波尔山羊良种繁育技术试验研究

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　　波尔山羊良种繁育技术试验研究

　　余 华1 叶健强2*

　　(1. 四川出入境检验检疫局，四川 成都 610041;

　　2. 四川省畜牧科学研究院， 四川 成都, 610066)

　　波尔山羊是南非育成的一个世界公认的著名优秀肉用山羊良种，具有体躯高大，后躯发达，生长发育快，肉质好，屠宰率高，繁殖无季节性，适应性强，杂交改良当地山羊效果显著等特点。我国于1995年开始少量引进布尔山羊，并通过与当地羊杂交取得了显著的改良效果和经济效益。现在由于我国国内的波尔山羊引种数量有限，纯种羊数量少，因此需要大量的扩繁纯种的波尔山羊。在自然纯繁的基础上，为了加速纯种繁育，我们开展了优秀波尔山羊胚胎移植工作。胚胎移植可以最大限度地发挥纯种优秀母羊的繁殖潜力和优秀遗传基因的利用，大大加快良种羊的纯种繁育速度，提高繁殖效率，诱发母羊产多胎，扩大良种羊群等。本研究根据胚胎移植的关键技术(供体羊和受体羊的选择、供体羊超数排卵处理和配种、人工授精、受体羊同期发情处理、胚胎回收与鉴定、胚胎保存和胚胎移植等)已经形成一套成熟的波尔山羊良种繁育技术方案，应用于波尔山羊的规模化生产。
　　1 材料和方法
　　1.1材料
　　1.1.1 试验种母羊、种公羊 试验种母羊为国外引进的原种波尔山羊母羊或其所产后代，临床健康, 断奶一个月以上，生殖器官无可见异常。种公羊为国外引进的原种波尔山羊或其所产后代，年龄2～4岁，临床健康，性欲旺盛，精液品质优良。
　　1.1.2试验用受体羊 受体羊是从不同地区购入的有正常繁殖史的经产雅安奶山羊、成都麻羊、简阳大耳羊和南江黄羊，或体格发育成熟的青年母羊，并适应饲养一个月以上，临床健康。
　　1.1.3 药品及试剂 促卵泡素[FSH，国营宁波激素制品厂(宁一厂)，批号20000629、20010515;宁波第二激素厂(宁二厂),批号2000618、20010602;澳大利亚产，批号COIIV-L080;中科院动物所，2002年生产]。促排卵素3号(LRH-A3, 宁波第二激素厂，批号20000220)。氯前列烯醇(PG，上海市计划生育科学研究所，批号02717)。羊实用型炔诺酮阴道栓(西北农林科技大学小动物胚胎工程二室试制)。胚胎回收液体(冲卵液)：含2～5%灭活新生犊牛血清(NCS)的磷酸盐缓冲液(PBS)，用国产分析纯试剂自配。胚胎保存液：含20% NCS的PBS。
　　1.1.44 主要器械及设备 腹腔镜，体视显微镜，恒温水浴锅，手术器械，自制手术保定台，自制专用胚胎回收及移植器械。
　　1.2 方法
　　1.2.1 超数排卵处理 将初选合格的波尔山羊母羊，用实用型炔诺酮阴道栓进行预处理。预处理7～10 d后开始采用FSH-PG法进行超数排卵。方法1：生理盐水稀释FSH，按递减法多次注射;方法2: 用30%聚乙烯吡咯烷酮(PVP)溶液稀释后一次注射总剂量。两种方法都分别在注射FSH后60 h和72 h注射PG，并在第一次注射PG时撤除阴道栓。母羊发情后每隔8～12 h配种一次，至发情结束。发情配种当天计为0 d, 在第5 d用腹腔镜检查卵巢反应，适宜手术回收胚胎者在第6 d用手术法回收子宫胚胎。
　　1.2.2 胚胎回收与质量鉴定 手术前将手术羊空腹24小时,术前麻醉、保定,术部剃毛、消毒，进行胚胎回收。回收液体静置2～5 min后，将集卵杯置体视显微镜下(15～20×)捡卵,并用新鲜的操作液体净化胚胎2～3次，在60×下对胚胎进行形态质量分级，A、B、C级定为可用胚，置胚胎保存液中待移植，或进行胚胎分割或冷冻，剔除D级胚及未受精卵。
　　1.2.3 受体同期发情处理程序及同期发情有效性判定 用国产炔诺酮阴道栓、FSH和PG组成三种诱导山羊同期发情的处理程序，对初选合格的母羊进行同期发情处理。程序1：阴道放置羊实用型炔诺酮阴道栓(0d)，11d撤栓，同时肌注FSH 33单位;程序2：放置炔诺酮阴道栓(0d)，10d肌注FSH 25单位，12h后撤栓，同时二次肌注FSH 25单位，并注射PG 0.1mg;程序3：肌注PG 0.1mg(0d)，6d放置炔诺酮阴道栓，16d肌注FSH 25单位，12h后撤栓，同时二次肌注FSH 25单位，并注射PG 0.1mg。处理程序从撤除炔诺酮阴道栓结束，从撤栓后12h开始，每隔12h用试情公羊试情，观察发情情况，母羊接近公羊、摇尾、接受公羊爬跨或母羊互相爬跨者判定为发情，96h内发情者为同期发情处理有效。记录发情羊号，并继续试情、记录每只羊的发情持续期，观察到一次发情者持续期记为12 h、观察到二次发情者持续期记为24 h，依此类推，直到连续发情结束。在发情结束后5 d用腹腔镜观察发情羊卵巢上排卵及黄体发育情况，记录黄体侧别及黄体数和质量，并记录未排卵卵泡大小及数量，卵巢上卵泡正常发育、排卵并形成正常功能黄体，同时卵巢上无卵泡或只有较小卵泡的受体羊作为可用受体，于5～6 d进行手术胚胎移植;或在手术时探察并记录卵巢上排卵及黄体发育情况，排卵并发育为功能黄体的受体进行胚胎移植。
　　1.2.4 胚胎移植 采用手术方法将保存的可用胚移植于同期发情的受体羊黄体侧子宫角前1/3。移植器械为自制专用胚胎移植器械，移植手术时，做到操作轻巧、动作稳妥可靠、避免过度牵拉生殖器官、禁止挤压卵巢，以尽量减轻手术损伤。胚胎移植效率以移植受体妊娠率和移植胚胎最终发育为出生羔羊的胚胎成羔率计算，其中妊娠受体只计算妊娠到期产羔和观察到的流产受体。统计分析受体妊娠率和胚胎成羔率。
　　2 结果
　　2.1 超数排卵结果
　　共超排处理120只波尔山羊，回收胚胎1849枚,平均每只15.4±7.20枚，其中可用胚16.8枚，平均13.4±7.94枚，各年度超排结果见表1。
　　表1 波尔山羊超数排卵结果

年 度	羊数(只)	回收卵数(枚)		可用胚数(枚		可用胚比率(%)
		总数	平均数(±Sd)	总数	平均数(±Sd)
2003	40	608	15.2±10.06a	538	13.5±8.01a	88.5 a
2004	50	752	15.0±9.25a	658	13.2±8.26 a	87.5 a
2005	30	481	16.0±7.05 a	412	13.7±7.82 a	85.8 a
合计	120	1849	15.4±7.20	1608	13.4±7.94	87.0

　　同列上标字母不同者差异显著 P<0.05
　　2.2同期发情结果
　　共处理了1218只受体山羊，各年度同期发情只数、发情羊正常排卵并形成功能黄体的只数及处理羊总有效率情况见表2。
　　表2 受体山羊同期发情结果

年 度	处理只数(只)	发情只数(只)	排卵并形成功能黄体只数(只)	处理羊总有效率(%)
2003	400	385	366	91.5
2004	500	492	453	90.6
2005	318	306	282	86.8
合计	1218	1183	1101	90.4

　　2.3胚胎移植结果
　　将1608枚新鲜胚胎移植给961只受体，受体妊娠率达64.3%，胚胎成羔率达54.%。各年度胚胎移植结果见表3
　　表3 新鲜胚胎移植结果

年 度	移植受体数	移植胚胎数	妊娠受体数 (受体妊娠率%)	产羔数 (胚胎成羔率%)
2003	320	538	214(66.9)	270(50.2)
2004	412	658	253(61.4)	380(57.8)
2005	229	412	151(66.0)	218(53.0)
合计	961	1608	618(64.3)	868(54.0)

　　3 分析
　　3.1 超排效果稳定性分析
　　从表1统计的结果看，在三个年度进行超排时，都能够取得较满意的超排效果，平均回收卵数15.4±7.20枚，平均获得桑葚胚及囊胚期可用胚13.4±7.94枚，优于或类似于同期报道的波尔山羊超排结果，但其中有的报道采用的是胚胎回收率相对较高的输卵管回收法，这种回收方法对生殖器官的损伤相对较大，易造成生殖器官粘连，而且移植产羔率也相对较低。经统计分析，各年度超排羊回收卵平均数和可用胚平均数之间及各年度回收卵可用胚比率间均无显著差异(P>0.05)。说明我们的超排程序已经达到了非常稳定的效果。
　　影响超数排卵有效性的因素很多，有个体差异，超排激素的来源、剂量、注射程序，供体羊的营养、繁殖生理状况等多种因素。根据我们的试验研究经验，归纳以下几点：①用PVP液稀释FSH后单次注射的超排结果较好，但这种注射方法的一个主要缺陷是，处理程序结束后超排羊开始发情的时间差异太大，而且发情持续期差异也比较大，在生产条件下进行产业化应用时，难以安排合适的发情同期化的受体羊进行胚胎移植，不适于产业化胚胎移植的精确化和标准化的要求。②采取适宜的超排程序，只要激素质量有所保证，国内与国外生产的激素用于波尔山羊超排均是可行的，而且超排激素的国产化对良种山羊胚胎移植产业化具有重大意义，可以降低应用成本，增加经济效益，促进国产胚胎移植产品的系列化配套。③我们试验性地在春季进行了少量的超数排卵处理，取得了满意的超排效果，与秋季超排结果无显著差异。④体质较差的母羊，其营养水平不能满足卵泡的正常发育和排卵，从而会影响超排的有效性。⑤在胚胎移植产业化应用时，必须选择生长发育完全成熟的经产母羊进行超排，而且以2～3胎母羊超排效率较高。⑥首次超排效果较好的供体母羊可以进行重复超排，只要不严重损伤生殖器官，进行重复超排时仍能取得较满意的超排效果。这将会大大提高胚胎移植供体羊的有效利用率。
　　3.2 同期发情效果分析
　　在发情周期的不同阶段，母畜生殖器官的内分泌环境、生化和组织学特性，对不同发育阶段的胚胎有不同的影响。所以在胚胎移植工作中，应做到使受体与供体的发情同期化，并将胚胎移植到与供体处于相应发情阶段的受体生殖道(子宫或输卵管)的适当部位，使胚胎在受体所处环境的生理状态与供体相同，才能继续发育。所以在山羊胚胎移植规模化生产应用中，提高受体羊同期发情效率、从而提高受体羊利用率，是胚胎移植成功与否、效益大小的关键技术之一。
　　我们在研究中，完全选用国产炔诺酮阴道栓、促卵泡素(FSH)和氯前列烯醇(PG)等同期发情制剂，首先用程序1诱导山羊同期发情，并加以改进逐渐过渡到使用程序2及程序3，形成了较为有效和标准化的处理程序。同时，用该程序处理羊同期发情后正常排卵并形成功能黄体的比率也非常高，这一指标能准确反映处理羊最终能够作为胚胎移植可用受体的比例(即同期发情总有效率)，能为合理安排供、受体羊比例提供了准确的基础数据。与国外、或国内使用进口同期发情处理制剂的同类研究相比，同期发情效率及稳定性较高。而且通过对不同同期发情制剂及辅助处理方法的改进，使同期发情总有效率逐渐提高。
　　在同期发情处理中主要采用孕激素及其类似物、前列腺素，促性腺激素一般只作为辅助处理制剂，可以提高同期发情效率。前列腺素处理法是溶解母羊卵巢上的黄体而诱导同期发情的方法，使用简单方便，但其缺点是只对卵巢上有黄体的母羊起作用，对发情周期不正常、不处于发情周期黄体期或某些季节卵巢相对静止的羊只无效，相对而言其同期发情效率不如孕激素处理法高，所以在胚胎移植中要达到一定数量的可用受体，必须增加被处理母羊的基数，这样势必增加胚胎移植中受体羊数量和饲养管理的成本。孕激素及其类似物处理法的可以克服前列腺素处理法的不足，常常与促性腺激素配合使用而同期发情效率较高，所以我们在研究初期即选用这种方法进行受体羊同期发情处理(程序1)，而且选用近年应用较多的短周期处理(11 d)，在研究应用过程中还配合去栓时加注小剂量PG的处理方法(程序2)，以增加同期性。为了进一步增加同期发情总有效率，降低受体羊群的数量，我们根据山羊发情周期中生殖内分泌基本规律，又对处理程序做了进一步改进，在放置炔诺酮阴道栓前加用一次小剂量PG，调整整个羊群的发情周期，之后再用炔诺酮阴道栓预处理，经过一个孕激素作用周期，使受处理的所有羊只的生殖生理状态进一步统一，从而取得了非常满意的同期发情有效性。
　　三种程序处理的受体山羊，大部分集中在去栓后24～60 h发情，发情持续期集中在24～60 h，各程序之间也无统计学差异，三个处理程序诱导同期发情的羊只发情特点的类似，说明方法的不同会产生不同的同期发情处理结果，而不会改变母羊的发情生理表现，而恰恰这一点也是我们在胚胎移植工作中所关心的关键问题之一，进一步说明我们所采用的同期发情处理程序，不仅有效，而且不会改变发情羊生殖生理规律，而对提高胚胎移植效率有较大的实际意义。
　　在山羊胚移中，一般要求供、受体羊同期化程度为供体与受体同步差在±24 h内，而且最好是-12 h，即受体羊晚于供体羊。而供、受体羊发情同期化的实质应该是排卵时间的同期化，山羊的排卵时间一般都在发情结束之前的一段时间，这就需要以发情结束时间来判断同期化。在波尔山羊胚胎移植中，安排受体同期发情程序的结束点时，受体羊的撤栓时间应安排在比供体提前12 h～20 h左右为宜。
　　3.3 胚胎移植效率分析
　　胚胎移植数量、受体羊品种、黄体数量及质量对胚胎移植效率的均有影响。移植胚胎数量不同的受体，妊娠率和妊娠到期产羔的受体比率差异不显著(P<0.05)，而移植胚胎最终发育为出生羔羊的比率差异显著(P<0.05)，移植单胚、双胚、三胚和四胚时胚胎成羔率分别为60.2%(171/284)、51.5%(890/1724)、41.33%(31/75)和36.36%(16/44)。各品种受体胚胎移植后妊娠率虽有所不同，移植双胚时胚胎成羔率存在显著差异(P<0.05)，最终使不同品种受体羊之间胚胎移植效率出现差异。奶山羊受体移植双胚时胚胎成羔率最高，与成都麻羊和简阳大耳羊差异显著(P<0.05)，南江黄羊低于奶山羊、高于成都麻羊和简阳大耳羊，而且奶山羊和南江黄羊移植单胚和双胚时胚胎成羔率差别不大，成都麻羊和简阳大耳羊则差异比较大。各品种受体羊卵巢上只有一个黄体与两个黄体时，胚胎移植妊娠率无显著差异，而且都非常接近。黄体大小不同时，受体妊娠率及胚胎成羔率差异不显著，而随着黄体大小变化有逐渐下降。这提示我们，在胚胎移植实际应用中，只要同期发情受体羊正常排卵并发育为黄体，都可以作为可用受体进行胚胎移植，但应慎重选用卵巢上黄体发育太小的受体。

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