纤维素酶酶解小麦麸皮技术初步研究

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　　纤维素酶酶解小麦麸皮技术初步研究

　　王在贵 刘朝良* 王云生

　　(安徽农业大学生命科学学院)

　　摘要：本试验采用还原糖法研究了不同酶解时间、温度、pH及酶浓度条件对纤维素酶酶解小麦麸皮效果的影响。结果表明纤维素酶酶解小麦麸皮的最适条件为：酶解时间为15min，温度为37℃，pH值为6，最适酶浓度为0.04IU/m。
　　关键词：纤维素酶;小麦麸皮;酶解
　　Preliminary Study on Cellulase Enzymolysis Technology on Wheat bran
　　Wang zaigui Liu zhaoliang Wangyunsheng
　　(Life Sciences College，Anhui Agricultural Unmversity)
　　Abstract : The technology of wheat bran degradation with cellulose by DNS method was researched and the main reaction condition that included differential reaction time, temperature, pH and enzyme concentration influencing the effection of cellulase degrading wheat bran was researched.The results showed that the appropriate condition for cellulose activity degrading cellulose in wheat bran was that the reaction time was 15 min, the reaction temperature was 37 ℃, and pH 6.0, the enzyme concentration was 0.04 IU/mL.
　　Key word: Cellulase;Wheat bran;Cellulose degeneration
　　纤维素是世界上最丰富的可再生资源, 我国每年仅作物秸秆的纤维产量就达2亿吨以上，开发和利用纤维素是促进我国畜牧业可持续发展的有效途径之一。除反刍动物瘤胃微生物可发酵利用纤维素外，其他家畜禽消化道缺乏纤维素酶，对纤维素不能有效利用或利用率低。小麦麸皮常被用作动物饲料，因含有较高的纤维素类物质而限制了其在配方中的用量。利用纤维素酶酶解小麦麸皮中纤维素是解决这一问题的有效途径之一。所以，对纤维素酶的研究开发是提高含纤维素类饲料资源利用效率的重要途径。随着菌种选育和发酵技术的快速发展，饲用纤维素酶将在畜牧业生产中产生不可低估的作用。
　　1.材料与方法
　　1.1材料 纤维素酶(由某生物公司提供，于-30℃冰箱中保存);小麦麸皮(于电热恒温鼓风干燥箱中干燥24小时备用)。
　　1.2主要仪器和设备 电热恒温鼓风干燥箱;台式电子天平;精密pH计;7220型分光光度计;恒温水浴锅。
　　1.3试剂 3,5-二硝基水杨酸(DNS);羧甲基纤维素钠(CMC-Na)。
　　1.4标准曲线的绘制与酶解反应体系
　　1.4.1标准曲线的绘制 分别吸取浓度为0.01mg/ml葡萄糖0、0.2、0.3、0.4、0.5、0.6、0.7、0.8ml于试管中(做3个平行)，以蒸馏水补加到1.5ml。再加入DNS试剂3ml，沸水浴10min，取出后用自来水冷却，加入10ml蒸馏水稀释混匀，测定吸光度OD550值，以葡萄糖毫克数为横坐标， OD550为纵坐标绘制出标准曲线。
　　1.4.2酶解反应体系 称取0.5g麸皮于试管中，加入纤维素酶液5ml，按照设定条件做酶解反应后，吸取酶解液1.5ml于试管中，同上方法测定OD550值，对照标准曲线即可换算出还原糖含量。空白样不进行酶解反应，反应样设两个平行样。
　　1.5酶活力测定(吉尔鲍特，1983)
　　1.5.1酶活力单位定义。在一定的温度和pH条件下，1min从底物溶液中分解产生1μmol还原糖(表示为还原糖当量)所需要的酶量为一个酶活力单位(IU)进行换算。
　　1.5.2底物。底物为1.5%CMC-Na。
　　1.5.3酶液制备。准确称取取1.000g该酶制剂，用去离子水稀释200倍待测定酶活力用。
　　1.5.2酶活力测定体系。反应体系添加1.4ml底物，预热10min后加0.1ml酶液，反应10min后按照标准曲线方法测定还原糖生成量，即可换算出酶活力值。以上均为静止恒温水浴体系，分别设置1下空白样和2个平行样。空白管先加1.4ml底物，10分钟后加3mlDNS试剂，再加酶样0.1ml，沸水浴显色10min，其余同前。
　　2. 结果
　　2.1温度对酶解效果的影响 上述反应体系中，设定初始条件为pH6.0、反应时间15分钟，分别于30、35、40、50℃分别测定还原糖释放量。结果(图1)显示，纤维素酶酶解小麦麸皮的最适温度为37℃，从30℃到37℃还原糖释放量上升较快，37℃后趋于下降。
　　
　　2.2反应时间对酶解效果的影响 上述反应体系(pH6.0、温度为37℃)分别设定反应时间为10、15、20、30、40min。测定还原糖释放量，结果(图2)显示，纤维素酶酶解小麦麸皮随着反应时间的延长还原糖释放量逐渐增加，15分钟后增加缓慢。
　　
　　由图2可看出，纤维素酶水解小麦麸皮的最佳时长约为17min，因为反应时间越长，实际生产成本也会越大，所以选定反应时长17min作为最佳。
　　2.3 pH值对酶解效果的影响 上述反应体系(其他条件为最适条件)分别设定pH4.0、5.0、6.0、7.0、8.0测定还原糖释放量，结果(图3)显示，纤维素酶水解小麦麸皮的最适pH为 6.0，由于此pH值接近生活用水的pH值，所以在实际生产中应用较为方便。
　　
　　2.4 酶浓度对酶解效果的影响 将反应体系中的纤维素酶浓度设定为0.01、0.02、0.04、0.08IU/ml，测定还原糖释放量，结果(图4)显示，随着酶浓度的增加，还原糖释放量也逐渐增加，但从0.04-0.08IU/ml范围增加幅度放缓。最佳酶浓度在0.04IU/ml左右。
　　 4.讨论与结论
　　小麦麸皮中纤维素类物质主要为纤维素、木聚糖和木质素等，其中纤维素可被最终降解成葡萄糖供动物吸收利用。而木聚糖和木质素的最终降解产物能否被动物吸收利用目前尚无明确报道。纤维素被酶解成低聚糖对动物肠道具有保护作用，而且酶作为蛋白质本身安全无毒，在饲料中适量添加是不会对动物产生有害影响的。这些都为纤维素酶在饲料中的应用提供理论和实际依据。
　　全价颗粒饲料的生产常伴有调质和挤压制粒过程，虽然饲料中含有的纤维素对酶具有保护作用，但高温造粒仍然会造成一定程度的酶活力损失，影响该酶的实际使用效果。而体外酶解小麦麸皮可将条件控制得较温和，减少酶活力损失，有利于该酶发挥最大潜力，且酶在随饲料进入动物消化道后仍然发挥作用，可见体外酶解小麦麸皮方法可产生较为广泛的作用。通过王在贵等(2006)对该酶的研究可以看出，该酶在动物消化道可以发挥最大酶活力。
　　本实验中使用的纤维素酶最适温度比常温稍高，特别是夏季酶解条件比较易于达到和控制。最适酶解时间较短，有利于缩短生产周期，提高生产效率。最适作用pH在5.0~6.0，这和我国南方某些地方的自来水pH值比较接近，酶解条件比较容易控制。从实验2.2结果可以看出，随着反应时间的延长，产物还原糖生成的量逐渐增加，对反应速度产生了限制作用，但如果在动物消化道内，新产生的葡萄糖和二糖可被迅速吸收，酶解反应得以继续维持，可见在体外可以适当控制酶解时间，提高生产效率。从实验2.4结果可以看出，酶和其作用底物的相对浓度都可对反应速度产生较大的影响，可见在实际生产中合理控制酶的添加浓度有利于节约成本，提高生产效率。
　　目标酶的选择也十分关键，一般情况下，应选择在体外能够高效酶解小麦麸皮且稳定性好、到体内仍可发挥作用的酶，所以生产前往往需要研究酶的特性，评价酶的使用效果，以便做合理取舍，这样才能够达到较好的酶解效果。
　　参考文献
　　[1]吉尔鲍特(美).酶法分析手册[M].上海科学技术出版社,1983,第1版
　　[2]武汉大学主编.分析化学[M].北京：高等教育出版社，2000,第3版
　　[3]王在贵，张莉，张宏福等.纤维素酶的酶学性质研究[J] .中国饲料，2006(1)：12~14.
　　[4]邹国林，朱汝潘编著.酶学[M].武汉：武汉大学出版社,第1版

ququ51

谢谢楼主分享

saturnbio

谢谢分享！

郑旭阳

体外生物学效率实验,一个关键问题是如何模拟动物的消化道环境,
1. 大家将焦点聚集在温度,PH, 时间, 胃蛋白酶和小肠液处理,
2. 但是严重忽视了试管内的酶制剂,底物浓度要和酶制剂在全价饲料中的剂量基本相符,
3.也许,相符后,有些酶制剂根本得不到降解产物, 原封未动,

lilyyang

体外生物学效率实验,一个关键问题是如何模拟动物的消化道环境.
是呀，体内与休外实验相差很大的。