饲用酶检测过程中非定义影响因素的分析

apple12151007

　　饲用酶检测过程中非定义影响因素的分析

　　汤海鸥 汪 勇 李富伟

　　Analysis of influence factors not included in definition during enzyme activity test
　　Tang Haiou, Wang Yong, Li Fuwei
　　饲用酶制剂是应用现代生物工程技术，选用特殊的微生物菌株经发酵产生的具有催化活性的生物制剂。近年来，因其具有改善畜禽消化道功能、降低食糜粘度和抗营养性、提高饲料利用率和减少环境污染等特点，已作为环保型饲料添加剂广泛应用于畜牧业。但因饲用酶制剂应用开发较晚，当前饲用酶制剂酶活测定方法除了植酸酶外其它酶制剂都还没有一个全国通用的标准方法。虽然随着酶制剂工业的发展，酶活检测水平已得到了相应的提高，对于酶活检测中的一些重要因素人们在酶活定义中已经进行了明确的规定，例如其中的温度、pH值、时间、底物等，并且对于这些因素在酶活测定过程中对结果的影响程度以及这些因素不同值下的对比关系，广大科研工作者已经进行了大量而深入的研究。但是酶活检测过程中除了这些定义中规定的因素对酶活检测结果影响很大以外，许多非定义因素对酶活的检测结果影响也极其显著。因此，对于酶制剂酶活大小的判断和对比，不能仅仅从定义中规定的因素进行分析，那些非定义因素的分析也至关重要。有鉴于此，笔者就酶制剂酶活测定中一些影响酶活测定值的非定义因素进行了分析，并对其中有些不确定的影响因素进行了对比试验，以便为广大的酶制剂应用者更好的把握酶制剂的质量提供参考。
　　1 缓冲液的配置
　　饲用酶制定义中的pH值的确定都是根据动物的胃肠内最佳作用pH值得来，一般在5.0～5.5左右。为了达到酶活定义所要求的pH值范围，酶制剂检测时都应用一定的缓冲液调配使反应体系达到相应的pH值。反应体系中缓冲液的离子强度影响酶制剂的蛋白空间结构，从而影响其催化能力，所以测定酶活时应尽可能统一反应缓冲液的种类和离子强度。但是在pH相同的条件下如果缓冲液的离子对和缓冲溶液的摩尔浓度不相同，则测定出来的酶活差别很大。乙酸缓冲液在酶制剂检测中最常使用，但也有方法使用柠檬酸和硼酸等缓冲液。缓冲液摩尔浓度国内方法一般用0.1和0.2M的居多，在国外也有使用0.05M的方法。Nelson等(2007)试验证明，使用柠檬酸缓冲液测定真菌性植酸酶的活性仅相当于使用乙酸缓冲液的65～70%。然而，在缓冲液使用上的差异并不对所有植酸酶都产生相同的影响。Dalsgaard等(2007)发现，乙酸缓冲液和柠檬酸缓冲液对两种大肠杆菌植酸酶的相对酶活影响区别很大，用柠檬酸缓冲液分析得到的植酸酶活性只相当于用乙酸缓冲液的1/3左右。我们应用相同测定方法不同的两种的缓冲液测定同一种木聚糖酶样品，结果表明使用乙酸缓冲液测定的酶活仅相当于使用柠檬酸-磷酸氢二钠缓冲液的60～70%。
　　2 底物的配置
　　底物的差别对酶活测定结果具有很大影响。底物的选择最好应用酶制剂实际应用时所对应的酶解底物为好，但是在实际检测时因为考虑到底物稳定性以及酶活检测的方便性等问题，底物的性质和型号往往有很大的区别。对于没有统一国标规定的测定方法，在底物的性质上存在许多不同，其中多以盐的形式居多，例如纤维素酶的底物以用羧甲基纤维素钠为多，但也有直接用微晶体纤维素进行测定的方法。即便是植酸酶的底物植酸钠也存在不同种型号的情况，应用不同型号的植酸钠进行测定，结果之间差别也很显著。我们采用试验的方式考察了不同pH条件下二种底物(SigmaP8810和P3168)检测不同酶活水平的植酸酶时其检测值之间的差别。结果表明：不同pH条件下，P8810与P3168的检测结果之间差异都极显著(见表1)。
　　表1 不同pH下三种底物对不同酶活水平的植酸酶检测结果及分析

pH 底物

酶活水平(U/g)
　　1000 3000 5000 6000 7000 10000
　　5.5 P8810 1617±25 4158±10 5980±4 7670±141 10040±119 12795±100
　　P3168 1340±15 3181±77 5014±17 5903±50 8009±59 9790±150
　　5.0 P8810 1748±36 5384±53 6738±33 8559±101 10890±118 14508±130
　　P3168 1596±72 4508±26 6113±65 7498±43 9802±132 12621±227
　　因素 P值
　　底物 P3168(5.5,5.0) P8810(5.5,5.0) P=0.000
　　3. 显色剂的配置
　　酶制剂检测时其量的判断一般都是通过试剂显色来确定，并用不同的方式对比产物生成的量。显色剂里同时配有使反应中止的试剂，使整个溶液起到显色和中止的作用，一般显色液的配置都比较复杂，例如植酸酶显色剂钒钼酸胺溶液、测定还原糖类用的显色剂DNS(3,5-二硝基水杨酸)溶液等。其中，显色剂类型的不同、相同显色剂但其中物质配比的不同、显色剂在反应中添加量的不同以及显色时间的不同，都会产生不同的反应结果，对酶活检测的值也会产生一定的影响。聂国兴(2002)研究了DNS量对木聚糖酶活性测定的影响，结果表明：由于DNS用量变化，测定结果也发生了明显变化，DNS用量在3ml时测得的酶活最高。王琳等(1998)研究DNS法测定纤维素酶活力最适条件，结果表明DNS显色5分钟比较适宜。DNS溶液的配置以3,5-二硝基水杨酸试剂为主，加入氢氧化钠保持DNS的碱性环境并中止酶解反应，同时加入防止溶解氧侵入的酒石酸钾钠，还可能加入一些颜色稳定剂如亚硫酸钠、苯酚等。我们应用试验研究了添加和不添加试剂亚硫酸钠、苯酚的DNS前后对比对酶活产生的影响，结果表明添加与不添加对比色的吸光值产生显著影响，对酶活和稳定性影响不显著。试验研究DNS显色时间不同和DNS添加量不同时木聚糖酶酶活变化趋势，结果表明DNS显色时间在5min添加量在3ml时最合适(见下图1)。
　　图1 DNS显色时间不同和DNS添加量不同时木聚糖酶酶活变化趋势
　　4 稀释倍数
　　目前测定酶活的方法通常是先把酶稀释，然后测定稀释酶的活力，所得到的结果乘以稀释倍数即为原酶的活力。但是，事实上许多酶的活力和稀释倍数并不成比例关系。选择酶样的稀释倍数实质上是选择酶分子与底物分子之间的数量比例，二者的比例只有在适当的范围内时酶蛋白的活力才与产物的生成量呈线性正比例关系。酶样稀释倍数过大会影响酶活的稳定性，稀释倍数不同最终获得的酶活测定值有很大差异。费笛波等(2004)为探讨稀释率对木聚糖酶测定结果的影响，将酶样稀释度从1000倍升至11000倍，结果表明，稀释度的改变，明显影响酶活力测定结果，稀释度低，因吸光值太大使结果大大偏低;但稀释度过大因A值过小，结果也偏低。笔者根据平时大量酶活测定应用性研究试验发现，如果仅仅以吸光值的合理范围(一般以0.2～0.5为宜)为稀释依据，那么当称取样品的质量不同时，其测定的酶活值之间相差也非常大。所以，要想获得相对稳定的测定结果，必须从合理吸光值范围、最终稀释液的浓度及称样量多方面考虑。
　　5 曲线的制作
　　标准曲线是酶制剂检测过程中能求出检测值的唯一对照依据，曲线方程的大小直接影响着换算出来的测定值。制作标准曲线时，要使得到方程的截距尽量小，R平方值尽量趋近于1，这样才能更好的减小曲线的误差对测定酶活值产生的影响。为了减少系统误差给测定带来的影响，标准曲线制作时应尽可能和样品在同一条件下反应，标准品的选择应尽量用纯度较高的基准物或分析纯品，标准品应注意保存防止吸水而对结果产生影响。标准曲线的制作一般可以采用相对法和绝对法两种形式，相对法是借助已知准确含量的酶标准对照品作标准曲线，绝对法则是用一些酶活定义中规定的反应产物来衡量酶解产物作标准曲线，绝对法适用于法定的质量认证及仲裁机构，相对法适用于一般有日常测定需要的机构或企业。
　　6 小结
　　酶活测定是一种非常细致的工作，饲用酶制剂的检测不仅是饲用酶推广和应用的瓶颈技术之一，也是检验酶制剂产品的主要手段。在酶活检测的过程中，不但要注意酶活定义中规定了的一些主要影响因素，很多非定义因素对酶制剂检测也会产生很大的影响。同时检测时的一些操作细节问题也应该注意，比如：离心速度、摇匀力度和次数、搅拌时间、移液器的正确使用以及玻璃仪器的清洁度等，这些细节可能不是酶制剂研究工作者非常关注和研究的焦点，但对于一些性质不稳定的酶制剂，这些细节问题的疏忽也会对结果产生较大的影响。所以，酶制剂检测过程中应尽量把每一个要点和步骤做好。
　　参 考 文 献
　　1 Nelson E. Ward, Donnie R.Campbell. Phytase activity expression requires understanding, FEED AND LIVESTOCK TECHNICAL BULLETIN.2007,9:10～15
　　2 NAKAMURA,T., SHITARA,A., MATSUDA,S and MASAHITO,M. Production, purification and properties of an endo-inulinase of Penicillium sp.TN-88 that liberates inulinase. J. Ferment. Bioeng., 1997,84(4):313～318
　　3 王琳,刘国生,王林嵩,张志宏,侯进怀,郭惠敏.DNS法测定纤维素酶活力最适条件研究.河南师范大学学报(自然科学版),1998,26(3):66～69
　　4 费笛波,冯观泉,袁超.饲用木聚糖酶活性测定方法的研究.浙江农业学报,2004,16(2):53～58
　　5 聂国兴,李春喜,张建新,温建合,付艳茹.底物浓度、DNS量对木聚糖酶活性测定结果的影响.饲料工业,2002,23(11):24～25
　　6 陆文清,李德发. 影响饲料酶活力测定的因素分析.饲料研究,2002,(5):15～18
　　7 张若寒.植酸酶含量测定的必要性与两步测定方法的评价.饲料工业,2001,22(9):1～5

donghaijun2009

拜读全文，收藏起了。

saturnbio

好文章，收藏了！

郑旭阳

关于检测方法的文章,写之前,最好自己要熟练操作, 看得出,作者熟悉实验室操作.