米曲霉、黑曲霉发酵红三叶草对异黄酮的影响研究

apple12151007

　　米曲霉、黑曲霉发酵红三叶草对异黄酮的影响研究
　　陈凤风 成文晓 张福元
　　摘 要 本研究利用引进的产纤维素酶活高的米曲霉菌株1、2和黑曲霉3.3148，对红三叶草固态发酵，通过比较不同菌发酵处理后酒精提取物在不同紫外波段吸光度曲线，研究了其对异黄酮结构的影响。结果表明：米曲霉菌株2对异黄酮结构有很大的破坏作用，而米曲霉菌株1和黑曲霉3.3148对其无影响。
　　关键词 红三叶 米曲霉、黑曲霉 异黄酮
　　红三叶 (Red Clover)为豆科多年生草本植物，又名红花苜蓿、红菽草、红荷兰翘摇、金雀菜等，属车轴草属(TrifolIUm L.)[1]。红三叶草原产于小亚西亚和西南欧，在欧洲各国及俄罗斯、澳大利亚、新西兰、美国等国海洋性气候地区广泛栽培。红三叶草在我国新疆、吉林、云贵高原、北鄂西山地都有野生，另外我国江淮流域、华北、华南、西南等地均有栽培，是一种优良的豆科牧草[2]。
　　红三叶草主要含有异黄酮、维生素、氨基酸、糖类和等多种生物活性成分，其中异黄酮是红三叶草中特殊的活性成分[3]。
　　异黄酮具有多种生理活性,概括起来主要有两个方面：即植物雌激素功能和抗氧化功能[4、5、6]。
　　异黄酮在结构上与哺乳动物的雌激素——雌二醇相似,都具有雌激素的活性，它可与生物体内雌激素受体ER结合而表现出一定的雌激素功能。由于异黄酮活性组分与ER的结合力和甾体雌激素与ER的结合力相比低近千倍,因此,其结合后的潜在健康效应存在U型剂量-效应关系,即低剂量时由于它与雌激素竞争结合ER而降低了雌激素活性,因而表现为抗雌激素作用;而中剂量时可产生一定的雌激素活性;高剂量时,补充的异黄酮则可活化因雌激素水平限制而未能活化的ER,产生雌激素增强效应。这种U型剂量-效应关系使得异黄酮具有雌激素样的多种功能[7、8、9、10]。
　　在生产中应用有显著的效果：
　　(1).提高繁殖性能和提高泌乳性能，张荣庆和韩正康 [11]通过研究证实,大豆异黄酮可以显著提高二花脸母猪在试验初期的泌乳量。
　　(2).提高产蛋鸡生产性能，刘燕强等[12]将320日龄罗曼蛋鸡随机均分为对照组,喂基础日粮-和试验组,基础日粮中添喂大豆异黄酮 3mg/kg，结果试验组产蛋率显著提高，且蛋重和饲料转化率也有所提高，表明大豆异黄酮可能通过调控血液激素水平而提高产蛋鸡生产性能。马学会[13]等研究：饲粮添加大豆黄酮可增加蛋壳厚度和蛋壳重，降低破蛋率，改善蛋壳品质。
　　(3).提高肉鸡生产性能，郭晓红等 [14]分别在肉仔鸡日粮中添加大豆异黄酮5、10、15mg/kg,结果表明,添加大豆异黄酮可显著增加肉公鸡的平均体增重、饲料效率及平均日采食量。添加量为10mg/kg效果最好。饲料利用率和平均日采食量较对照组均显著提高(P<0.05)。还有报道异黄酮能够提高奶牛的产奶性能和肉牛的生长性能。因此，异黄酮可作为畜禽生长促进剂。后来的研究结果表明这类物质还具有强心、降血脂、对抗性激素依赖性肿瘤生长和抗癌等作用。鉴于此，我们利用米曲霉、黑曲霉固态发酵红三叶草产高活性的纤维素酶的同时，首先有必要研究其对异黄酮的影响。
　　1.材料与仪器
　　1.1试验材料
　　红三叶草：购自甘肃岷海制药有限公司，40目粉碎。
　　米曲霉菌株1：引自山西农大食品学院
　　米曲霉菌株2(Aspergillus oryzae var. effusus 3.2824)：购于中国普通微生物保藏管理中心
　　黑曲霉(Aspergillus.niger 3.3148) ：购于中国普通微生物保藏管理中心
　　鹰嘴豆素标准品：购于天津尖峰天然产物研究所
　　1.2仪器设备
　　生化培养箱：LRH-250A，广东省医疗器械厂
　　高压灭菌锅：中国上海医疗器械厂
　　摇床：TZ-ZBH台式恒温振荡器，北京沃德创意技贸有限责任公司(250mL三角瓶用)
　　超净工作台：北京东联哈尔仪器制造公司
　　干燥箱：101-A型，上海实验仪器总厂
　　电子天平：Adventurer OHAUS
　　植物粉碎机：江苏省东台市电器厂
　　电热恒温水浴锅：江苏省东台市电器厂
　　紫外可见分光光度计：UV2100 尤尼克 上海仪器有限公司
　　500ml三角瓶、棉塞、牛皮纸等
　　2.实验方法
　　2.1菌种的制备
　　马铃薯葡萄糖斜面试管培养基(PDA)
　　将马铃薯洗净去皮,称取200g,切成小块,放入1000ml水中煮沸至土豆块变软,用纱布过滤，在滤液中加入称好的20g琼脂,不断搅拌至琼脂完全溶化,然后加入20g葡萄糖,搅拌至溶解,停止加热补足水分至1000ml,分装于试管,包装,121℃高压蒸汽灭菌30min，趁热摆好斜面，备用。
　　将米曲霉菌株1、米曲霉菌株2、黑曲霉在超净工作台内接种于上述培养基，27℃恒温培养至菌丝长满试管，备用。
　　2.2红三叶草发酵物的制备：
　　称取20g红三叶草粉于500ml三角瓶，加水40ml,搅匀，盖好棉塞,外包牛皮纸，121℃高压蒸汽灭菌45min。冷却后于无菌条件下接2.1中备好的各菌种。每个菌种重复3瓶，于27℃培养至菌丝长满2周后取出，干燥后40目粉碎待测。
　　2.3鹰嘴豆素标准物紫外吸收曲线图的制作
　　精确称取鹰嘴豆素5.2mg，用无水酒精定容于50ml容量瓶中。量取1ml于25ml容量瓶用无水酒精定容后，在230-300nm不同的波长测吸光度，得标准物鹰嘴豆素的吸收峰图如下：
　　
　　Fig.1 The curve diagram of biochanin’s absorptance on different waveband
　　注：鹰嘴豆素在262nm处有最大吸收值
　　2.4红三叶草和发酵基质酒精提取物不同波段吸收峰图的制作：
　　准确称取红三叶干粉和经米曲霉菌株1、米曲霉菌株2、黑曲霉发酵后烘干物1g，装于滤纸包内，置于索氏抽提管，用无水酒精90℃条件下提取完全，将索氏仪底部的圆瓶内提取物全部转移到200ml容量瓶内，定容后在230-300nm测吸光值，制得酒精提取物在不同波段的吸光值曲线图如下：
　　
　　Fig.2 The curve diagram of alcoholic extractions ’absorptance by different waweband
　　3 结果与分析
　　由图2结合图1知：红三叶草无水酒精提取物在260nm处有最大吸收值，经黑曲霉3.3148、米曲霉菌株1发酵后的红三叶酒精提取物在波长为260nm左右仍有最大吸收值，而且与未发酵红三叶草酒精提取物的不同波段吸收曲线极为相似，可以推断酒精提取物主要成分没有变化，而经米曲霉2发酵的红三叶的酒精提取物在250-270nm波段内没有最大吸收值，其波段-吸光度曲线几乎成为一直线，说明红三叶草经米曲霉菌株2发酵后的酒精提取物成分发生了很大变化。结合舒淑等高效液相色普法检测大豆异黄酮和陈封政等红三叶中总异黄酮含量的测定的报道，酒精提取物内主要成分为异黄酮[34、35、36、37]，可以推断米曲霉菌株2降解了红三叶草内异黄酮。
　　4结论
　　米曲霉菌株2为米曲霉变种，虽然其产纤维素酶活高，但通过对红三叶的发酵发现其不利于异黄酮的应用，因此选择米曲霉菌株1、黑曲霉3.3148做进一步研究。
　　作者简介：陈凤风 成文晓，山西农大硕士研究方向：生物饲料工程
　　张福元：山西农大动物科技学院，教授

amypx

谢谢  收藏啦