1 温度
植酸酶作为一种酶制剂,对温度非常敏感,温度低会降低它的生物活性;温度高也会降低其生物活性,甚至完全失活。因此,在检测过程中对温度的控制则显得非常重要,国标要求植酸酶活性测定时的温度为(37±0.1)℃。在33℃时植酸酶不能很好地发挥其活性,酶活与其真实值相比约低10%;在40℃时,部分植酸酶会失活,酶活与其真实值相比约低8%。另外,水浴加热时,水浴液面要超过试管内反应液液面,使其在规定时间内充分反应。
2 pH值
pH值在酶活测定时影响很大,国标要求pH值为5.5。当pH值为3.0时,植酸酶活力基本消失。尽量不要用酸度计来调节缓冲液的pH值,因为酸度计存在一定的误差,使用时间长了会发生钝化,使测定的pH值不准。可以通过计算缓冲溶液中H+浓度的方法来配制一定pH值的溶液。如:①配制0.25mol/l乙酸缓冲液,加入34.02g三水乙酸钠、2.78ml浓盐酸,完全溶解后定容至1 000ml,用精密pH试纸测定溶液pH值为5.0。笔者曾用酸度计对照,配制上述pH值溶液需加入浓盐酸6ml,1:3盐酸约20ml,此溶液pH值实际上已经低于5.0,由此说明此酸度计已经反应迟钝。②配制0.25mol/l、pH值5.50的乙酸缓冲液,需加入34.02g三水乙酸钠、1.24ml浓盐酸,完全溶解后定容至1 000ml,用精密pH试纸测定溶液pH值为5.50。
3 底物植酸钠的型号
植酸钠有两种型号,一种是Sigma p-3168,分子量为923.8;另一种是Sigma p-8810, 分子量为660.03。根据国标要求,植酸钠应为Sigma p-3168,笔者在实验中发现Sigma p-3168植酸钠底色浅,且作磷标准曲线时梯度较好(见表1、表2)。
由表1、表2可以看出检测植酸酶活性时用Sigma p-3168为反应底物较好。
4 离心速度和时间
当水浴30min终止酶解反应后,需要进行离心。国标要求4 000r/min,离心10min。若以3 000r/min离心10min,则离心不彻底,测吸光度时发现标准曲线吸光度不呈梯度;以5 000r/min离心10min时,发现标准曲线各梯度的吸光度与以4 000r/min离心10min时相比偏低。如果应用国标改进法,乙酸缓冲液中加入了牛血清白蛋白,离心时间需要15min。笔者曾用国标改进法进行了时间对比实验,测定酶活时离心10min和15min后样品的吸光度(见表3)。
由表3可见,离心时间对测定结果影响很大。
5 公式换算
在整个实验过程中即使做得再成功,若公式换算出错,将会前功尽弃。植酸酶绝对法测定酶活时,计算公式如下:
式中:C——根据实际样液的吸光值由曲线回归方程计算出的y值(U);
F——试样溶液反应前的总稀释倍数;
m——试样质量(g);
30——反应时间(min)。
其中F所代表的总稀释倍数换算时容易出现错误,现在我们举例说明:称取500IU植酸酶1.000 0g,用乙酸缓冲液溶解并稀释定容至100ml,从其中取出1ml继续稀释至12.5ml,稀释倍数为1 250;若称取1 000IU植酸酶 0.500 0g,用上述方法进行稀释,则稀释倍数为2 500,计算时若写成则错误,这样就多乘了2倍。应写成,这是在公式换算时应注意的问题。
(编辑:崔成德,cuicengde@tom.com) |
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