1
	放置48h	1	2	0.2；1；1.6
	放置72h	1	2	0.2；1；1.3
0.9%氯化钠溶液	现配溶液	1	0	1
	放置24h	1	0	1
	放置48h	1	0	1
	放置72h	1	0	1

　　2.2 方法应用 以市场抽检的青霉素钾样品5批，青霉素钠样品1批，用0.9%氯化钠溶液溶解样品测定结果与CVP2005方法测定结果进行比较，考察其差异性，结果见表3。
　　表3 HPLC测定青霉素药典法与改良法结果比较

序号	产品名称	生产企业	批号	药典法测定 结果（%）	改良法测定 结果（%）	差值
1	注射用青霉素钾	重庆××公司	20070902	99.9	100.3	-0.4
2	注射用青霉素钠	江苏××公司	20080121	101.0	100.9	0.1
3	注射用青霉素钾	江苏××公司	070426	100.9	100.2	0.7
4	注射用青霉素钾	北京××公司	070301	56.5	55.9	0.6
5	注射用青霉素钾	咸阳××公司	080107	0	0	0
6	注射用青霉素钾	江苏××公司	20080102N	91.0	91.4	-0.4

　　3.　分析小结
　　3.1 本试验采用CVP2005一部青霉素钠“含量测定” 项下的方法，每ml中含2-苯乙酰胺和青霉素各0.2mg，两峰之间的分离度为4.4(应不小于2.0)，青霉素峰的理论塔板数为2738(应不低于1600)，重复性试验相对标准偏差为0.2%(应不大于2.0)。所以符合高效液相色谱法系统适用性试验的要求，测定结果可信、可靠、准确。
　　3.2 试验结果表1表明，使用CVP2005方法以水溶解青霉素标准
　　品，现配溶液和放置24h、48h、72h的溶液测定值依次为100.0%、88.2%、43.3%、23.9%，主成分含量递减，测定结果变化较大，稳定性差;改用0.9%氯化钠溶液溶解青霉素标准品，其溶液在72h小时内测定结果几乎无变化，稳定性好，且测定结果与药典方法现配溶液现测所得的结果基本一致，改良方法对时间的稳定性表现突出。
　　3.3 不同溶剂溶解青霉素，采用相同的色谱条件，HPLC法测定青霉素色谱峰的特征表明(表2)，水溶解的青霉素标准品溶液随着放置时间的增加降解物数量增加，72h时出现4个降解物，降解物峰在主峰之前;流动相溶解的青霉素标准品溶液随着放置时间增加降解物数量增加，48h时青霉素原形全部水解，出现3个降解物，降解物峰在主峰之前;乙醇溶解的青霉素标准品溶液随着放置时间的增加出现2个降解物，其中1个降解产物保留时间在主峰之后;水、流动相、甲醇溶液溶解的青霉素溶液随放置时间增加均有降解物产生，这一结果对动物源性食品中青霉素降解物或代谢物残留成分的分析可能有启示和帮助。0.9%氯化钠溶解的青霉素标准品溶液，72h内未出现降解，重复性较好，对时间稳定，优于药典的方法测定青霉素的含量。同时，对于青霉素在动物体内的原形的测定也可能有帮助。
　　3.4　表3表明CVP2005方法测得的结果与改良方法所得结果基本一致，药典方法适合于样品少，且现配现测，对测定结果不会有影响。对于样品多的情况不适宜于此方法，改良方法更适用。
　　4. 结论
　　用0.9%氯化钠溶液取代水溶液溶解青霉素，按照CVP2005一部方法测定青霉素的含量，稳定性好，测定结果相同;对批量样品自动进样测定误差小，检验结果更可靠。该研究对兽药典检验方法的再修订具有参考价值。
　　参考文献
　　[1] 中国兽药典委员会，《兽药使用指南》二○○五年版，中国农业出版社，P14。
　　[2] 中国兽药典委员会，《中华人民共和国兽药典》二○○五年版，中国农业出版社，P107。
　　RP-HPLC improved methods of penicillin
　　LIU wei-hua,XIA shu-hong, CHEN juan, ZHAO juan,CHEN jian-rong,GAO xin
　　(Ningxia Institute of Veterinary Medicine Control,yinchuan,750001)
　　[Abstract] using 0.9% aqueous solution of sodium chloride solution replaced water solution to dissolve penicillin, determine the content of penicillin by the method according to chinese veterinary pharmacopoeia 2005, obtain the same determination results. This method has good reproducibility, stability on time , better than using the method in pharmacopoeia to determine the content of penicillin , low determinative error of lot samples with automatic injection,the determination results more reliable; it has reference value for the development and revision of the determinative method in veterinary pharmacopoeia.
　　[key words] high-performance liquid chromatography determination penicillin

songjs2101

资料收藏了，很有价值，谢谢楼主慷慨提供。