发酵豆粕工艺与固体发酵过程监测指标初探

叶赫娜兰.孤城

摘要：按照工业发酵技术的基本观点，离开过程控制，发酵工艺就不可能进行，也就谈不上可重复性和稳定性。成熟的发酵技术特点就是严格的过程控制。而过程控制的实现，需要对过程参数进行选取和有效监测。这些被选定和监测的参数，表现的是微生物群体代谢所体现出的宏观变化。一般性地被称作发酵生理参数，以有别于生化参数等细胞水平和亚细胞水平的代谢指标。
没有参数的发酵过程是不可能实现稳定的。必须克服或部分克服以上困难，提供可靠的生理参数数据，实现发酵豆粕工艺的稳定性。
目前在发酵豆粕一般应用中，文献可以查到的固体发酵工艺，无一具有过程控制，而实现过程控制是真正工业化的前提。要想实现控制，必须进行发酵生理数据的采集与分析。目前参照液体深层发酵工艺所选用的检测方法是有效地。
由于参数选取过程中就考虑到工业应用，这些参数具有快速检测的可能。

关键词：豆粕发酵；检测；监测指标；过程控制

叶赫娜兰.孤城

1.豆粕发酵的意义与效果

豆粕是广泛应用于饲料工业的蛋白源。但是，豆粕本身的某些理化特点，限制了豆粕应用价值的体现。如，抗营养因子的存在，氨基酸的不平衡，结构致密造成的适口性差和消化率偏低等。目前，应用发酵技术处理豆粕，是有效提高豆粕品质的方法之一。

比如，在抗营养因子方面，通过发酵技术，可将目前已知的多种抗营养因子去除。见表1。

项目        优质豆粕        发酵豆粕
胰蛋白酶抑制因子mg/g        10-15        ≤1
植酸mg/g        10.60        --
大豆凝血素mg/g        1.93-7.58        --
不亮寡糖%        5-20        ＜0.9
致甲状腺肿素1/106        165.59        --
大豆球蛋白mg/g        400        ＜0.02
β-大豆伴球蛋白mg/g        155        ＜0.01
脲酶活性        0.4        0.02
脂肪氧化酶相对活性        98        --

表-1    豆粕发酵前后各指标比较

在发酵过程中还可以产生直接被动物吸收的小肽和其他多种生物活性物质，这对动物的生长十分有利。在发酵过程中产生的呈味物质，对于动物，特别是幼龄动物，具有明显的诱食效果。并且，由于部分碳水化合物被降解，豆粕致密的结构变得疏松，适口性显著提高。

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2.发酵豆粕常见菌种与工艺特点

目前，应用于豆粕发酵的菌株很多。在菌株选择方面，只要不产生毒素，并且在食品发酵或兽用微生态制剂中应用的菌株，在豆粕发酵中都可能用到。细菌中，乳酸杆菌和芽孢杆菌得到应用。酵母菌中，酿酒酵母和拟内孢酶得到应用。真菌中，曲霉，根霉，木霉，毛霉都得到应用。虽然目前没有担子菌等大型真菌用于发酵豆粕的报道，但理论上，由于担子菌产生高活性的纤维素酶，相对细菌，担子菌处理豆粕应该具有一定优势。当然，没有放线菌用于发酵豆粕的报道。

虽然豆粕发酵中菌株应用较多，但发酵工艺却具有趋同的倾向。目前常见的工业水平的发酵豆粕，选用工艺一般具有以下几个特点：

1，        应用固体发酵工艺，而不是液体发酵工艺。
2，        开放式接种，优势培养或多菌株培养，而不是纯培养。
3，        豆粕发酵前的预处理阶段一般省略掉消毒过程。

这是由于发酵豆粕大量应用在畜牧行业，所以，低附加值的现实，压缩豆粕发酵工艺成本所致。固体发酵工艺相对液体发酵工艺，虽然因为水活度的问题，有效率偏低的缺点，但却节省了烘干或喷干成本，在动力上比较合算。而固体发酵工艺纯培养的实现，要比液体发酵工艺困难，也就意味着提高成本，因此在豆粕发酵中选用了优势培养或混菌培养。由于已经不是纯培养工艺，这就为省掉消毒过程，进一步降低动力成本提高了条件。因此，在成本的压力下，虽然选用菌株有异，但发酵豆粕工艺具有趋同的特点。

整体看来，发酵豆粕技术（含菌种和工艺），是在食品发酵发展或参考食品发酵而来的。由于时间积累的限制，虽然工艺已经有趋于相同的表现，但整体技术水平还处于比较低的状态。或说，相对于以抗生素为代表的液体深层发酵，尚处于有待发展的初级阶段。

成熟工艺或成熟技术的最明显的特点是工艺的稳定性以及对这种稳定性实现手段的规范性。稳定性的外在表现，是可重复性。除了经济性，可重复性是衡量某工艺工业化价值的唯一指标。应用目前常见的发酵豆粕工艺，批次差异巨大，可重复性低是不争的事实。

叶赫娜兰.孤城

3.限制发酵豆粕工艺成熟的原因是发酵过程控制的缺失
   
按照工业发酵技术的基本观点，离开过程控制，发酵工艺就不可能进行，也就谈不上可重复性和稳定性。成熟的发酵技术特点就是严格的过程控制。而过程控制的实现，需要对过程参数进行选取和有效监测。这些被选定和监测的参数，表现的是微生物群体代谢所体现出的宏观变化。一般性地被称作发酵生理参数，以有别于生化参数等细胞水平和亚细胞水平的代谢指标。

对于生理参数的选取和大量测定，是实现过程控制的前提。一般常见的生理参数为：pH值，生物量（用菌浓，湿菌体含量，干菌体含量，涂布菌落，细胞量，OD值等来表示。），糖含量，氨基氮含量，可溶性磷含量，目标产物含量，溶氧，尾气中氧，二氧化碳含量，发酵过程热量的产生速率（一般通过降温水流量标示），等等。其中，最常用的为pH值，生物量，糖，氮，磷含量和目标产物含量。真正的数据分析，以实现过程控制，就是以来对这几个参数的分析与综合进行的。

但是，虽然各种检测手段，如，HPLC,GC，电泳，分管光度法，甚至酶联免疫吸附法等监测技术频繁应用于豆粕发酵，但豆粕发酵的过程控制还是接近于没有。原因是这一系列的检测方法，只不过是在发酵结束后的成品监测中被应用，以证明发酵的效果和必要性的。而并不方便应用在过程监测中。

发酵豆粕，甚至整个固体发酵工艺，相对于液体深层发酵，在发酵过程控制方面，主要存在以下三个差异：

1，        没有成熟选定的，行业内技术人员统一认可的生理参数，甚至根本没有任何形式的生理参数及检测和监测方法。
2，        因为没有生理参数，也就没有对生理参数曲线分析水平的过程控制，也就不能真正实现工艺过程的可重复性。
3，        行业中缺乏对生理参数分析，以实现工艺过程稳定的习惯和意识。

造成这些差异的原因可以在两个方面进行分析。首先，发酵豆粕工艺基本脱胎自食品发酵的固体发酵工艺，而食品固体发酵技术，过程控制和经典发酵不同，是基于经验而不是基于生理参数的。但食品发酵工艺经历了数百年经验积累，由于成本压力，发酵豆粕技术只继承了食品工艺的大致过程，而没法真正延续食品发酵的控制模式，这就使得豆粕发酵技术具有某种程度的先天不足。其次，固体发酵工艺相对液体发酵工艺，所面对的物料理化性质不同。在液体发酵中，所有生理参数是在水溶液里测定的，但在固体发酵中，所面对的物料是固体的。这就为生理参数的选取和测定方法的建立提供了阻力。另一方面，由于在液体发酵中的剧烈搅拌，已经使得任何一点取样都具有整体意义，而对于固体物料，每一点仅仅代表了当前点的状况。这就使得单点监测值没有代表意义。

没有参数的发酵过程是不可能实现稳定的。必须克服或部分克服以上困难，提供可靠的生理参数数据，实现发酵豆粕工艺的稳定性。

叶赫娜兰.孤城

4.发酵豆粕工艺生理数据检测方法与分析方法的建立

一般发酵工业生理参数的选取和监测方法的建立，遵循以下三个原则：

1，        取样方法简单，易于获取或经过简单处理后，易于获取具有可以代表整体的普遍性意义的样本。
2，        检测方法简单，最起码简单到已经在行业内通用或可以在行业内通用。
这样就为在行业内工程人员的交流提供可能，也为进一步改进检测方法提供可能。
3，        相对于准度，更要求具有低散布性，高精度的检测方法。
在参数选取后，需要真实值以作出最后的结论或帮助作出最后的结论的情况下，准度是一个比较重要的选取检测方法的依据。但在过程控制中，由于看中的是曲线的发展趋势，并且经常要对曲线进行数学运算等处理。如积分，微分等等，以发现参数细微变化对宏观代谢的意义，这就使得精度的意义十分重大。

在固体发酵工艺参数选择，也应该遵循以上三个原则。虽然固体发酵是面对固体物料，但是，由于一切生命代谢都是在水溶液中进行，固体物料实质上是一个气，液，故三相的复杂生物体系。这种体系的成分复杂，待测指标含量随时间差异变化极大，随着发酵批次的变化和同批次发酵时间的变化，适应性差的检测方法，会得出不准确的结果或引起严重的假象。所以我们参照液体深层发酵的检测，尽可能建立稳定性强，抗干扰，适应度广的方法。在这个前提下，提出五个生理参数，对固体发酵进行调控。

1，        失重比
在衡量液体发酵过程中的宏观变化时，生物量的变化是一个重要指标。这是因为发酵液可以看作是“菌悬液”，而视为一种不易沉淀的悬浊液。通过离心，可以把细胞和液体分开，而得到所谓“湿菌浓”或再烘干，得到“干菌浓”。并且由于菌体和溶液的物理性质差异，在全水溶培养基中，可以通过分光光度法测得细胞量的变化。或者，应用发酵液搅拌充分，粘度大，细胞不易沉降的特点来吸取部分发酵液进行平板涂布，通过数菌落的方法算出单位溶液内的活菌数。
但是，固体发酵工艺受本身物料性质和细胞代谢的限制，就不能套用类似的方法来简单的衡量宏观代谢。这是因为固体发酵的含水量极低，大概在50%左右。这种情况下，不仅微生物细胞不能自由移动，就是水溶性营养物质也是相对固定的。由于培养及配方组成中各组分物理性状的差异，特别是透气能力带来的极短位移上代谢强度的急剧变化，即便是单细胞微生物培养工艺，也使得取样粉碎进行平板涂布测量平均单位体积内活细胞量变得不可能。更不用说离心菌浓和分光光度法测得OD值的可能性了。
但是，按照发酵动力学原理，发酵过程的能耗速率，是和活细胞量呈正比关系的，也就是说，可以通过对能耗的描述，来控制宏观代谢的强度。而能耗可以看做主要是以二氧化碳和氨气损耗掉的重量。
在固体发酵中，如果把所有单个活细胞的能耗速度看做相同，则对干重的损失量的微分，是和生物量成正比的。在习惯了这种描述后，即便不做微分，也可以通过对干物质重量损耗的描述，实现对细胞宏观代谢的把握。
这就可以提出“失重比”的概念，即，经过若干小时发酵后，干物质相对起始时间的损耗率。

2，        pH值
仅仅一个参数是不能描述生理代谢的，在引入新的参数时，首先注意到最方便测得的参数之一是pH值。
同样由于含水量的问题，使得常规的工业用pH测定仪不能直接用在固体发酵工艺中，而用微观pH仪实现工业测定又不现实，这就只能使用一种约定的方法，测定相对的pH变化。
暂时规定，每20克烘干固体发酵物料混合于200毫升中性水的过滤液的pH为指定pH值，进行个发酵批次间或同批次不同样本间比较。
3，        还原糖或总糖
依据固体发酵工艺和培养基配方的不同，可以进行还原糖或总糖的检测。样本处理方法参考pH值的检测，应用液体深层发酵还原糖，总糖检测方法，得出单位干重所含还原糖或总糖含量。单位为质量百分比。

4，        氨基氮
同样依据固体发酵工艺和培养基配方的不同，参考液体深层发酵氨基氮检测方法，进行氨基氮含量的检测。单位为毫克/千克。

5，        溶磷
同样依据固体发酵工艺和培养基配方的不同，参考液体深层发酵溶磷检测方法，进行固体发酵可溶性磷含量的检测。单位为毫克/千克。

对于取样方式，同样由于物料的含水量过低，而带来的单一样本不能代表全部物料的性质，而对取样方式提出了不同于一般液体发酵工艺监测取样的要求。

首先，由于物料不能流动，则取样必须多取。其次，取样不能参照原料监测和成品检测的方法选点，即不能分散选点和随机选点，而应该在最具有代表性或最正常的部位选点。

目前的方法是，在最具有代表性的区域，随机选取五个点，进行取样，检测后，把最接近的三个值求算术平均，而把其余两个值舍掉。

叶赫娜兰.孤城

5.固体发酵过程监测实例与应用效果

对生理数据的分析作用发挥最大的地方是发酵过程工程，也就是工艺路线的选择和工艺参数的制定及其实现，其次是在成熟工艺的日常发酵过程中。下面的例子，通过对发酵过程中生理参数的测定和分析制定了工艺，可以看做是过程检测的初步实际应用。

实验地点：山东大学生命科学学院，微生物技术国家重点实验室，国家糖工程技术研究中心，资源糖室。
所用设备：摇床，50升自控发酵罐，固体发酵床，烘干箱，定量取样器（自制），常规检测设备。
所选菌株：米曲霉AS3951，为资源糖室保藏。
工艺条件：固体发酵，物料浸泡但不消毒。控制温度为发酵室空气温度30℃，料温35℃。起始pH6.5。控制湿度接近饱和。
工艺配方：干物料85%豆粕，其余略，含水量略。
取样周期：每三小时一次。
发酵数据：见表2。

周期        0        3        6        9        12        15        18        21        24
失重比        0%        0.5%        3.0%        7.0%        8.0%        14.0%        16.0%        17.0%        17.0%
pH        6.55        6.48        6.45        6.41        6.54        6.87        6.90        6.95        6.85
还原糖        3.2        3.4        3.8        3.0        1.8        1.4        1.4        1.4        1.4
氨基氮        320        320        320        280        400        480        520        360        360
   
表 2   豆粕发酵过程参数

如表2所示，在15小时后，物料的pH已经下降到最低点，并且反弹。而氨基氮则在15小时后达到最高，以后逐渐下降。同时，在15小时达到能耗速率最高，表现为相对失重比（失重比的斜率）最高。也就是具有较高代谢活性的生物量达到最高。以后，相对失重比降低并趋于平缓，说明进入稳定期和衰退期。

以上情况可以这样理解，在六小时之前的能量损耗，可以理解为延迟期后期和对数期前期在细胞指数生长之前的积累。而后进入对数生长期中期。在这个阶段，如同液体发酵一样，主要是一个利用碳链而不是氮源的过程。并且由于还原糖的利用产生有机酸，似的pH下降。在15小时左右，达到生物量高峰，由于胞外酶的作用，而使得氨基氮达到最高。后来，由于在所谓稳定期实际上细胞活性的降低，而氨基氮，相对失重比都下降了。

对于还原糖的测定，也印证了以上数据。至于后期还原糖检测值趋于稳定，原因也和液体发酵一样，在一定浓度一下的还原糖不再为细胞所识别，而达到最低值。在这以后，除了能够进一步利用胞外酶降解蛋白外，考虑到氨基氮以氨气的形式挥发掉，继续发酵就是对物料的单方面无意义的消耗了。

在以上实验中，由于配方中较多的应用磷酸盐为缓冲剂，所以磷的基础较高，溶磷损耗在生物转化中不具备可观性，故省略监测。

考虑到应用的是固体不消毒发酵工艺，目标为尽可能多的菌体量和合理处理豆粕但不造成浪费，并且尽可能短的发酵周期以尽可能减少杂菌污染的机会，提高工艺稳定性，故，最后确定，当应用严格的工艺，使用米曲霉AS3951进行单菌株固体发酵豆粕时，发酵时间为15-20小时。其他参数如pH值，温度，含水量等暂依文献或以往经验，不作调整。

叶赫娜兰.孤城

6.结论
   
目前在发酵豆粕一般应用中，文献可以查到的固体发酵工艺，无一具有过程控制，而实现过程控制是真正工业化的前提。要想实现控制，必须进行发酵生理数据的采集与分析。目前参照液体深层发酵工艺所选用的检测方法是有效地。

由于参数选取过程中就考虑到工业应用，这些参数具有快速检测的可能。

不仅仅是霉菌，在任何有可能进行工业化发酵的场合，如其他真菌（如担子菌），酵母菌，细菌，甚至放线菌，或者，不仅仅是发酵豆粕，包括其他方面，这些参数和对过程的控制方式，都是可取的，值得继续发展的。

参考文献：

《微生物技术开发原理》，曲音波，化学工业出版社
《生物体系中的化学测量》，上官棣华，赵睿等译，化学工业出版社
《微生物学》，郭秀君，山东大学出版社
《发酵豆粕研究进展》，李建，《粮食于饲料工业》，2009，NO.6

穆然

呵呵呵呵.....孤城的专业,很不错的资料

牧场侠客

再多发点

叶赫娜兰.孤城

好帖子总是要沉的。