奶牛场常见病原微生物的鉴别

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　　奶牛场常见病原微生物的鉴别
　　及形成原因分析
　　郭荣(内蒙古兴和县畜牧局) 连文生(内蒙古凉城县岱海镇)
　　摘 要
　　本试验对天津里自沽和红光两个奶牛场奶牛的乳汁、脓汁、渗出液、病变组织进行采集，通过细菌学和生化试验，对病原微生物进行了分析和鉴定。分析鉴定结果显示：其病原微生物分别是金黄色葡萄球菌、链球菌和大肠杆菌，这些病原微生物引起奶牛乳房炎、子宫内膜炎等多种疾病。同时对病原微生物进行了药敏试验，药敏试验结果表明：这些病原微生物对临床上常用的庆大霉素，克林霉素已形成了不同程度的耐药性，而对强力霉素，氧氟沙星则表现较高的敏感性。试验结果可为奶牛场选择用药提供科学依据。
　　关键词: 病原微生物;分离;鉴定;生化试验;药敏试验
　　ABSTRACT
　　In order to indentify and analysis pathogenic microbilogical, milk, pusjuice, extravasate and the pathological tissues were gathered from lizigu cattle farm and hongguand cattle farm in tianjin in the experiment.The result is that pathogenic microbiologies were separated, they are staphylococcus aureus, streptococcus, E.coli. Certain pathogenic microbiologies cause cow mastitis, endometritis and other kinds of diseases. A drug and susceptibility test were carried. The result of drug and susceptibility test indicates that these pathogenic microbiologies have formed the varying degree drug resistance to the Qingda mildew and the Kelin mildew which the clinical commonly used, but the Qiangli mildew and oxygen fluorine Sha Xingze display better suppression effect. The result can provide scientific basis to choose the pointed medicine to treat cows’ disease for cattles.
　　Key word：Pathogenic microbiology;Isolation;Verification;Biochemistry test;Drug and susceptibility tes
　　1 前言
　　人类生存环境中的微生物种类非常之多，绝大多数微生物对人类、动物和植物是有益的，而且有些是必需的，能引起人类、动物和植物病害的微生物只是少数，这些具有致病性的微生物称为病原微生物 [1]。当病原微生物存在于牛场中，常能引起奶牛发病，并且病原微生物感染也是引起奶牛发病的主要原因，牛场常见的乳房炎、子宫内膜炎、肢蹄病，其主要都是由病原微生物感染引起的 [2]。尤其乳房炎,是奶牛养殖过程中的一种最常见的多发性的疾病，乳房炎的病原体有80-130多种，其中主要的病原为链球菌、金黄色葡萄球菌、大肠杆菌，约占奶牛乳房炎病原菌的90% [3]。奶牛子宫内膜炎，也主要是由链球菌、葡萄球菌、大肠杆菌等引起的 [4]。而奶牛的肢蹄病，是由坏死杆菌，病毒等引起，同时由乳房炎，子宫内膜炎产生的炎性产物，也可引发产生肢蹄病。
　　病原微生物引起的奶牛的三大疾病对奶牛业造成了重大的经济损失。在奶牛饲养中，乳房炎是发病率最高、流行最快、造成损失最大的一种疾病。乳房炎对奶牛业造成的危害包括：1、直接造成产奶量的减少;2、由于牛奶变质和药物残留，人们不能食用而被迫倒掉牛奶;3、一些奶牛无法治愈而被淘汰所造成的损失;4、在治疗乳房炎期间，所有医疗费的开支;5、护理病牛所需额外的劳动力开支等。 根据美国人的统计分析，一头罹患乳房炎的牛其经济损失可以高达45美元(折合人币369元)[5]。子宫内膜炎是较为常见的一种产科疾病，严重影响奶牛的泌乳和繁殖，危害极大，可造成奶牛减产30%～50%,甚至被淘汰处理。子宫内膜炎不及时治疗会引起持久黄体，从而导致发情周期停止而引起不育症。该病不仅影响牛只健康成长，而且对母牛的繁殖、产奶量以及奶牛业的发展影响也较大[6]。在奶牛业中，肢蹄病是仅次于乳房炎和繁殖系统疾病而引起奶牛被迫淘汰的第三大最普遍的原因。肢蹄病会导致产奶量的下降和繁殖效率的低下。奶牛跛行90%是由于蹄的问题，且极大部分是由于后蹄的病原微生物感染发病而引起的，严重者甚至瘫痪[7]。因此，我们要加大对这些病的预防力度。
　　在病原微生物检测方面，随着科学技术的不断发展，特别是分子免疫学，生物化学，分子生物学及计算机技术的不断发展，以及专业技术人员的相互合作，新的微生物诊断技术和方法已广泛被应用[8]。在分子生物学检验技术方面，尤其以是DNA探针，以PCR为代表的分子生物学技术及基因芯片技术的应用，已加快了微生物检验的速度，明显提高了微生物的诊断水平。(1)DNA探针是建立在探针与被测标本基因序列同源的基础上，进行检验的分子遗传学技术。是用已知的一段DNA去识别被检测的相应基因序列，以鉴定定位和定量病原体的遗传信息，从而使基因探针成为检测病原体一种特异试剂，可以达到快速、特异，同时可以得到减少细菌增殖危险性的微生物标本[9]。(2)PCR技术自1985年建立以来，发展之迅速、应用之广泛，表明其具有强大的生命力。近些年来，基于 PCR 的基本原理，许多学者充分发挥创造性思维，对 PCR技术进行研究和改进，使 PCR 技术得到了进一步的完善，并在此基础上派生出了许多新的用途[10]。PCR 可用于多种病原微生物的同时检测或鉴定，它是在同一 PCR反应管中同时加上多种病原微生物的特异性引物，进行 PCR 扩增，可用于同时检测多种病原体或鉴定出是那一型病原体感染[11]。(3)基因芯片技术是近年来分子生物学及医学诊断技术的重要进展，该技术是通过把巨大数量的寡核苷酸，肽核苷酸或 cDNA固定在一块面积很小的硅片、玻片或尼龙膜上而构成基因芯片。它主要是基于近年来的一种全新的 , DNA 测序方法之一杂交测序法应运而生的。由于该技术同时将大量的探针固定于支持物上，所以可以一次性对大量序列进行检测和基因分析，解决了传统的核酸印迹杂交操作复杂，操作序列数量少等缺点。基因芯片技术的突出特点在于其高度的并行性、多样化、微型化和自动化。与传统方法相比，生物芯片在疾病检测诊断方面具有独特的优势，它可以在一张芯片同时对多个患者进行多种疾病的检测。仅用极小量的样品，在短时间内，即可提供大量的疾病诊断信息。这些信息有助于医生在短时间内采取正确的治疗措施。在国外现有某些疾病诊断用芯片，国内也有人在研究致病菌分析用芯片。在临床基因诊断中，基因芯片也逐渐得以应用，如病原微生物的基因诊断，结核分枝杆菌等[12]。但DNA探针、以PCR为代表的分子生物学技术及基因芯片技术也存在着某些缺陷，如混合感染，耐药菌株等，用传统的基因诊断法有时也难以解决 [13]。
　　在分子生物学检验技术方面，DNA探针、以PCR为代表的分子生物学技术和基因芯片技术对病原微生物的检测和分型具有广泛的前景，但由于其成本高，操作处理复杂，需要现代化的试验平台和昂贵的试验设备，使该技术目前仅主要用于研究领域，而用于病原微生物临床检测还处于幼年时期[14]。奶牛场主要以生产性为主，而并非侧重科学研究，因此，目前奶牛场病原微生物的检测还仍以传统的微生物检测方法为主，进行病料的涂片、染色、镜检、分离培养，以及药敏试验等[15-16]。
　　生物(尤指病原微生物)对抗生素等药物易产生耐受和抵抗能力，即耐药性或抗药性，抗药性的产生使正常剂量的药物不再发挥应有的杀菌效果，甚至使药物完全无效，从而给疾病的治疗造成困难，并容易使疾病蔓延，因此临床上进行药物敏感试验，停止那些无效且易造成残留的药物的使用，为奶牛场中疾病的控制提供科学依据，科学合理的使用治疗药物，减少奶牛疾病造成的经济损失，保证乳制品安全和人类的健康。但许多研究证明，目前由于各奶牛场大剂量使用抗生素，导致微生物耐药性的产生，许多常见的抗生素对细菌的治疗已无效。
　　本试验采用传统的微生物检测方法，对天津里自沽和红光两个奶牛场采集的病料，进行了病原微生物的分离鉴定，并在此基础上进行了药敏试验，筛选出针对天津这两个奶牛场中存在的主要病原微生物有效的药物，为进行针对性的治疗提供科学依据，从而更好地防止病原微生物的传播和奶牛疾病的发生。
　　2 试验材料与方法
　　2.1 试验材料
　　病料：来自天津里自沽第二奶牛场150头和红光奶牛场100头发病牛的乳汁、脓汁、渗出液和病变组织。
　　试验器材：生物显微镜(麦克奥迪)、革兰氏染色液、载玻片、盖玻片、普通琼脂培养基、血液琼脂培养基、麦康凯培养基、接种环、酒精灯、药物敏感纸片、镊子、平皿。葡萄糖、氧化酶等生化反应试剂和指示剂(北京三药科技开发公司生产,中国药品生物制品检定所监制)，生化鉴定所用微量发酵管是由杭州天和微生物试剂有限公司生产。
　　2.2 试验方法
　　2.2.1 细菌学试验
　　将采集的乳汁、脓汁、渗出液、病变组织，分别划线接种于普通琼脂培养基，血液琼脂培养基，麦康凯培养基，置于37℃温箱中培养24h后观察菌落形态特征，选出典型菌落进行涂片，革兰氏染色，镜检。根据菌落形态、染色特性以及镜检结果，做出初步鉴定。
　　2.2.2 生化试验
　　从培养基中挑取可疑菌落，采用传统的方法将可疑菌分别接种于含有各种生化反应试剂的培养基中，分别进行葡萄糖、麦芽糖、乳糖、甘露醇、水杨苷七叶苷的发酵试验，接触酶、氧化酶、凝固酶试验，吲哚试验，甲基红试验，V-P试验和枸橼酸钠利用试验，根据各生化反应结果做出确切鉴定。
　　2.2.3 药敏试验
　　选用典型的分离菌株，以划线的方式分别接种于普通琼脂培养基表面，尽可能涂布得致密而均匀。用无菌镊子将不同药敏纸片分别均匀密贴于培养基表面，置于37℃温箱中培养24h后，取出观察结果。所选的抗菌药物有：青霉素、氯霉素、链霉素、庆大霉素、氧氟沙星、复方新诺明、强力霉素、环丙沙星、痢特灵、克林霉素10种药物。抑菌效果的判定：青霉素抑菌圈直径大于26㎜为高度敏感，小于10㎜为低度敏感，介于10-26㎜之间的为中度敏感，无抑菌圈的为不敏感。氯霉素抑菌圈直径大于25㎜为高度敏感，小于10㎜为低度敏感，介于10-25㎜之间的为中度敏感，无抑菌圈的为不敏感。链霉素、庆大霉素、氧氟沙星等参照抑菌效果标准以判定各种菌对药物的敏感性。
　　3 结果与分析
　　3.1 试验结果
　　3.1.1 细菌学试验结果
　　细菌学试验检测出金黄色葡萄球菌、链球菌、大肠杆菌，三种菌的生物学特性见表1。
　　表1 病原菌特性

项目	金黄色葡萄球菌	链球菌	大肠杆菌
染色	G+	G+	G-
镜检	圆形，葡萄串状	圆形或卵圆形，链状或成双	直杆，两端钝圆，散在或成对
普通琼脂培养基	湿润、光滑、隆起的圆形菌落，直径1-2㎜，金黄色	生长不良，形成针尖大小的菌落	生长良好，光滑，湿润菌落
血液琼脂培养基	菌落较大，菌落周围形成明显的溶血圈	直径0.1-1㎜，灰白色，光滑，边缘整齐的小菌落，形成溶血圈	圆形凸起光滑, 湿润的白色菌落，2-3㎜
麦康凯培养基	不生长	不生长	生长旺盛，形成红色菌落，不透明

　　3.1.2 生化试验结果
　　生化试验检测金黄色葡萄球菌、链球菌、大肠杆菌的反应结果见表2。
　　表2 病原菌生化反应特性

项目	金黄色葡萄球菌	链球菌	大肠杆菌
葡萄糖	+	+	+
麦芽糖	+	-	+
乳糖	+	+	+
接触酶	+	-	V
氧化酶	-	/	-
甘露醇	+	-	+
水杨苷	/	V	V
凝固酶	+	/	/
七叶苷	-	-	V
吲哚	/	/	+
甲基红	/	/	+
VP	V	/	-
枸橼酸钠利用	/	/	-

　　注：“+”阳性反应， “-”阴性反应， “V”种间出现不同反应， “/”是无反应
　　3.1.3 药敏试验结果
　　金黄色葡萄球菌、链球菌、大肠杆菌的药敏试验结果见表3。
　　表3 主要病原菌药敏试验结果

项目	金黄色葡萄球菌	链球菌	大肠杆菌
青霉素	中度敏感	高度敏感	中度敏感
氯霉素	高度敏感	中度敏感	中度敏感
链霉素	中度敏感	高度敏感	中度敏感
庆大霉素	不敏感	低度敏感	不敏感
氧氟沙星	高度敏感	高度敏感	高度敏感
复方新诺明	低度敏感	不敏感	中度敏感
强力霉素	高度敏感	高度敏感	中度敏感
环丙沙星	中度敏感	中度敏感	不敏感
痢特灵	不敏感	不敏感	高度敏感
克林霉素	不敏感	不敏感	不敏感

　　3.2 分析
　　3.2.1 饲养管理因素
　　卫生状况差的环境是病原微生物生长繁殖的重要场所。金黄色葡萄球菌、链球菌、大肠杆菌广泛分布于饮水、地面、土壤、空气、饲料中，不良的环境为三种菌的生长繁殖创造了有利的条件。(1)牛舍低洼、阴暗潮湿，牛床地面不清洁，粪便堆积，不及时处理，牛只拥挤，引起病原菌大量繁殖。特别是夏季牛体不清洁，牛舍通风不畅，引起蚊蝇大量的孳生，为病原菌进一步传播创造了有利的条件[17]。(2)不严格执行消毒防疫制度，挤奶时不注意卫生，挤奶工具没有进行严格消毒，挤奶方式不对，过于用力，挤奶工具配套不全，内壁弹力不规则，乳头护理不当等，使乳头组织损伤，造成三种菌的感染[18]。(3)牛体表创伤未及时处理，为三种菌的繁殖创造了有利条件。
　　3.2.2 遗传性因素
　　奶牛的体型和品种也与病原微生物的感染发病有关，品种不同，对某些病原微生物的易感性也不同。例如：具有悬垂乳房的奶牛比乳房小而结实的奶牛更易感染病原菌，因为此种乳房的乳头更接近于地面而感染金黄色葡萄球菌、链球菌、大肠杆菌 [19]。
　　3.2.3 疾病性因素
　　一些疾病如：奶牛胎衣不下、子宫内膜炎产生的病变组织和阴道分泌物感染乳头，引起奶牛乳房炎，也易发生继发性肢蹄病。犊牛和青年母牛发生外伤、关节周围蜂窝组织炎、刺伤或内源性病源从消化道、呼吸道侵入局部时可发展为脓毒性关节炎。因此多种疾病相互继发感染引起三种菌的广泛传播。
　　4 讨论
　　4.1 对细菌学试验结果的讨论
　　由于不同区域，不同时间，不同奶牛场等原因，病畜所感染的病原微生物的种类也不尽相同。因此，一种鉴定结果不能成为通用的，应根据地区实际情况进行针对性的检测、预防和治疗[20]。从本试验结果可以看出，对天津两奶牛场病牛进行细菌学分析，致病微生物中金黄色葡萄球菌、链球菌、大肠杆菌分离率最高，为主要的病原微生物，其它的菌分离率较低。其中，大部分病料样本中都是两种或两种以上的病菌共同存在的现象，选择用药时应交叉用药，不宜选择只对一种菌有效的药物。
　　4.2 对药敏试验结果的讨论
　　从药敏试验结果可以看出，强力霉素，氧氟沙星显示较好的抑菌作用，而治疗疾病中使用较多的庆大霉素，克林霉素对常见致病菌几乎无效，细菌对青霉素和链霉素也有了轻微的耐药性。根据询问调查结果了解到，两个奶牛场长期大量使用庆大霉素、克林霉素、青霉素和链霉素，致使病原菌产生耐药性。随着抗菌药物的广泛应用，耐药菌株的增多，细菌对常用抗生素的耐药性愈来愈强，给奶牛疾病治疗的选择用药带来了很大困难，这意味着当这些动物和人类发病时很多抗菌药物将无效[21]。目前,开发一种新的抗生素需要10年左右的时间，而一代耐药菌的产生只要2年时间,即抗生素的研制速度远远赶不上耐药菌的繁殖速度,如此下去,相当多的由耐药菌引起的疾病将无药可治[22]，由此，要及时进行药敏试验检测，防止耐药菌株的大量产生。
　　4.3 对疫苗预防接种的讨论
　　病原微生物检测结果表明，两奶牛场中不存在结核杆菌、炭疽杆菌，布氏杆菌以及口蹄疫病毒，主要是因为两奶牛场定期进行疫苗预防接种，预防了这些常见的结核病，炭疽病等的发生。做好正确的疫苗注射工作，使奶牛机体产生特异性抗体并保持在较高水平，可有效保护奶牛免受相应病原体的侵染[23]。预防接种及时防止了常见病的发生，减少了奶牛场的经济损失。
　　5 结论
　　5.1 细菌学试验的结论
　　在对天津里自沽和红光两个奶牛场病料分离出的病原细菌中，链球菌，大肠杆菌，金黄色葡萄球菌均为主要病菌。三种菌引起了奶牛的乳房炎、子宫内膜炎等常见病，因此在治疗方面应该选择针对链球菌，大肠杆菌，金黄色葡萄球菌强效的药物进行治疗。
　　5.2 药敏试验的结论
　　药敏试验表明奶牛致病菌对庆大霉素、克林霉素两种常用抗菌药物均已产生了很强的耐药性，尤其是克林霉素，对三种细菌已无任何抑制作用。致病菌对青霉素、链霉素强效药物也表现了轻度的耐药性，而强力霉素，氧氟沙星抑菌效果较好，是较为敏感的治疗药物。因此奶牛场在治疗时应尽量交叉用药,不宜长期使用一种药物，以防产生耐药性;另外，传染性致病菌和环境性致病菌对同一类药物的敏感性也存在一定的差异，因此,应对牛场奶牛疾病采取以防为主、防治结合的综合防治措施。根据本场实际情况，建立一整套的预防程序;对牛群要进行定期检查，详细记录检查结果，根据牛群的实际情况进行及时的防治。
　　5.3 疫苗预防接种的结论
　　里自沽和红光两个奶牛场定期进行了严格的疫苗预防接种，结核病、炭疽病，布氏杆菌以及口蹄疫等常见疾病在两奶牛场中较少见。定期预防接种疫苗的效果比较好，防止了这些疾病的发生。奶牛场以生产性为主，防患于未然，对一些常见传染性疾病宜采用预防措施，要抓好奶牛的疫苗注射工作。
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