叶黄素的测定方法研究

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[p=30, 2, center]　[size=2]　[b]叶黄素的测定方法研究[/b][/size][/p][p=30, 2, center][b]　　赵小阳 田河山[/b][/p]
　　叶黄素(Lutein)又名“植物黄体素”，分子式C40H56O2，分子量为568.88,属类胡萝卜素活性物质,因为工艺太复杂,人工合成单一异构体的叶黄素至今尚未成功,目前只有万寿菊花朵等天然植物中提取的叶黄素才含具有抗氧化作用的活性物质,作为饲料添加剂着色剂主要添加到肉鸡、蛋鸡、鸭、鱼饲料中，可使动物皮肤脂肪变黄，蛋心变红，使商品肉类蛋类品质提升，营养增加。工业色素是许多国家禁止使用的色素，在饲料中添加工业色素(黄色化学合成染料)，会对人体造成危害，食品安全的需要对饲料添加剂的安全性提出了更高的标准，本文主要介绍利用高效液相色谱法和分光光度法测定叶黄素的含量，其中高效液相色谱法可鉴别其他色素如苏丹红、日落黄、柠檬黄等的干扰，适合以植物万寿菊中脂溶性提取物为原料，经皂化后，制成水剂或采用淀粉、玉米芯粉、白炭黑等辅料，有效成分主要是叶黄素和它的同分异构体玉米黄质，也有少量的其它类胡萝卜素和腊质，在饲料工业中作为着色剂类饲料添加剂叶黄素的检测。
　　1. 实验方法
　　除特殊说明外，所用试剂均为分析纯，标准溶液和杂质溶液的制备应符合GB/T602和GB/T603的规定。
　　1.1 试剂和溶液
　　1.1.1 正己烷：色谱纯。
　　1.1.2 乙酸乙酯：色谱纯。
　　1.1.3 正己烷。
　　1.1.4 无水乙醇。
　　1.1.5 丙酮。
　　1.1.6 甲苯。
　　1.1.7 提取剂:正己烷+乙醇+丙酮+甲苯=10+6+7+7(V+V+V+V)。
　　1.2 仪器和设备
　　实验室常用设备;
　　1.2.1 超声波水浴。
　　1.2.2 紫外分光光度计。
　　1.2.3 石英比色皿(1cm)。
　　1.2.4 高效液相色谱仪，带紫外可调波长检测器(或二极管矩阵检测器)。
　　1.3 鉴别试验
　　1.3.1 原理
　　叶黄素含量以总类胡萝卜素含量表示，试样中总类胡萝卜素经混合溶剂提取后，注入正相色谱柱上，用流动相洗脱，分离出叶黄素和玉米黄质，其色谱峰的分离度为3.06-3.09,叶黄素含量应在70%以上，玉米黄质含量在10%以上，并通过峰面积比例测知其相对含量。
　　1.3.2 试样溶液的制备
　　根据产品含量，称取试样约0.15g～0.2g，(精确至0.0002g)，置于100mL棕色容量瓶中，加提取剂(1.1.7)约80mL，在超声波水浴中加热超声提取20min，冷却至室温，用提取剂(1.1.7) 定容至刻度，混匀，过滤,用移液管准确移取1mL滤液到10mL容量瓶中,用氮气吹干,用流动相稀释至刻度,混匀,溶液过0.45μm滤膜，供高效液相色谱仪分析。
　　1.3.3 色谱条件：
　　固定相：硅胶柱：内径4.6mm，长250mm，粒度3µm。
　　流动相：正己烷+乙酸乙脂=70+30(V+V)，超声脱气。
　　流速： 1.5mL/min。
　　检测器：紫外可调波长检测器(或二极管矩阵检测器)，检测波长446nm或474nm。
　　进样量：20µL。
　　1.3.4 试样测定：将试样分析液(1.3.2),按上述色谱条件进行进样分析,得到叶黄素和玉米黄质，色谱峰可参见图1。
　　1.3.5 结果计算：
　　叶黄素(%)=总类胡萝卜素量×叶黄素的峰面积% …………………(1)
　　玉米黄质(%)=总类胡萝卜素量×玉米黄质的峰面积% ……………(2)
　　1.4 叶黄素含量的测定
　　1.4.1 原理
　　叶黄素在波长446nm±1nm处有最大吸收，可根据该波长处测定吸收度和标准百分吸光系数( )计算其含量。
　　1.4.2 试样溶液的制备
　　根据产品含量，称取试样约0.15g～0.2g，(精确至0.0002g)，置于100mL棕色容量瓶中，加约80mL无水乙醇(1.1.4)，在超声波水浴中加热超声提取20min，冷却至室温，用无水乙醇(1.1.4)定容至刻度，混匀，过滤，用移液管准确移取1mL滤液到10mL容量瓶中，用无水乙醇(1.1.4)稀释至刻度,混匀。
　　1.4.3 试样的测定
　　将试样分析液(1.4.2)置于1cm石英池中,用紫外分光光度计,在波长446nm±1nm处测定吸收度A,以无水乙醇(1.1.4)为空白对照。
　　1.4.4 计算和结果的表示
　　试样中叶黄素(C40H56O2)(以总类胡萝卜素计)含量X以质量分数(%)表示，按式(3)计算：
　　X= …………………(3)
　　式中：
　　A—试料(1.4.2)吸收度读数;
　　1000—试料(1.4.2)稀释倍数;
　　m—试料质量，单位为克(g);
　　2550—叶黄素百分吸光系数( =2550);
　　平行测定结果用算术平均值表示,保留三位有效数字。
　　1.4.5 重复性
　　同一分析者对同一试样同时两次平行测定结果的绝对值之差应不大于0.3%。
　　2. 产品含量检验方法的建立
　　2.1 色谱条件的选择
　　样品的乙醇溶液用分光光度计测定，以1cm石英比色皿在420～480nm波长范围内测定试样溶液的吸收光谱，在445nm±1nm、473nm±1nm的波长处有最大吸收峰，光谱图见图一，色谱图见图二。
　　图一:
　　
　　No. nm Abs
　　1 473.50 0.589
　　2 445.00 0.687
　　图二:
　　
　　叶黄素保留时间：14.801min,玉米黄质保留时间：18.292min。
　　2.2 提取剂的选择
　　叶黄素含量测定方法采用紫外分光光度法，我们选择两种提取剂做比较，参照JECFA(2004)方法中用正己烷+乙醇+丙酮+甲苯=10+6+7+7(V+V+V+V)做样品提取剂，根据叶黄素易溶于乙醇的性质，用乙醇做样品提取剂，用分光光度计测定，以1cm石英比色皿在445nm波长处测定试样溶液的吸收光谱，我们收集不同厂家产品进行测定，对比测定结果见表一。
　　表一 不同提取剂测定结果对比[table]
[tr][td=1,1,205][p=30, 2, center][font=宋体]生产厂家[/font][font=宋体][size=10.0pt][/size][/font][/p][/td][td=1,1,206][p=30, 2, center][font=宋体]混合溶剂提取（%）[/font][font=宋体][size=10.0pt][/size][/font][/p][/td][td=1,1,206][p=30, 2, center][font=宋体]无水乙醇提取（%）[/font][font=宋体][size=10.0pt][/size][/font][/p][/td][/tr]
[tr][td=1,1,205][p=30, 2, center][font=宋体]厂家一[/font][font=宋体][size=10.0pt][/size][/font][/p][/td][td=1,1,206][p=30, 2, center][font=宋体]1.47[/font][font=宋体][size=10.0pt][/size][/font][/p][/td][td=1,1,206][p=30, 2, center][font=宋体]1.55[/font][font=宋体][size=10.0pt][/size][/font][/p][/td][/tr]
[tr][td=1,1,205][p=30, 2, center][font=宋体]厂家二[/font][font=宋体][size=10.0pt][/size][/font][/p][/td][td=1,1,206][p=30, 2, center][font=宋体]1.41[/font][font=宋体][size=10.0pt][/size][/font][/p][/td][td=1,1,206][p=30, 2, center][font=宋体]1.36[/font][font=宋体][size=10.0pt][/size][/font][/p][/td][/tr]
[tr][td=1,1,205][p=30, 2, center][font=宋体]厂家三[/font][font=宋体][size=10.0pt][/size][/font][/p][/td][td=1,1,206][p=30, 2, center][font=宋体]1.18[/font][font=宋体][size=10.0pt][/size][/font][/p][/td][td=1,1,206][p=30, 2, center][font=宋体]1.29[/font][font=宋体][size=10.0pt][/size][/font][/p][/td][/tr]
[/table]
　　两种提取剂测定结果差异不大，考虑到甲苯对人体危害较大,本方法样品中叶黄素含量的测定采用无水乙醇做提取剂,方法简单,结果准确。
　　2.3 不同厂家生产的饲料添加剂叶黄素检验结果与标示量对比
　　选取不同厂家不同批号的产品,按照本方法确定的实验条件进行含量的测定，其结果见表二。
　　表二 不同厂家的产品含量检验结果与标示量对比[table]
[tr][td=1,1,114][p=30, 2, center][font=宋体]样品代号[/font][/p][/td][td=1,1,192][p=30, 2, center][font=宋体]叶黄素含量检验结果（%）[/font][/p][/td][td=1,1,181][p=30, 2, center][font=宋体]叶黄素标示量（%）[/font][/p][/td][td=1,1,170][p=30, 2, center][font=宋体]占标示量（%）[/font][/p][/td][/tr]
[tr][td=1,1,114][p=30, 2, center][font=宋体]1[/font][/p][/td][td=1,1,192][p=30, 2, center][font=宋体]1.52[/font][/p][/td][td=1,1,181][p=30, 2, center][font=宋体]1.60[/font][/p][/td][td=1,1,170][p=30, 2, center][font=宋体]95[/font][/p][/td][/tr]
[tr][td=1,1,114][p=30, 2, center][font=宋体]2[/font][/p][/td][td=1,1,192][p=30, 2, center][font=宋体]1.82[/font][/p][/td][td=1,1,181][p=30, 2, center][font=宋体]1.60[/font][/p][/td][td=1,1,170][p=30, 2, center][font=宋体]114[/font][/p][/td][/tr]
[tr][td=1,1,114][p=30, 2, center][font=宋体]3[/font][/p][/td][td=1,1,192][p=30, 2, center][font=宋体]1.36[/font][/p][/td][td=1,1,181][p=30, 2, center][font=宋体]1.50[/font][/p][/td][td=1,1,170][p=30, 2, center][font=宋体]91[/font][/p][/td][/tr]
[tr][td=1,1,114][p=30, 2, center][font=宋体]4[/font][/p][/td][td=1,1,192][p=30, 2, center][font=宋体]2.24[/font][/p][/td][td=1,1,181][p=30, 2, center][font=宋体]2.00[/font][/p][/td][td=1,1,170][p=30, 2, center][font=宋体]112[/font][/p][/td][/tr]
[tr][td=1,1,114][p=30, 2, center][font=宋体]5[/font][/p][/td][td=1,1,192][p=30, 2, center][font=宋体]2.18[/font][/p][/td][td=1,1,181][p=30, 2, center][font=宋体]2.00[/font][/p][/td][td=1,1,170][p=30, 2, center][font=宋体]109[/font][/p][/td][/tr]
[tr][td=1,1,114][p=30, 2, center][font=宋体]6[/font][/p][/td][td=1,1,192][p=30, 2, center][font=宋体]1.38[/font][/p][/td][td=1,1,181][p=30, 2, center][font=宋体]1.50[/font][/p][/td][td=1,1,170][p=30, 2, center][font=宋体]92[/font][/p][/td][/tr]
[/table]
　　以上结果表明, 按照本方法测定样品含量，均为样品标示量的90%以上,本方法有较好的准确度。
　　2.4 方法精密度(重复性)
　　选取同一批叶黄素饲料添加剂，按照本方法确定的条件进行重复实验，制备五份溶液，测试饲料添加剂叶黄素的含量，测定结果见表三。
　　表三 同一样品重复测定五次结果[table]
[tr][td=1,1,328][p=30, 2, center][font=宋体]测定次数[/font][/p][/td][td=1,1,328][p=30, 2, center][font=宋体]叶黄素含量(%)[/font][/p][/td][/tr]
[tr][td=1,1,328][p=30, 2, center][font=宋体]1[/font][/p][/td][td=1,1,328][p=30, 2, center][font=宋体]2.35[/font][/p][/td][/tr]
[tr][td=1,1,328][p=30, 2, center][font=宋体]2[/font][/p][/td][td=1,1,328][p=30, 2, center][font=宋体]2.17[/font][/p][/td][/tr]
[tr][td=1,1,328][p=30, 2, center][font=宋体]3[/font][/p][/td][td=1,1,328][p=30, 2, center][font=宋体]2.24[/font][/p][/td][/tr]
[tr][td=1,1,328][p=30, 2, center][font=宋体]4[/font][/p][/td][td=1,1,328][p=30, 2, center][font=宋体]2.19[/font][/p][/td][/tr]
[tr][td=1,1,328][p=30, 2, center][font=宋体]5[/font][/p][/td][td=1,1,328][p=30, 2, center][font=宋体]2.21[/font][/p][/td][/tr]
[/table]
　　对于同一样品，其变异系数(CV%)为3.2%，本方法有较好的精密度、重复性。
　　2.5 同一分析者对同一试样同时两次平行测定结果绝对值之差的确定
　　选择不同产品做两次平行测定，测定结果见表四。
　　表四 不同产品两次平行测定结果绝对值之差[table]
[tr][td=1,1,160][p=30, 2, center][font=宋体]样品代号[/font][/p][/td][td=1,1,224][p=30, 2, center][font=宋体]叶黄素含量[/font][/p][p=30, 2, center][font=宋体]
[/font][font=宋体]（%）[/font][/p][/td][td=1,1,156][p=30, 2, center][font=宋体]绝对值之差[/font][/p][p=30, 2, left][font=宋体]（%）[/font][/p][/td][/tr]
[tr][td=1,2,160][p=30, 2, center][font=宋体]1[/font][/p][/td][td=1,1,224][p=30, 2, center][font=宋体]1.55[/font][/p][/td][td=1,2,156][p=30, 2, center][font=宋体]0.03[/font][/p][/td][/tr]
[tr][td=1,1,224][p=30, 2, center][font=宋体]1.52[/font][/p][/td][/tr]
[tr][td=1,2,160][p=30, 2, center][font=宋体]2[/font][/p][/td][td=1,1,224][p=30, 2, center][font=宋体]1.99[/font][/p][/td][td=1,2,156][p=30, 2, center][font=宋体]0.17[/font][/p][/td][/tr]
[tr][td=1,1,224][p=30, 2, center][font=宋体]1.82[/font][/p][/td][/tr]
[tr][td=1,2,160][p=30, 2, center][font=宋体]3[/font][/p][/td][td=1,1,224][p=30, 2, center][font=宋体]1.57[/font][/p][/td][td=1,2,156][p=30, 2, center][font=宋体]0.02[/font][/p][/td][/tr]
[tr][td=1,1,224][p=30, 2, center][font=宋体]1.55[/font][/p][/td][/tr]
[tr][td=1,2,160][p=30, 2, center][font=宋体]4[/font][/p][/td][td=1,1,224][p=30, 2, center][font=宋体]2.17[/font][/p][/td][td=1,2,156][p=30, 2, center][font=宋体]0.07[/font][/p][/td][/tr]
[tr][td=1,1,224][p=30, 2, center][font=宋体]2.24[/font][/p][/td][/tr]
[tr][td=1,2,160][p=30, 2, center][font=宋体]5[/font][/p][/td][td=1,1,224][p=30, 2, center][font=宋体]2.56[/font][/p][/td][td=1,2,156][p=30, 2, center][font=宋体]0.19[/font][/p][/td][/tr]
[tr][td=1,1,224][p=30, 2, center][font=宋体]2.37[/font][/p][/td][/tr]
[/table]
　　测定结果表明，本方法两次平行测定结果绝对值之差均小于0.3%,在实验方法中,将该值定为小于0.3%。
　　实验证明,本方法有较好的准确度与精密度,方法合理,操作便捷,适合饲料添加剂叶黄
　　素的检测。
　　赵小阳 国家饲料质量监督检验中心(北京)，化学分析高级实验师。
　　田河山 中国农业科学院农业质量标准与检测技术研究所，动物营养研究员

微生态岳阳

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