感染球虫的肉鸡日粮中添加甜菜碱能够增加十二指肠上皮淋巴细胞数量并增强吞噬细胞功能

wlei908

感染球虫的肉鸡日粮中添加甜菜碱能够增加十二指肠上皮淋巴细胞数量并增强吞噬细胞功能

K.C.Klasing,K.L.Adler,J.C.Remus and C.C.Calvert

译者：王磊（ 潍坊祥维斯化学品有限公司，潍坊高新区东方路鲁伟商务港403室，手机18653607281 邮编：261061）

摘要：甜菜碱通常用于细胞渗透压的调节，本试验的目的在于探索甜菜碱、渗透压、球虫病

之间的联系。试验一，肉鸡饲喂玉米-大豆型日粮，分为3个处理日粮中分别添加甜菜碱0、0.5、1.0g/kg，其中一半肉鸡感染堆型艾美尔球虫。球虫感染降低了肉鸡增重和饲料效率，并且增加了十二指肠、空场粘膜的渗透压（P<0.01）。甜菜碱降低了十二指肠渗透压（P<0.01），特别是有球虫感染的时候。球虫感染增加了十二指肠固有层厚度（P=0.04）和白细胞的数目（P<0.01），特别是在高甜菜碱水平时（互作p=0.05）。球虫可以使绒毛高度降低（p=0.05），但当添加1.0g/kg甜菜碱时情况得以改善（互作p=0.04）。试验二，将腹膜巨噬细胞和外周血异嗜细胞在渗透压分别为200, 310, 600 或 900 mOsmol ，甜菜碱含量分别为 0.0, 0.1, 0.5 或 1.5 mmol/L 的（4×4因子）介质中培养6 h，然后加入堆型艾美尔球虫。总的来看，高渗透压介质与等渗透压介质比较，吞噬作用与NO的释放受到了抑制，而IL-1、IL-6的含量升高。0.1mmol/L甜菜碱组显著（p=0.04）增加异嗜细胞NO的产生，并具有增加巨噬细胞NO产生的趋势（p<0.1）。甜菜碱可以促进异嗜细胞分泌趋化因子增强单核白细胞趋化性。除了增加白细胞的数目外，巨噬细胞增强单核白细胞趋化性和NO的释放或许可以解释感染球虫时添加甜菜碱能够降低肠道损伤的现象。

关键词： 肉鸡；甜菜碱；免疫力；球虫病；渗透压

甜菜碱（三甲基甘氨酸）是一种氨基酸的衍生物，广泛存在于动植物的体内。甜菜碱具有2个主要的代谢功能：一是作为甲基供体，二是作为渗透压调节剂维持细胞内外水平衡【1，2】。机体组织如肠道、肾、肝、脑、白细胞都需要具有两性离子特征的甜菜碱来调节渗透压。渗透压调节剂具有十分重要的意义，特别是在细胞存在脱水的情况下。渗透压调节剂可以在细胞内外存在渗透压梯度时，减少细胞水分的损失。细胞含水量的变化能够影响细胞的代谢状况。细胞体积的轻微增大，加强细胞的合成代谢，相反细胞脱水体积减小时则会抑制代谢活动【3】。因此，细胞面临各种渗透压激变时，维持体内水平衡具有重要意义。哺乳动物的单核白细胞和巨噬细胞摄取或释放甜菜碱以应对高渗造成的细胞体积缩小或低渗造成的细胞体积膨胀，维持细胞体积稳定。所以甜菜碱可以调节细胞的功能包括吞噬作用、NO以及炎症细胞因子的释放【4-7】。对于犬科动物肾脏细胞，1mmol/L甜菜碱可以防止高渗透压引起的细胞凋亡【8】。

    肠道寄生虫通常感染脊椎动物，球虫是肉鸡广泛存在的病原菌。堆型艾美尔球虫感染十二指肠宏观和微观上都可见到明显的病理学损伤。球虫病的典型症状是吸收障碍和腹泻。堆型艾美尔球虫感染引起的病症和肠道损伤常常可以因为添加甜菜碱而减弱【9-12】，特别是在日粮中添加抗球虫药时，但并不总是如此【13-15】。甜菜碱的作用机制现在还没有搞清楚，但看起来并不是甜菜碱直接作用于寄生虫的结果，很可能是甜菜碱通过影响巨噬细胞的功能来起作用的，因为巨噬细胞在抵抗球虫方面具有重要作用【16】。或者是甜菜碱通过影响肠道上皮或结缔组织细胞的水平衡，从而增强对球虫入侵或增殖的抵抗作用。

本次研究的目的，一是确定甜菜碱对肠道上皮细胞形态学的影响以及感染球虫时吸引到上皮组织的白细胞数。二是研究甜菜碱与渗透压对肉鸡巨噬细胞和异嗜细胞功能影响的互作关系。通过测定吞噬作用、细胞因子和NO的释放，确定他们对堆型艾美尔球虫的反应。另外，检测血液单核白细胞对异嗜细胞释放的趋化因子的趋向性。

材料和方法：

动物试验：用肉鸡进行球虫感染和日粮中添加甜菜碱对肠道形态学影响的试验。本试验为3×2因子试验，甜菜碱的水平为0、0.5、1.0g/kg，肉鸡分为球虫感染和未感染。甜菜碱（纯甜菜碱含量97%）添加到基础日粮（表1），等量替代纤维素，获得期望的甜菜碱水平。经检测基础日粮（不加甜菜碱）含有0.18g/kg甜菜碱、7.3g/kg蛋氨酸和4.4g/kg半胱氨酸。日粮营养水平高于肉鸡的营养需要【17】，蛋氨酸＋半胱氨酸的水平超过营养需要量的30％，这样就消除了甜菜碱节约蛋氨酸效应的影响。

表1 基础日粮的组成

原料	组成（g/kg）
玉米 豆粕(cp48.5%) 大豆分离蛋白 玉米油 磷酸氢钙 石粉 多维2 多矿3 食盐 DL-MET Lys.HCL 氯化胆碱 纤维素	493.7 336.2 40 39.2 15 6 1 1 3.13 2.7 1 0.75 10.3

注：日粮实测值：甜菜碱0.18g/kg、蛋氨酸7.3g/kg、半胱氨酸4.4g/kg、赖氨酸16.1g/kg。

选择1日龄的肉鸡（Cobb×Cobb）公母混养，自由采食和饮水，饲喂于育雏器中。每个处理8个栏，每栏7只鸡，恒温加热器设置为35℃。14日龄时每个处理选择4栏，每只鸡口服接种堆型艾美尔球虫AC50的孢子卵囊4.6×104个。测定14到21天（也就是从感染球虫开始至感染一周）的增重、采食量和饲料效率。实验及操作规程经加利福尼亚大学动物福利委员会批准。在实施口服球虫孢子卵囊后的第2、4、7天，每栏选取一只鸡腔静脉放血并扭断颈部致死。从十二指肠弯部（胰腺顶端）取样，并剪切成长度约1.5cm左右的肠段，用盐水冲洗，在100g/L的福尔马林（pH7.0）中固定。将固定好的肠道样品制作切片，用苏木精-伊红染色,测定如下指标：固有层厚度、绒毛高度（固有层基部到绒毛顶端）、绒毛中间处宽度、相邻绒毛间隐窝深度。每只鸡测定两张切片上的各10根绒毛。应用计算机辅助的光源显微镜在10-100倍下，借助Image-Pro-Plus 图像分析软件进行分析测定。只使用整洁的切片，测定直立的绒毛，正如以前所采用的方式【18】。

为了对上皮内的淋巴球和固有膜上的白细胞进行组织免疫学分析，将组织样品放入零下80度的冷冻保存。分析时将组织块分割成6&micro;m厚度并在载玻片上风干，组织块在丙酮中固定然后再次风干，然后将组织块在鼠抗鸡CD45单克隆抗体中培育一个小时然后用磷酸盐缓冲液（pbs）冲洗。再将组织块在兔抗鼠免疫球蛋白、过氧化物酶和5ml/L牛血清白蛋白的培养液中孵化一个小时后再冲洗。过氧化物酶的活性在添加了0.1ml/L双氧水和3.3’-二氨基联苯胺四盐酸盐的溶液中发育。载玻片用苏木精-伊红染色，每个载玻片选择十根绒毛测定白细胞的数目，固有层内十根绒毛的白细胞数量也要计算在内。

接种球虫两天后，每栏中选取一只鸡采集肠组织样品用于检测渗透压和甜菜碱含量。从十二指肠、胆管与回肠憩室中间的空肠、回肠憩室与回盲结合部中间的回肠，以及盲肠的中间部位截取5cm长的肠段。用盐水冲洗掉肠腔内容物，沿纵轴剖开肠管并用载玻片将粘膜刮下。在刮下的粘膜中加入1-2ml水并混合均匀，采用冰点渗透压计测定渗透压，并根据加水后的稀释系数折算出粘膜的渗透压值。稀释样品中甜菜碱含量采用高效液相色谱法测定，使用Ca2+交换柱以及折光率检测[19]。

细胞培养实验：巨噬细胞用注射器从腹腔抽出【20】，单核白细胞、异嗜细胞从血液中获得，并应用Histopaque 1083溶液进行分离提纯。单核白细胞、巨噬细胞在塑料培养皿上进一步纯化。将上述细胞冲洗后，放入含有100ml/L鸡血清的RPMI1640培养基中（血清采自球虫攻毒7天的鸡），于41℃，50ml/L CO2条件下培养。

根据饲喂添加0或1g/kg甜菜碱日粮时鸡血浆和肠道上皮细胞中甜菜碱的含量来确定细胞培养实验中甜菜碱的添加量。测得血浆中甜菜碱的含量分别为0.12、0.51mmol/L，肠道上皮细胞中甜菜碱的含量分别为检测不到和1.09mmol/kg，以肠道上皮含有800ml/kg水来算，相当于含甜菜碱1.35mmol/L，因此细胞培养实验中确定了甜菜碱的添加量为0、0.10、0.50、1.5mmol/L。球虫感染试验的结果显示血浆的平均渗透压为308mOsmol。肠道上皮细胞的最低和最高渗透压分别为684 mOsmol和1004 mOsmol。用单核白细胞进行的预备实验显示在渗透压高于1200 mOsmol时，所有细胞在1h内死亡，所以本试验所用的培养基渗透压设定为小于等于900 mOsmol，培养基的渗透压通过添加NaCL来调节。

艾美尔球虫吞噬实验：本实验设计为4×4因子实验，分别为4个水平的甜菜碱和4个梯度的渗透压，每个处理10个重复。巨噬细胞和异嗜细胞来源于5只鸡，这些吞噬细胞培养于玻璃皿中，培养6h后加入堆型艾美尔球虫，每个吞噬细胞对应10个球虫。再额外培养2h，经固定，苏木精-伊红染色，通过对每一重复计数来评估吞噬作用。巨噬细胞内化吸收2个或更多堆型艾美尔球虫定为有效。

吞噬细胞NO和细胞因子的释放：本实验设计为4×4因子实验，分别为4个水平的甜菜碱和4个梯度的渗透压。每个处理10个重复，所用的吞噬细胞来自于2只鸡。巨噬细胞和异嗜细胞在六孔塑料培养皿中培养15分钟，然后加入堆型艾美尔球虫，每个吞噬细胞对应10个球虫。4h后应用仪器（# G4410;Sigma Chemical）测定亚硝酸盐含量，并以此作为反映NO释放的指标。通过酶联免疫吸附法（ELISA）测定释放出的IL-6的数量，释放的IL-1的数量通过生物学测定方法进行测定【20】。

吞噬细胞的趋化性：本实验设计为3×3因子实验，分别为3个水平的甜菜碱和3个梯度的渗透压。单核白细胞分离自5周龄雄鸡的静脉血，将其分别培养在含0、0.1、10.0mmol/L甜菜碱的基质中,然后将1ml单核白细胞（1.33×106个）置于12mm的transwell膜室内，膜上的孔径为3&micro;m。对照组基质中含有适当的甜菜碱，渗透压为310mOsmol。每个处理含有10个transwell膜室，将它们置于含有适当甜菜碱和渗透压（200、300、400 mOsmol）并添加50ml/L趋化物的培养盘中。趋化物来自于培养了4h的异嗜细胞培养基（每个异嗜细胞对应5个堆型艾美尔球虫）。因此本试验检验了在不同渗透压的情况下单核白细胞应对球虫时的趋化性。41℃条件下培养45min，移除transwell膜室，用瑞特氏法染色，制作标本。穿过transwell膜的单核白细胞的数目采用枚举计算的方式在400倍镜下选取4个视野进行统计。

统计分析：数据进行方差分析，并用JMP软件(SAS,Cary,NC)分析互作效应。P值<0.05认为差异显著，P值介于0.05-0.10认为具有趋势，P值>0.1认为不存在差异性。个体或群体平均数的差异用预先正交对比法检测。

试验结果：

14日龄感染球虫的肉鸡在随后的几周与对照组比较增重率较低（p=0.02）,并且有减少采食量(p=0.06)和饲料利用效率（p=0.08）的倾向，具体数据见表2。

表2
日粮中添加甜菜碱对感染堆型艾美尔球虫肉鸡的增重、采食量和饲料效率的影响

日龄	堆型艾美尔球虫	增重（g/只·d）	采食量（g/只·d）	饲料效率
0-14 14-21 0-21	- - + - +	21.4±0.17 49.1±0.19 44.5±0.31 33.1±0.23 31.3±0.30	27.4±0.24 66.2±0.41 64.0±0.29 40.5±0.14 39.7±0.21	0.79±0.004 0.73±0.003 0.70±0.007 0.77±0.005 0.75±0.005
		ANOVA p值
艾美尔球虫，d 艾美尔球虫，d	14-21 0-21	0.02 0.04	0.06 0.08	0.08 0.09

注：1.甜菜碱的效果、甜菜碱与球虫之间的互作效应没有达到显著水平；整合所有添加甜菜碱组的数据，数据采用平均数±标准差的形式表示，0-14日龄n=24,14-21日龄n=12。

2.肉鸡在14日龄时口服4.6×104个堆型艾美尔球虫的孢子卵囊。

在肉鸡日粮中分别添加0.5和1.0g/kg甜菜碱时，十二指肠上皮细胞甜菜碱含量分别为7.2和10.9mmol/L。饲喂1.0g/kg甜菜碱时，空肠上皮细胞甜菜碱含量为3.0mmol/L，在饲喂其它日粮时肉鸡空肠和回肠上皮细胞甜菜碱含量低于可检测值（1.0mmol/L）。血浆甜菜碱含量随着日粮中甜菜碱水平的增加而升高（p<0.01），见图1。球虫感染可以显著的降低血浆甜菜碱含量（p≤0.01）。日粮甜菜碱水平与球虫感染之间存在着互作（p=0.04）,饲喂0、1.0g/kg甜菜碱时，球虫引起肉鸡血浆甜菜碱含量降低，而饲喂0.5g/kg甜菜碱时则不会出现这种情况。

图1 肉鸡饲喂含甜菜碱分别为0、0.5、1.0g/kg的日粮在感染

或未感染球虫时血浆中甜菜碱的含量

注：添加“﹡”表示感染球虫组血浆甜菜碱含量与对照组差异显著，p<0.01。

球虫感染显著增加了十二指肠、空肠上皮细胞的渗透压（p<0.01）,见表3。日粮添加0.5g/kg甜菜碱与不添加甜菜碱组相比显著降低了十二指肠上皮细胞渗透压。甜菜碱引起的渗透压下降在有球虫感染时更加显著（甜菜碱与球虫感染的互作p=0.07）。正如所预期的堆型艾美尔球虫影响了十二指肠的组织学特征(表4、表5)。感染球虫2天后固有层和上皮内白细胞的数目增加明显，并随着感染时间的持续白细胞数目继续增加。感染球虫4天，固有层厚度增加，绒毛高度降低，这种情况持续到染病后第7天。感染球虫7天时，甜菜碱与球虫对绒毛高度的影响存在互作效应（p=0.04），肉鸡不饲喂甜菜碱时球虫使得绒毛高度降低，肉鸡饲喂1.0g/kg甜菜碱时球虫对绒毛高度的影响极小。在对固有层(p=0.04,第7d)和上皮内（p=0.04,第4d；p=0.05,第7d）白细胞数目的影响上，日粮甜菜碱和球虫之间也存在着互作效应。总的来说，这种互作效应表明球虫引起的白细胞数目增加在日粮中添加1.0g/kg甜菜碱时要高于不添加甜菜碱时。

表3 日粮中添加不同水平甜菜碱和感染堆型艾美尔球虫对肉鸡血浆和肠道上皮渗透压的影响1,2

部位	艾美尔球虫	甜菜碱添加量（g/kg）			Mean±SEM
		0	0.5	1.0
血浆 十二指肠3 空肠4 回肠 盲肠	- + Mean±SEM - + Mean±SEM - + Mean±SEM - + Mean±SEM - + Mean±SEM	311 303 307±9 915 1004 959b±14 844 909 877±16 707 684 695±15 689 692 691±19	mOsmol 308 307 307±5 897 978 913a±14 851 883 867±15 730 710 720±21 731 645 688±19	308 311 310±7 911 957 934ab±18 814 896 855±11 693 703 698±19 670 706 688±12	309±6 307±9 908±17x 979±14y 836±12x 896±15y 710±19 699±16 696±21 681±20

1.同一行数据肩标不同小写字母a,b表示差异显著p<0.05,同一列相同组织内数据肩标不同小写字母x,y表示差异显著p<0.05。

2．肉鸡于1日龄开始饲喂含不同水平甜菜碱的日粮，于14日龄口服球虫卵，于21日粮采集血液、肠道组织样本。

3.球虫感染主效应p=0.01,甜菜碱主效应p<0.01,甜菜碱与球虫感染的互作效应p=0.07。

4.球虫感染主效应p<0.01,甜菜碱主效应p=0.09。

巨噬细胞和异嗜细胞对堆型艾美尔球虫的吞噬作用在等渗环境条件下（310mOsmol）最大，在900mOsmol渗透压条件下吞噬作用急剧减弱（p<0.01）。低渗透压环境不影响吞噬作用，具体数据见表6。巨噬细胞的吞噬作用在0.1mmol/L甜菜碱的介质中比在不添加甜菜碱的介质中要明显强的多（p=0.05）。渗透压对NO释放的影响与对吞噬作用的影响相似（表7）。培养在0.1mmol/L甜菜碱基质中的异嗜细胞与培养在无甜菜碱基质中的相比释放更多的NO（p=0.04），巨噬细胞也表现出相似的差异（p=0.07）。巨噬细胞应对球虫时在600 mOsmol渗透压下比在等渗条件下释放更多的IL-1和IL-6（表8）。甜菜碱不影响巨噬细胞释放细胞因子。

单核白细胞穿过膜移向异嗜细胞应对球虫时释放的趋化因子，单核白细胞的趋化率在高渗透压时比在等渗时高很多（图2）。培养基中甜菜碱含量显著影响趋化性（p<0.01），10mmol/L甜菜碱时趋化率最高。甜菜碱与渗透压之间存在着显著的互作效应（p<0.01）,含有10mmol/L甜菜碱时，低渗和等渗介质中的趋化性显著高于高渗环境。

图2 不同渗透压条件下单核白细胞移向异嗜细胞应对球虫时产生的趋化信号的数量

     

注：外周血单核白细胞首先在含有不同浓度的甜菜碱基质中培养3h，然后检测迁移进入含有趋化因子且渗透压不同的培养基中的单核白细胞的数目。同一渗透压梯度内图标不同小写字母表示差异显著（p<0.05）。

讨论：

甜菜碱含量与渗透压：日粮中甜菜碱含量增加相应的增加了肠道上皮细胞和血液中甜菜碱的含量。当饲喂的日粮中含有1g/kg甜菜碱时十二指肠上皮细胞甜菜碱的含量为10mmol/L,为空肠甜菜碱含量的3倍多。不管日粮中添加多少甜菜碱，回肠和盲肠的甜菜碱含量都很低，也许是因为绝大部分甜菜碱在十二指肠和空肠已经被吸收了，能进入回肠和盲肠的甜菜碱很少的原因。甜菜碱在体内由Na+依赖的氨基酸转运系统A和Na+、CL-依赖的甜菜碱-γ氨基丁酸（GABA）转运体进行运输的【21，22】。氨基酸转运系统A广泛存在于各种组织中，如骨骼肌、肾脏和肠道【22-24】，甜菜碱-γ氨基丁酸（GABA）转运体存在于大脑、肾脏、肝脏、心脏、骨骼肌、胎盘、脾脏、肺脏、单核白细胞和巨噬细胞【25-27】，但还没有证明存在于肠道中。Kettunen等【28】指出肉仔鸡的十二指肠和空肠上存有Na+依赖的甜菜碱主动转运系统。他们还发现日粮中添加甜菜碱可以增加十二指肠上Na+依赖的甜菜碱转运体的数量，并增加十二指肠甜菜碱的摄取总量。十二指肠粘膜的渗透压最高，它利用甜菜碱来缓解肠道渗透压的激变【28】，甜菜碱含量高或许是因为上皮细胞的蓄积作用，而不只是转运系统的运输作用。

球虫使得饲喂不添加甜菜碱和添加1.0g/kg甜菜碱日粮肉鸡的血浆甜菜碱含量降低，而很难解释的是添加0.5g/kg甜菜碱时却没有出现相似的情况。血浆甜菜碱含量降低或许是因为肠道上皮细胞吸收了更多的甜菜碱来抵抗球虫病造成的肠道渗透压的升高或者是更多的甜菜碱被用于提供甲基。球虫感染削弱了氨基酸的转运【29】，氨基酸的转运蛋白用于运输更多甜菜碱进入了上皮细胞内，从而造成血浆甜菜碱水平下降。但是甜菜碱提高了某些养分的消化吸收率，如蛋氨酸【10】、类胡萝卜素、赖氨酸、脂肪等【13】，本研究发现甜菜碱增加了绒毛的高度，或许养分利用率的提高就是因为增加了养分吸收面积的缘故。球虫病造成肠道上皮渗透压升高，导致上皮细胞内吸收大量甜菜碱用以维持细胞的体积，从而使得血液中的甜菜碱含量降低。还有一个可能的原因是球虫病增加了机体的甲基需要量，有报道指出感染球虫的肉鸡肝脏中S-腺苷蛋氨酸的浓度增加【9】， S-腺苷蛋氨酸提供甲基后转化为高半胱氨酸，然后高半胱氨酸在酶的作用下由甜菜碱提供甲基，又转变为蛋氨酸。血液中甜菜碱含量减少或许正是肝脏甲基化反应加强的表现。

本试验测定的是刮下的肠道粘膜的渗透压，因此测定值代表了绒毛细胞内的溶质水平、细胞间液、皱褶内的液体以及清洗时未除去的物质。十二指肠的渗透压值为940mOsmol与血浆的渗透压309mOsmol相比是高渗透压。自由采食的肉鸡肠道充满食糜，上皮细胞吸收了大量养分从而造成渗透压很高。本试验测定的上皮细胞渗透压值与Mongin[30]报道的肠腔内容物的渗透压值相似。本试验发现堆型艾美尔球虫感染增加了十二指肠和空肠上皮渗透压，据我们所知，以前未见球虫引起上皮渗透压升高的报道。

肠道形态学：本试验给予肉鸡堆型艾美尔球虫的数目较少，所以造成的损伤是轻微的，日粮中添加甜菜碱后对肠道的调节维护效果可以观察的到。在本试验中堆型艾美尔球虫可明显导致肉鸡发病，生长率降低，但是没有出现死亡和十二指肠出血的症状，说明球虫感染比较柔和【31】。肉鸡接种球虫卵囊2d后，白细胞浸润增加说明十二指肠正经受着球虫的感染，接种4d后肉鸡十二指肠绒毛高度降低，而固有膜厚度增加，这些是典型的球虫感染的症状【32】。

在日粮中添加1.0g/kg甜菜碱与不添加甜菜碱相比，由堆型艾美尔球虫引起的十二指肠绒毛高度的降低要轻微一些。并且添加1.0g/kg甜菜碱改善了巨型艾美尔球虫引起的肉鸡空肠隐窝深度/绒毛高度比率不良的状况。Augustine等【11】发现甜菜碱可以减轻堆型艾美尔球虫和柔嫩艾美尔球虫感染所造成的肠道损伤。感染6h后存在于肠道上皮的孢子体数目减少，说明甜菜碱还可以减弱堆型艾美尔球虫和柔嫩艾美尔球虫的侵袭力【11】。在体外试验中甜菜碱没有对堆型艾美尔球虫的有性生殖表现出抑制作用，甜菜碱可能不是通过减弱病原菌的毒力来发挥防护效应的【10，11】。我们发现感染堆型艾美尔球虫时饲喂甜菜碱的肉鸡与那些不饲喂甜菜碱的相比，肠上皮和固有膜上的白细胞更多，可以更有效的清除孢子体，这正好解释了肠道上皮孢子体数目减少【11】的现象。应对堆型艾美尔球虫时肠道组织白细胞数目增加，可以推断甜菜碱或者增强趋化性信号使大量白细胞集中于绒毛，或者直接加强了白细胞对趋化信号的响应能力。

吞噬功能：吞噬细胞首先引起局部的炎性反应，这在早期抵御球虫感染很重要，我们检测了甜菜碱对巨噬细胞和异嗜细胞所引起的这种炎性反应的影响。动物饮水时肠道上皮细胞内为高渗透压环境，动物采食后进行养分消化吸收时肠道上皮细胞内为低渗透压环境。因此我们在较宽的渗透压范围内检测吞噬细胞功能，结果显示甜菜碱不影响IL-1、IL-6的释放，但是能加强巨噬细胞和异嗜细胞释放NO,并且增强吞噬细胞对堆型艾美尔球虫的吞噬作用。吞噬作用和NO的释放是防御寄生虫包括球虫入侵的重要方面【34】。

外周血液中的单核白细胞在10mmol/L甜菜碱环境下与在0.0mmol/L甜菜碱环境下相比具有更强的趋化性，特别是在等渗透压或低渗透压的介质中时（图2）。感染时单核白细胞离开血液向着趋化因子迁移，成长为巨噬细胞。有趣的是单核白细胞在高渗透压（400mOsmol）介质中比在等渗透压介质中的趋化率要大的多。在高渗透压介质中没有观测到甜菜碱对单核白细胞趋化率有增强的效果，可能是因为单核白细胞在高渗透压环境中的趋化率本来就已经很高的缘故，再增加甜菜碱也不会有额外的作用。

这些研究证明，日粮中添加甜菜碱对堆型艾美尔球虫的发病具有调控作用。甜菜碱能够改善球虫感染时肠绒毛的结构，增加肠上皮和固有膜白细胞的数目。甜菜碱具有防护功能至少部分原因是促进了巨噬细胞和异嗜细胞释放NO，并增强了单核白细胞的趋化性。

表4 饲喂不同水平甜菜碱与球虫感染对肉鸡十二指肠形态学的影响

感染天数

是否感染

固有膜

绒毛高度

绒毛宽度

隐窝深度

甜菜碱添加量（g/kg）

Mean±SEM

甜菜碱添加量（g/kg）

Mean±SEM

甜菜碱添加量（g/kg）

Mean±SEM

甜菜碱添加量（g/kg）

Mean±SEM

0

0.5

1.0

0

0.5

1.0

0

0.5

1.0

0

0.5

1.0

2 4 7

- + Mean±SEM - + Mean±SEM - + Mean±SEM

111 110 110±5 124 148 136±5 127 151 139±3

105 112 108±5 119 144 131±3 120 159 140±4

101 112 106±8 131 142 137±4 131 166 148±8

108±5 112±7 125±5 x 147±4 y 126±6 x 159±6 y

783 766 775±9 831 792 812±10 868 807 a 837±10

749 753 751±12 834 788 811±10 892 819 ab 821±8

792 766 779±8 873 802 838±9 853 844 b 849±9

774±9 762±11 846±10 794±10 871±9 x 823±9 y

243 255 249±8 261 288 275±12 283 299 291±11

219 267 243±11 251 278 265±15 276 292 284±16

257 263 260±10 239 265 252±15 301 301 301±16

240±8 262±11 250±16 277±11 287±9 297±18

157 148 153±13 168 165 167±11 170 159 165±9

153 132 143±13 172 155 164±10 170 166 168±15

160 155 158±11 161 178 170±8 179 160 170±13

157±12 145±13 167±9 166±11 173±8 162±16

因子

ANOVA p值

感染天数

感染天数

感染天数

感染天数

2

4

7

2

4

7

2

4

7

2

4

7

甜菜碱 艾美尔球虫 互作效应

NS NS NS

NS 0.04 NS

NS 0.02 NS

NS NS NS

NS 0.07 NS

NS 0.05 0.04

NS NS NS

NS NS NS

NS NS NS

NS NS NS

NS NS NS

NS NS NS

注：同一行内含有小写字母a,b表示差异显著p<0.05,同一列内含有小写字母x,y表示差异显著p<0.05,p>0.1时认为差异不显著用NS标示。

感染天数	艾美尔球虫	每根绒毛上的白细胞数				固有层内的白细胞数
		甜菜碱添加量（g/kg）			Mean±SEM	甜菜碱添加量（g/kg）			Mean±SEM
		0	0.5	1.0		0	0.5	1.0
2 4 7	- + Mean±SEM - + Mean±SEM - + Mean±SEM	8.2 14.5 11.4±3 7.3 19.0 13.2±3 10.4 24.0 a 17.2±1	7.5 17.2 12.4±2 7.0 22.6 14.8±2 10.6 29.0 ab 19.8±1	7.1 19.8 13.5±2 8.1 21.5 14.8±4 9.8 32.0 b 20.9±3	7.6±1 x 17.2±3 y 7.5±2 x 21.0±4 y 10.3±1 x 28.3±2 y	39.6 53.5 46.6±3 35.1 66.7 a 50.9±3 41.6 77.7 ab 59.7±7	42.0 60.8 51.4±6 33.5 79.8 b 56.7±3 44.2 73.3 a 58.8±3	38.2 62.8 50.5±3 37.4 84.7 b 61.1±3 39.0 81.3 b 60.2±5	39.9±3 x 59.0±5 y 35.3±2 x 77.1±4 y 41.6±5 x 77.4±6 y
因子		ANOVA p值
		感染天数				感染天数
		2	4	7		2	4	7
甜菜碱 艾美尔球虫 互作效应		NS <0.01 0.07	NS <0.01 NS	NS <0.01 0.04		NS <0.03 NS	NS <0.01 0.05	NS <0.01 0.04

表5 日粮中添加不同水平甜菜碱与球虫感染对肉鸡十二指肠白细胞浸润的影响

注：同一行内含有小写字母a,b表示差异显著p<0.05,同一列内含有小写字母x,y表示差异显著p<0.05,p>0.1时认为差异不显著用NS标示；固有层内白细胞数是指10根绒毛埋于固有层内部分的白细胞总数。

表6 在含有不同渗透压和甜菜碱的培养基上培养的吞噬细胞对堆型艾美尔球虫的吞噬作用

甜菜碱（mmol/L）	巨噬细胞的吞噬作用(%)					异嗜细胞的吞噬作用(%)
	培养基渗透压（mOsmol）				Mean±SEM	培养基渗透压（mOsmol）				Mean±SEM
	200	310	600	900		200	310	600	900
0.0 0.1 0.5 1.5 Mean±SEM	51 56 58 63 57±4 bc	62 68 64 64 65±5 c	44 51 53 49 49±3 b	26 33 30 34 31±4 a	46±3 x 52±3 y 51±5 xy 52±5 xy	33 29 35 33 33±3 b	39 37 41 32 37±3 b	31 30 33 29 31±3 b	14 12 16 16 15±3 a	29±5 27±3 31±3 28±4
因子	ANOVA p值
	巨噬细胞					异嗜细胞
甜菜碱 渗透压 甜菜碱×渗透压	0.05 0.02 NS					0.09 <0.01 NS

注：1. 同一行内含有小写字母a,b表示差异显著p<0.05,同一列内含有小写字母x,y表示差异显著p<0.05,p>0.1时认为差异不显著用NS标示。

2.巨噬细胞和异嗜细胞在含有不同甜菜碱和渗透压的培养基中培养6 h后，平均每个吞噬细胞加入10个堆型艾美尔球虫，加入球虫2 h后，统计含有2个或更多球虫的吞噬细胞的百分率。

表7 在含有不同渗透压和甜菜碱的培养基上培养的吞噬细胞应对堆型艾美尔球虫时NO的释放

甜菜碱（mmol/L）	巨噬细胞NO释放量（mmol）					异嗜细胞NO释放量（mmol）
	培养基渗透压（mOsmol）				Mean±SEM	培养基渗透压（mOsmol）				Mean±SEM
	200	310	600	900		200	310	600	900
0.0 0.1 0.50 1.50 Mean	18 21 20 17 24±2 c	23 25 23 20 23±1 bc	16 19 18 18 18±2 ab	11 17 14 17 15±1 a	17±2 21±1 19±2 18±2	3.3 4.2 2.9 3.7 3.5±0.2 b	2.5 4.1 2.9 3.3 3.2±0.2 b	1.2 1.5 2.0 1.2 1.5±0.1 a	0.8 1.4 1.2 1.6 1.25±0.1 a	2.0±0.1 a 2.8±0.1 b 2.3±0.2 ab 2.5±0.1 ab
因子	ANOVA p值
	巨噬细胞					异嗜细胞
甜菜碱 渗透压 甜菜碱×渗透压	0.07 0.04 0.09					0.04 <0.01 0.10

注:1.同一行或同一列中含有不同小写字母表示差异显著p<0.05。

2．巨噬细胞和异嗜细胞在含有不同甜菜碱和渗透压的培养基中培养15 min后，平均每个吞噬细胞加入10个堆型艾美尔球虫，加入球虫4 h后测定培养基中硝酸盐含量。

表8 应对球虫感染时甜菜碱和渗透压对吞噬细胞IL-1和IL-6释放的影响

		IL-1(×10-3units/L)	IL-6(×10-3units/L)
培养基渗透压，mOsmol 甜菜碱含量，mmol	200 310 600 900 0.0 0.1 0.50 1.5 SEM	2.3 bc 1.9 b 2.4 c 1.0 a 1.9 1.9 2.0 1.7 0.1	3.3 bc 3.1 b 3.8 c 1.4 a 2.9 2.9 3.0 2.9 0.2
因子		ANOVA p值
		IL-1	IL-6
甜菜碱 渗透压 甜菜碱×渗透压		NS <0.01 NS	NS 0.000 0.09

注:1.同一列中含有不同小写字母表示差异显著p<0.05,p>0.10认为差异不显著以NS标示。

2．巨噬细胞和异嗜细胞在含有不同甜菜碱和渗透压的培养基中培养3 h后，平均每个吞噬细胞加入10个堆型艾美尔球虫，加入球虫4 h后测定培养基中细胞因子的含量。

Dietary Betaine Increases Intraepithelial Lymphocytes in the Duodenum of Coccidia-Infected Chicks and Increases Functional Properties of Phagocytes

K.C.Klasing,K.L.Adler,J.C.Remus and C.C.Calvert

ABSTRACT： Betaine is used by cells to defend against changes in osmolarity. We examined relationships among betaine, osmolarity and coccidiosis. In the first experiment, chicks were fed corn-soy diets containing 0.0, 0.5 or 1.0 g/kg betaine; half were challenged with Eimeria acervulina (Cocci). Cocci decreased weight gain and feed efficiency and increased the osmolarity of the duodenal and jejunal mucosa (P _ 0.01). Betaine decreased osmolarity of the duodenum (P _ 0.01), especially in Cocci-challenged birds. Cocci increased the thickness (P _ 0.04) of and number (P _ 0.01) of leukocytes in the duodenal lamina propria especially at high betaine levels (interaction P _ 0.05). Villi height was decreased by Cocci (P _ 0.05) and this was ameliorated by 1.0 g/kg betaine (interaction P _ 0.04). Intraepithelial leukocyte numbers were increased by Cocci (P _ 0.01) especially at 0.5 and 1 g/kg betaine. Peritoneal macrophages or peripheral blood heterophils were incubated in media with an osmolarity of 200, 310, 600 or 900 mOsmol and 0.0, 0.1, 0.5 or 1.5 mmol/L betaine (4 _ 4 factorial) for 6 h and then E.acervulina were added. In general, phagocytosis and NO release were decreased and interleukin (IL)-1 and IL-6 release were increased in hyperosmotic media compared with isosmotic media. Betaine (0.1 mmol/L) increased NO release by heterophils (P _ 0.04) and tended to increase (P _ 0.1) NO release from macrophages. The chemotaxis of monocytes toward chemotactic factors released by heterophils was increased by betaine. Increased chemotaxis of monocytes and NO release by macrophages may explain the decreased intestinal pathology but increased leukocyte numbers that were observed when betaine was fed during a Cocci infection.

KEY WORDS: ● broiler ● betaine ● immunity ● coccidiosis ● osmolarity

参考文献：

1. Kidd, M. T., Ferket, P. R. & Garlich, J. D. (1997) Nutritional and osmoregulatory functions of betaine. World Poult. Sci. J. 53: 125–139.

2. Yancey, P. H., Clark, M. E., Hand, S. C., Bowlus, R. D. & Somero, G. N.(1982) Living with water stress: evolution of osmolyte systems. Science (Wash.,DC) 217: 1214–1222.

3. Haussinger, D. (1998) Osmoregulation of liver cell function: signaling,osmolytes and cell heterogeneity. Contrib. Nephrol. 123: 185–204.

4. Warskulat, U., Zhang, F. & Haeussinger, D. (1996) Modulation of phagocytosis by anisoosmolarity and betaine in rat liver macrophages (Kupffer cells) and RAW 264.7 mouse macrophages. FEBS Lett. 391: 287–292.

5. Warskulat, U., Schliess, F. & Haeussinger, D. (1998) Compatible organic osmolytes and osmotic modulation of inducible nitric oxide synthetase in RAW 264.7 mouse macrophages. Biol. Chem. 379: 867–874.

6. Zhang, F., Warskulat, U., Wettstein, M. & Haeussinger, D. (1996) Identification of betaine as an osmolyte in rat liver macrophages (Kupffer cells).

Gastroenterology 110: 1543–1552.

7. Zhang, F., Warskulat, U. & Haeussinger, D. (1996) Modulation of tumor necrosis factor-α
release by anisoosmolarity and betaine in rat liver macrophages

(Kupffer cells). FEBS Lett. 391: 293–296.

8. Horio, M., Ito, A., Matsuoka, Y., Moriyama, T., Orita, Y., Takenaka, M. & Imai, E. (2001) Apoptosis induced by hypertonicity in Madin Darley canine kidney cells: protective effect of betaine. Nephrol. Dial. Transplant. 16: 483–490.

9. Tiihonen, K., Kettunen, H., Remus, J., Saarinen, M. & Virtanen, E. (1997) Effects of dietary betaine on broiler chicks with or without mild coccidiosis challenge. Poult. Sci. 76 (Suppl.): 18.

10. Augustine, P. C. & Danforth, H. D. (1999) Influence of betaine and salinomycin on intestinal absorption of methionine and glucose and on the ultrastructure of intestinal cells and parasite developmental stages in chicks infected with Eimeria acervulina. Avian Dis. 43: 89–97.

11. Augustine, P. C., McNaughton, J. L., Virtanen, E. & Rosi, L. (1997) Effect of betaine on the growth performance of chicks inoculated with mixed cultures of avian Eimeria species and on invasion and development of Eimeria tenella and Eimeria acervulina in vitro and in vivo. Poult. Sci. 76: 802–809.

12. Hess, J. B., Eckman, M. K. & Bilgili, S. F. (1998) Influence of betaine of broilers challenged with two levels of Eimeria acervulina. Poult. Sci. 77: 43.

13. Remus, J. C. & Virtanen, E. (1996) Use of liquid betaine in low methionine diets for broilers. Poult. Sci. 75 (Suppl.): 35.

14. Matthews, J. O. & Southern, L. L. (2000) The effect of dietary betaine in Eimeria acervulina-infected chicks. Poult. Sci. 79: 60–65.

15. Matthews, J. O., Ward, T. L. & Southern, L. L. (1997) Interactive effects of betaine and monensin in uninfected and Eimeria acervulina-infected chicks.Poult. Sci. 76: 1014–1019.

16. Yun, C. H., Lillehoj, H. S. & Lillehoj, E. P. (2000) Intestinal immune responses to coccidiosis. Dev. Comp. Immunol. 24: 303–324.

17. NRC. (1994) Nutrient Requirements of Poultry. National Academy Press, Washington, DC.

18. Uni, Z., Noy, Y. & Sklan, D. (1996) Development of the small intestine in heavy and light strain chicks before and after hatching. Br. Poult. Sci. 37:63–71.

19. Saarinen, M. T., Kettunen, H., Pulliainen, K., Peuranen, S., Tiihonen, K. & Remus, J. (2001) A novel method to analyze betaine in chicken liver: effect of dietary betaine and choline supplementation on the hepatic betaine concentration in broiler chicks. J. Agric. Food Chem. 49: 559–563.

20. Klasing, K. C. & Peng, R. K. (1987) Influence of cell sources, stimulating agents, and incubation conditions on release of interleukin 1 from chicken macrophages. Dev. Comp. Immunol. 11: 385–394.

21. de Angelis, E., Petronini, P. G., Borghetti, P., Borghetti, A. F. & Wheeler,K. P. (1999) Induction of betaine-_-aminobutyric acid transport activity in porcine chondrocytes exposed to hypertonicity. J. Physiol. 518: 187–194.

22. Kempson, S. A. (1998) Differential activation of system A and betaine/GABA transport in MDCK cell membranes by hypertonic stress. Biochim. Biophys.Acta 1372: 117–123.

23. Bonadonna, R. C., Cobelli, C., Saccomani, M. P. & De Fronzo, R. A.(1993) Effect of insulin on system A amino acid transport in human skeletal muscle. J. Clin. Invest. 91: 514–521.

24. Sutinen, E., Jyrkkio, S., Gronroos, T., Haaparanta, M., Lehikoinen, P. & Nagren,K. (2001) Biodistribution of (11C)methylaminoisobutyric acid, a tracer for PET studies on system A amino acid transport in vivo. Eur. J. Nucl. Med. 28: 847–854.

25. Rasola, A., Galietta, L. J., Barone, V., Romeo, G. & Bagnasco, S. (1995) Molecular cloning and functional characterization of a GABA/betaine transporter from human kidney. FEBS Lett. 373: 229–233.

26. Burnham, C. E., Buerk, B., Schmidt, C. & Bucuvalas, J. C. (1996) A liver-specific isoform of the betaine/GABA transporter in the rat: cDNA sequence and organ
distribution. Biochim. Biophys. Acta 1284: 4–8.

27. Denkert, C., Warskulat, U., Hensel, F. & Haeussinger, D. (1998) Osmolyte strategy in human monocytes and macrophages: involvement of p38MAPK in hyperosmotic induction of betaine and myoinositol transporters.Arch. Biochem. Biophys. 354: 172–180.

28. Kettunen, H., Peuranen, S. & Tiihonen, K. (2001) Betaine aids in the osmoregulation of duodenal epithelium of broiler chicks, and affects the movement of water across the small intestinal epithelium in vitro. Comp. Biochem.Physiol. A Mol. Integr. Physiol. 129: 595–603.

29. Ruff, M. D. (1978) Malabsorption from the intestine of birds with coccidiosis. In: Avian Coccidiosis (Long, P. L., Boorman, K. N. & Freeman, B. M.,eds.). British Poultry Science, Edinburgh, UK.

30. Mongin, P. (1976) Ionic constituents and osmolality of the small intestinal fluids of the laying hen. Br. Poult. Sci. 17: 383–392.

31. Johnson, J. & Reid, W. M. (1970) Anticoccidial drugs: lesion scoring techniques in battery and floor-pen experiments with chickens. Exp. Parasitol. 28:30–36.

32. McDougald, L. R. & Reid, W. M. (1997) Coccidiosis. In: Diseases of Poultry (Calnek, B. W., ed.). Iowa State University Press, Ames, IA.

33. Kettunen, H., Tiihonen, K., Peuranen, S., Saarinen, M. T. & Remus, J. C.(2001) Dietary betaine accumulates in the liver and intestinal tissue and stabilizes the intestinal epithelial structure in healthy and coccidia-infected broiler chicks. Comp. Biochem. Physiol. A Mol. Integr. Physiol. 130: 759–769.

34. Ovington, K. S., Alleva, L. M. & Kerr, E. A. (1995) Cytokines and immunological control of Eimeria spp. Int. J. Parasitol. 25: 1331–1351.

dingjq03

YAG养猪可以 用来减肥的

yangxue

很详细的资料可以研究一下

lijing521

学习了，但对甜菜碱增强吞噬细胞吞噬能力的机制不能理解，希望有更多的试验来进行深入研究