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发表于 2010-5-30 16:40:49
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饲料原料、饲料中霉菌毒素快速检测新技术研究与应用
徐 超
上海澳灵生物科技有限公司
摘要：本文通过对当前霉菌毒素污染现状的展现以及对传统霉菌毒素检测技术的对比分析，着重提出了霉菌毒素检测技术的重要性和实际应用存在的问题，也直接指出了生产一线对于霉菌毒素检测技术的迫切需求，通过对传统检测技术中的免疫方法的分析和论证，在充分结合生产实际以及对于霉菌毒素问题解决要求的基础上，充分吸收了现有检测技术优点，开发了新型金标抗体快速检测试纸条，彻底解决生产单位对于各种原材料霉菌污染情况滞后控制的被动局面的实际问题，对整个饲料养殖行业乃至食品行业的产品安全保障起到了强化作用，对进一步提高饲料转化率和养殖经济效益具有重大促进作用。于此同时，就当前在饲料养殖领域普遍推广的霉菌毒素吸附剂使用技术也进行了科学的分析，为这些成品的应用提供了可靠性依据。文章同时还为其他快速检测技术的研发提供了参考思路。
关键词：饲料原料 霉菌毒素 危害 快速检测 金标抗体 试纸 现场
众所周知，在各种农产品上生长着各种各样的霉菌，这些霉菌在一定的环境条件刺激下，都能产生霉菌毒素，霉菌毒素是一类有毒的化合物，有些甚至是致癌的（如黄曲霉毒素）。霉菌毒素有很多种（CAST,2003），包括黄曲霉毒素，主要是黄曲霉毒素B1和M1（Aflatoxins，FB1、FM1）；赭（棕）曲霉毒素A（OchratoxinA，OA）；杂色（柄）曲霉毒素（Terigmatocystin）；展青霉素（Patulin,PTL）；玉米赤霉烯酮（Zearalenone,ZEN(F－2)）;串珠镰刀菌素（Moniliformin,MF），三硝基丙酸以及属于单端孢霉烯族化合物（Trichothecenes）的T－2毒素（T－2toxin,T－2）；脱氧雪腐镰刀菌烯醇（呕吐毒素）（Deoxynivalenol,DON）；二乙酰镳草镰刀菌烯醇（Diacetoxyscirpenol，DAS）等。
联合国粮农组织也在近期的报道中指出，为了保障人类的健康，全世界至少99个国家，占世界人口的87％，针对粮食和饲料的霉菌毒素污染问题都有相关的规定，有些规定限量还非常苛刻。在未来的几年里，不断变化的全球气候突发事件的增多将进一步向我们提出挑战。霉菌毒素污染给粮食生产者、 家禽生产者以及食品和饲料的加工企业造成了巨大的经济损失。中国的霉菌毒素污染问题也不例外，根据中国农业大学计成教授等多年来的的调查结果显示，中国境内的霉菌毒素污染问题相当严重，根据污染程度的轻重，将中国划分为四个区域（见下图1）。
图1 中国区域内霉菌毒素污染现状分布图
备注：B1区域为轻污染区；B2为一般污染区；B3是中度污染区；B4是超重度污染区。
从上图分布情况可以看出，一向认为是没有霉菌毒素污染地区的北方大部分地区，同样被霉菌污染所包围，因此，霉菌毒素的广泛存在以及霉菌毒素对我们身体健康的影响已经引起了各级政府的高度关注，随之一系列有关食品安全、饲料安全的法规和制度也先后出台了，而且大多数为强制性执行标准。同时也因为越来越多的养殖企业开始大量使用霉菌毒素吸附剂，饲料企业也开始密切关注霉菌毒素吸附剂的使用情况，但是在使用的过程中，一直存在着一些疑问：是不是每批原料都需要使用脱毒技术？是不是每批原料的毒素吸附剂使用剂量都相等？诸如此类疑惑藏在从业人员心间，于是有些客户就不断寻找一种可以在使用吸附剂前快速检测原料中霉菌毒素污染程度的技术，只有这样才可以为饲料中添加霉菌毒素吸附剂提供现场的直接的原始依据。所以研究并开发饲料原料以及饲料中霉菌毒素污染程度的快速检测技术已经成为一个市场的迫切需求了。
一、饲料霉变对畜牧业的危害
霉菌毒素污染的饲料对动物生产性能带来的负面影响有些是察觉不到的， 有些却是破坏性的。世界范围内，养殖业每年因霉菌毒素对饲料的污染造成的经济损失就有几百亿美元。如黄曲霉毒素污染造成经济损失包括它能使动物生长受阻、 饲料适口性降低、食欲减退、饲料转化效率下降、死亡率增加、降低繁殖性能、蛋鸡产蛋量减少、 肉鸡腿病和胴体污染、内脏出血、肝脏受损、胚胎中毒和对环境应激和病原微生物的抵抗力下降等等。肉鸡黄曲霉毒素中毒后，血液中总蛋白、 胆固醇和血液尿素氮的含量减少。还发现黄曲霉毒素影响维生素D的代谢，造成骨骼强度下降，腿软弱无力。另外黄曲霉毒素还影响几种矿物元素的代谢，如铁（引起溶血性贫血）、 磷（引起腿软弱无力）。
霉菌毒素主要通过影响细胞和体液免疫功能来降低动物机体的抵抗力。大量研究表明，黄曲霉毒素引起肉鸡的免疫功能抑制进而增加对疾病的易感性，饲以蛋鸡50～200μg/kg黄曲霉毒素的日粮，其产蛋率和孵化率显著降低；对肉鸡的研究表明，日粮中100～200μg/kg的黄曲霉毒素可显著降低嗉囊重量，对肉鸡免疫功能产生不良影响。当实验动物接触单端孢霉毒素后，会导致其对传染病的易感性。黄曲霉毒素对免疫系统的影响有如下几方面：法氏囊和胸腺的体积变小；Ｔ淋巴细胞、Ｂ淋巴细胞和白细胞的数量减少；血清总蛋白和免疫球蛋白水平降低；抗体滴度下降；血清中抗生素浓度下降等。单端孢霉毒素也可影响抗体的产生，这使得机体反应在免疫程序中减弱。同样赭曲霉毒素A对免疫功能有抑制作用，这和赭曲霉毒素的致癌作用有直接的联系。
霉菌及其次级代谢产物（主要是霉菌毒素）在动物性食品中残留可通过食物链而对人类健康构成潜在危害。例如黄曲霉毒素Ml是黄曲霉毒素B1在哺乳动物体内的主要代谢产物。存在于动物的乳汁、肝、蛋类等可食部分，常见于乳汁中，它有很强的毒性和致癌性。由于乳及乳制品是婴幼儿的主食，而婴幼儿的解毒功能器官发育不完善，因此黄曲霉毒素M1对婴幼儿健康有直接的威胁，在实际生产中，严格控制奶牛饲料中黄曲霉毒素B1的含量对保障奶及奶制品安全具有直接的现实意义。同样赭曲霉毒素A在动物产品中的残留问题也应引起高度重视，Krogh等证实该毒素可在肾、肝和肌肉中残留（见下表1、表2）。
从表1可以看出，我们人类的许多重症和不治之症都和霉菌毒素的污染密切相关，要攻克疾病治愈难题，首先要攻克霉菌毒素污染的治理难关。
从表2可以看出，尽管霉菌毒素污染很严重，其对于动物的健康危害非常可怕，但是对于不同的动物来说，不同的霉菌毒素对其的影响是有差异的。而事实上同一种霉菌毒素对于动物的不同生长阶段，其影响也是不同的，一般而言幼小动物对于霉菌毒素的敏感度要高于成年动物。
另外，由于绝大多数霉菌毒素中毒的动物表现症状都不是急性发作的，而是逐渐积累到一定程度突破动物自身的耐受限度后才表现出来，因此霉菌毒素的危害有很强的隐蔽性，加上各种霉菌毒素之间存在着协同叠加效应（如表3列举），因此，当饲料中存在多种霉菌毒素时，其毒害效应往往比单一毒素的危害要增强数倍乃至数十倍。
表1 已经被确认的疾病的元凶
表2 霉菌毒素对动物的危害
表3 霉菌毒素之间的协同效应
综上所述，生产单位技术人员只有掌握了饲料中的主要霉菌毒素污染程度（根据不同动物敏感度确定主要毒素种类），才能够科学的制定解决方案，合理的把霉菌毒素危害降到最低。所以对饲料原料和饲料本身开展毒素检测至关重要。
二、饲料中霉菌毒素的定性与定量检测技术
目前已经被大家所熟悉并接纳的检测技术主要有以下几种：
一类是生物学检测法, 包括种子发芽试验、呕吐试验等，但是检测结果的时效性很差，在实际生产中已很少采用；另一类是理化检测法, 薄层色谱法(TLC)和高效液相色谱法(HPLC)。TLC虽然简便，但灵敏度差； HPLC虽然灵敏度高，但样品处理烦琐，操作复杂，仪器昂贵，标准品耗用大。还有一类是利用免疫化学原理开展的实验室快速检测法，如ELISA方法---即酶联免疫法。
2.1目测法
当出现畜禽拒食，饲料和谷物发热，有轻度异，色泽变暗，饲料结块等迹象时应考虑饲料可能霉变。因霉菌都是从霉菌孢子或是菌丝体碎片开始生长的，霉菌生长时消耗了养分，代谢中有能量释放，故而使饲料变色、变味、发热。
菌丝体可与饲料纵横交织，形成菌丝蛛网状物，这些结构使得饲料结块。在我们肉眼所能够观察到这些菌丝网状物以前，菌丝体已经在大范围内生长繁殖。因此，饲料结块是诊断饲料霉变的最简易实用的方法之一。
不同的霉菌菌落各有其特征，通过显微镜观察可进一步检测确认。
另外饲料养殖企业经常采用的计数统计方法也属于此类（在1000粒玉米颗粒中检出多少粒发霉的颗粒，控制标准为低于2%），但是这种方法一般只是直观检测有霉菌的情况，并不能对于隐含其内部肉眼看不见的霉菌毒素给出精确判定，实际上并不可靠，因为霉菌和霉菌毒素是两个不同的概念。
2.1.1 曲霉属
本属菌的菌落颜色多样，而且比较稳定，是分类的主要特征之一。曲霉菌落表面一般呈绒毛状，起初为白色或灰白色，长出孢子后则显现出不同的颜色，随菌种而异。如黄曲霉毒素产毒菌株长出黄绿色分生孢子，此时将培养皿置于365 nm紫外灯下，菌丝体出现亮紫色荧光。寄生曲霉由致密的基层菌丝组成，具有较宽、白色、几乎不形成孢子的边缘，前期呈明显的淡黄色，以后呈草绿色，最后呈暗浊黄绿色,其小梗是纯单层。杂色曲霉小梗严格双层,分生孢子头呈典型的放射状，明显的绿色，分生孢子梗无色或浅褐色。
2.1.2 青霉属
青霉的菌落大多呈灰绿色。菌落有绒状、絮状、绳状和束状4种类型。有的青霉菌菌落具有放射性皱褶，有的形成同心轮纹，有的在基质表面有渗出液。显微镜下观察时可见到独特的帚状体结构。
2.1.3 镰刀菌属
镰刀菌菌落一般呈白色绒毛状，常产生可溶性色素。分生孢子有大小2种类型，显微镜下大型分生孢子大多呈镰刀形，多隔；小型分生孢子有卵形、梨形、圆形和柱形等。
2.2薄层层析法(TLC)
TLC法是我国测定食品及饲料中霉菌毒素的国家标准方法之一，其原理是针对不同的样品，用适宜的提取溶剂将霉菌毒素从样品中提取出来，经柱层析净化，再在薄层板上层析展开、分离，利用霉菌毒素的荧光性，根据荧光斑点的强弱与标准比较测定其最低含量。TLC法由于设备简单，易于普及，所以国内外仍在使用，但该法样品前处理繁琐，且提取和净化效果不够理想，提取液中杂质较多，在展开时影响斑点的荧光强度，而双向展开虽避免了杂质干扰，但增加了操作步骤和时间(叶雪珠,2003)。此类方法和前面的目测法仍然偏重于定性检测。
2.3色谱法(HPLC)
色谱法，包括薄层色谱、气相色谱、液相色谱等，一直是最重要的真菌毒素的化学分析方法。薄层色谱由于方法灵敏度和分离效率等问题，1985年以后便很少用了，然而，在发现确证新毒素、快速监测方法建立、毒素分析方法研究等方面，尤其是当实验条件有限时，薄层色谱依然有其优越性；气相色谱，包括气相色谱-质谱联用技术，更多的是用在单端孢霉烯族毒素的分析上；现在比较普遍的真菌毒素的分析方法还是液相色谱法，包括液相色谱-质谱联用技术，在方法适用性、分离效率和灵敏度方面，液相色谱法及液相色谱-质谱联用技术都是其他方法所无法替代的。近年来，毛细管电泳及毛细管电泳-质谱联用技术以其高分离效率也开始应用在真菌毒素分析领域并引起了广泛关注。
总之，HPLC法是近几年发展起来的检测霉菌毒素方法，主要是用荧光检测器检测，在适宜的流动相条件下，采用反相C18柱，使霉菌毒素同时分离。该法快速而准确，纯化效果好，最低检出量0.08ng，回收率为92.87%，但需要昂贵的仪器设备，一般仅限于专业检测机构获得科研和调查分析、监测使用，未能在企业广泛推广使用，而且其结果的滞后效应大大降低了对生产实际的指导效果。
2.4免疫化学检测法
免疫学检测方法是基于抗体与抗原或半抗原之间的选择性反应而建立起来的一种生物化学分析法，该方法横跨细胞免疫学学科、分子免疫学学科、生理生化学科等诸多学科领域，是一种多学科交叉后产生的新技术。由于免疫反应的特异性特点，此种方法具有较高的选择性和很低的检出限，广泛用于各种抗原、半抗或抗体的测定，一般可分为荧光免疫法、发光免疫法、免疫法及电化学免疫法等非放射免疫法和放射免疫法，其中在饲料霉菌毒素检测中应用较广的主要是酶联免疫吸附法（ELISA），也可以称作是实验室快速检测法，1977年美国Lawell 等首先建立了ELISA竞争法检测AFB1 。随后美国学者朱繁生教授、英国学者Morgan 教授分别改进了该法。我国李秀芳和俞顺章教授分别于1987年与90 年代建立了ELISA 法检测AFB1 ，成恒嵩教授等起草了饲料中AFB1 的ELISA检测方法国家标准，并于1998 年由国家质量技术监督局正式批准颁布实施。
ELISA 法特别适宜大批样品的集中检测，相对于单个饲料企业来说，本方法在实际应用上存在着明显的缺陷。目前有较多的集团性农牧企业在集团总部检测中心建立了ELISA检测实验室，也有个别饲料企业购置了酶标仪开展检测，但是无论是集团性检测还是单个饲料企业开展检测，都由于收到检测样品数量的限制以及送检集团总部的时间限制性和检测成本等因素，仍然不能满足生产一线的现场快速检测的需求。
总体来说，免疫学检测方法由于其快速、灵敏、准确、可定量、操作简便、无需贵重仪器设备，且对样品纯度要求不高等特性，特别适用于饲料厂进行原料或成品的检测。其基本原理是在合适的载体上，酶标记抗体或抗原与相应的抗原或抗体形成酶标记的抗原抗体复合物，在酶底物参与下，复合物上的酶催化底物使其水解，氧化或还原成为另一种带色物的抗原和抗体的含量。该免疫学方法更实际，其灵敏度与TLC或HPLC法相当，因而具有更广阔的应用前景。
该类方法有以下特点：1) 灵敏度高：免疫层析法检出量可达ng级，ELISA 法最低检出量可达pg级，并可定量测定。2) 干扰小：抗体抗原的免疫反应特异性很强，结构类似物、荧光物质、有色物质对检测的干扰很小。3) 操作简便快捷：由于特异性强，简化了样品的预处理和提取纯化过程，同时操作步骤也非常简便，测定时间也短。4) 安全性高，污染少，成本低廉：不需要昂贵的测定仪器，所用试剂也相对较少，特别是因为灵敏度高，毒素标准品的浓度可以很低，减少了对检测人员和环境的潜在危害和污染。
三、国内几种真菌毒素检测方法的研究进展
3.1 黄曲霉毒素B1是二氢呋喃氧杂萘邻酮的衍生物。即含有一个双呋喃环和一个氧杂萘邻酮（香豆素）。前者为基本毒性结构，后者与致癌有关。国内最早研究真菌毒素免疫检测方法的是中国医学科学院肿瘤研究所的孙宗棠，他于1983年建立了AFB1单克隆抗体放射免疫测定方法。1992年，中国科学院上海细胞所李永镛和上海医科大学公共卫生学院殷芬、俞顺章等人合作建立了AFB1单克隆抗体的酶联免疫检测方法。中国预防医科院营养与食品卫生研究所和江苏微生物所也先后建立了AFB1多克隆抗体的酶联免疫测定方法。北京市营养源研究所路戈与中国医科院肿瘤研究所王德斌和卫生部食品卫生监督检验所计融等人合作于1994年建立了规范的AFB1单克隆抗体酶联免疫检测方法，该法已列为国家标准（GB/T5009.22－1996）。在1985年以前，另有几种荧光色谱法列为国家标准（GB/T5009.23－1996;GB/T5009.24－1996）。其中薄层色谱法由卫生研究所和青岛商品检验局于1973年建立（GB/T5009.22－1996）。
3.2 T－2毒素为剧毒（猪静注LD50=1.2mg/kg），具有明显的细胞毒，而且是体内蛋白质合成的抑制剂，有致畸性和致突变性。中毒后呕吐，腹泻，严重时损伤造血组织。T－2毒素的免疫检测方法由卫生部食检所阳传和、罗雪云、计融于1991年建立（GB/T14933－94），方法最低检出量为1ng/ml，敏感范围为4－1000ng/ml。这是首次采用免疫技术建立的检测真菌毒素的国家标准。
3.3 脱氧雪腐镰刀菌烯醇（呕吐毒素，DON）是较早（1970年）被分离提纯后命名的真菌毒素，毒性弱于T－2毒素，（小鼠经口LD50=9.2mg/kg）中毒症状类似，有明显的致吐作用。DON经对甲基苯甲醛喷雾后呈黄色，卫生部食检所魏润蕴于1986年建立了DON薄层层析检测方法（GB/T14929.5－1994）。DON免疫检测方法由卫生部食检所阳传和、计融于1992年建立，方法最低检出量为5ng/ml，敏感范围为5－1000ng/ml，该法已批准为国家标准（GB/T14929.5－1994）。小麦、面粉、玉米及玉米粉中脱氧雪腐镰刀菌烯醇限量标准已于1996年9月1日颁布实施（GB16329－1996），最高允许量为1000μg/kg
3.4二乙酰镳草镰刀菌烯醇（DAS）的毒性强于T－2毒素（猪静注LD50=0.367mg/kg），1992年，卫生部食检所李业鹏、罗雪云等用酶标记单克隆抗体建立了检测DAS的双抗夹心酶免疫斑点检验方法，最低检出量为10ng/ml，敏感范围为2－1000ng/ml。
3.5玉米赤霉烯酮（ZEN，F－2）是另外一种从赤霉病麦中分离出来的真菌毒素（化学名称为6－（10－羟基－6－氧基碳烯基）－β－雷锁酸－μ－内酯，分子量为318），主要污染小麦、大米、玉米、荞麦等谷物，是一种生殖系统毒素，有强烈致畸作用。ZEN在波长为254nm短紫外光照射下发出兰绿色荧光，卫生部食检所罗雪云、胡霞于1992年建立ZEN薄层层析分析方法，最低检出量为50μg/kg。1993年中国农科院兰州兽医所王景琳、张志东等建立了ZEN单克隆抗体酶联免疫检测方法，最低检出量为0.3ng/ml。1995年，北京市营养源研究所路戈等也建立了ZEN单克隆抗体免疫检测方法，最低检出量为1ng/ml，敏感范围5－1000ng/ml，该法已通过国家标准审查。
3.6 赭曲霉毒素A（OA）主要表现为很强的肾脏毒（大鼠经口LD50=20mg/kg）并有致畸性和致癌性，污染的谷物主要为麦类及玉米。在紫外光下赭曲霉毒素A呈绿色荧光，卫生部食检所于1991年建立了OA薄层层析分析方法，已列入国家标准（GB13111－91）。1992年该所阳传和、罗雪云等又建立了OA单克隆抗体免疫检测方法，也已经被批准为国家标准。
3.7 黄曲霉毒素M1（AFM1）是AFB1经动物代谢产生的衍生物，可以从内脏、尿和乳汁中测出。尿或乳汁中排出的AFM1的量约为摄入AFB1量的1％。AFM1的毒性（鸭雏经口LD50≈0.32mg/kg）仅次于AFB1，致癌性也相似。因此乳及乳制品中AFM1的污染控制是食品卫生工作的重要环节。我国规定牛乳中AFM1的含量不得超过0.5μg/kg，乳制品按实际含乳量折算(GB9676－88)。1980年卫生研究所胡文娟、韩玉莲（AFM1在波长365nm紫外光照射下呈兰紫色荧光）建立了检测几种主要动物性食品中AFM1的薄层层析法，最低检出量为0.1～0.5μg/kg（GB/T5009.24－1996）。1992年中国预防医科院营养与食品卫生研究所的刘兴介等人利用美国威斯康星大学朱繁生教授提供的单克隆抗体应用ELISA直接竞争法测定了97份乳粉样品中的AFM1含量。（阳性率84.5％，超标率39.2％，最高4.16ng/g）1996年，卫生部食检所李燕俊、计融开始研究AFM1的免疫检测技术，目前主要工作已经完成。
3.8杂色曲霉素（柄曲霉素，分子量324）是一种很强的肝及肾脏毒素。可导致胆管癌和肝癌，有致突变性，但对食品的污染频率较低。杂色曲霉素经三氯化铝喷雾后加热，可在365nm波长紫外光下呈黄色荧光。卫生研究所建立的检测杂色曲霉素的薄层色谱法已于1984年列为国家标准（GB/T5009.25－1996）。该法对大米、玉米、小麦的最低检出量为25μg/kg，黄豆、花生为50μg/kg。
3.9展青霉素（PTL）有致癌性，也有致畸、致突变作用，在水果制品中的污染较为严重。1998年卫生研究所刘勇、胡文娟建立了苹果、山楂制品中展青霉素的薄层扫描测定法。该法于1994年列为国家标准，同时还规定了展青霉素的限量卫生标准（GB14974－94）。1992年吴南建立了用高效液相色谱法测定展青霉素的方法，最低检出量为2μg/kg。
3.10串珠镰刀菌素（MF）属剧毒物，有很强的心脏毒，中毒死亡后可见心肌坏死性病变，近年研究表明该毒素可能是克山病主因。串珠镰刀菌广泛污染粮食作物，其中对玉米的污染率较高。1984年，俞世荣、王玉华建立了串珠镰刀菌素的薄层及高效液相色谱测定法。
四、对于饲料中现有霉菌毒素检测技术的小结
因化学加工、人为添加而进入食品中的有毒化合物所造成的危害是可以被预防的；而以食品的天然组分形式存在的天然霉菌毒素则不易被识别，且由于潜在毒性大，从而会对消费者的健康造成更大的威胁。霉菌毒素是霉菌次级代谢产物，属于化学污染物，对人和动物都会产生非常严重的危害。拿黄曲霉毒素来说，含有黄曲霉毒素的食品被人误食后容易出现肝脏病变，甚至导致肝癌；所以，对饲料、食品等原料开展霉菌毒素检测是非常迫切需要解决的问题。
事实上，越早进行霉菌毒素检测就越容易将霉菌毒素产生的危害降到最低。如能从源头就发现霉菌毒素，则便于及早采取合理的措施控制霉菌毒素，以免受霉菌毒素污染的饲料给养殖业带来危害，从而使企业包括食品安全蒙上阴影。实际操作中，如果在饲料原料采购环节就采用快速筛选的方法，查看饲料原料是否含有霉菌毒素，则可以使企业避免使用含霉菌毒素的原料生产饲料，或者在原料紧缺又必须生产的情况下，可以针对检测结果采取有效的霉菌毒素处理技术，全面降低霉菌毒素的毒害性。而目前已有的无论是目测、TLC法或者HPLC法以及称之为实验室快速检测的ELISA试剂盒方法，都不能够实现对于单一饲料原料和饲料成品的快速霉菌毒素污染程度的检测，不是由于样品数少就是实际成本过高无法承受或者就是检测结果所需要的时间太长等原因，导致了检测应用严重受限，饲料利用、养殖经济效益都受到明显影响，更加严重的是由于长期没有可控制的直接指导数据，大多数饲料在到达养殖场以前几乎没有采取任何霉菌毒素的防治措施，动物都处于慢性中毒的状态中（根据2006、2007、2008及2009年度上半年的检测数据表明，饲料及饲料原料中同时存在四种以上霉菌毒素污染状态比率占到被抽检样品总数的49.1%（见图2 检测样品中霉菌毒素污染情况比率），霉菌毒素污染已经是作为一种常态而存在，一旦积累到动物不能承受了则开始出现病症，即使不发病，动物内脏中所积累的毒素含量也足可以通过食物链来影响到人类的健康，如牛奶中的黄曲霉毒素M1就是由饲料中的黄曲霉毒素B1经过生理代谢转化而来，对牛奶的食用者来说危险极大。一线的生产部门非常需要一种能够在现场就开展检测且不受样品数量的限制，成本又不太高，又能够把握住霉菌毒素污染程度的先进实用的新检测技术。
图2 检测样品中霉菌毒素污染情况比率对比
因此，研制对霉菌毒素快速、高灵敏、高特异性的现场、廉价的可靠的检测方法显得尤为重要。高效液相色谱、质谱检测法，可做出精确定性定量测定，运用恰当甚至可测到各组分的含量，它们灵敏度高、选择性强，有极好的发展前景，但是样品前处理要求严格，标准品纯度有一定的要求，而且仪器昂贵，测试人员往往还要进行专门的培训，因此成本较高。所以，仅适合大型企业或对检测灵敏度要求较高的科研院校、检测机构等单位使用。免疫学检测方法尤其是酶联免疫吸附法具有灵敏度高，干扰少，测定步骤简便、快速，操作安全，设备投资少，测定结果准确可靠等特点，非常适合实验室开展集中的样品快速检测，由于受到样品数量、试剂盒特殊保存条件、毒素标准品供应以及酶标仪操作要求的限制，无论检测结果的稳定性、可靠性和经济性，均不能满足进行现场快速检测的需求。
五、适合于饲料养殖企业进行现场快速检测霉菌毒素污染的新技术
在传统检测方法基础之上，近年来发展了许多新的检测方法，其中值得一提的是，最近建立的采用免疫学和分子免疫学原理，利用特异性抗体与抗原的反应原理，开发一种现场的霉菌毒素检测技术大受欢迎，这就是目前比较热门的金标试纸卡现场霉菌毒素快速检测技术。霉菌毒素快速检测试纸法应用于饲料原料检测，可以快速得到结果，为饲料、养殖企业应对霉菌毒素潜在危害的处理提供事先的、直接的、相对合理的科学依据。当原料快检呈阳性结果时表明样品中毒素的残留限量在检测设限值以上，当原料快检呈阴性结果时表明样品中毒素的残留限量在检测设限值以下。目前此项技术的开发已经完全国产化，并拥有自主的知识产权。
5.1 霉菌毒素现场快速检测新技术
5.1.1主要原理
利用特定的抗原抗体反应原理，采用实现包被的特异性抗体捕捉检测对象中的对应霉菌毒素成分，进而通过观察测试线和控制线的显色反应来达到判定检测对象中的霉菌毒素污染程度的目的。如下图结构（图3 金标试纸卡的组成结构图）
图3 金标试纸卡的组成结构图
检测反应过程如图4、图5
图4样品检测阴性反应示意图
图5 样品检测阳性反应示意图
图6 阴性、阳性检测试纸反应实物图
5.1.2 快速检测结果判定
该技术根据不同霉菌毒素的危害程度以及饲料原料和饲料中对各种动物耐受限度的国标要求，设定了不同的最低灵敏度值，就是说，只要滴入检测液加液孔中的液体中被检毒素的浓度超过的最低检测灵敏度，则显示阳性，反之则显示阴性。根据这个道理，检测人员可以在样品前处理提取出毒素后，应用专配的毒素检测稀释液进行等倍数稀释配置成最终的检测液，继而根据检测结果推算出被检样品中毒素含量的基本范围，从而对生产提供直接的指导意义。
5.2 几种检测方法的对比
作为一种新型的霉菌毒素快速检测技术，国外和国内基本上达到了同步，而且技术水平相当，无明显的差异，根据武汉粮食中心的验证结果表明（见表4、表5），黄曲霉毒素检测结果和实验室检测结果完全符合，赤霉烯酮的符合率也达到了94%以上，如果加上试纸法本身的误差范围，快速试纸检测结果的准确性在95%以上是由保障的。其最重要的意义在于，对于一个生产型企业而非研究机构的而言，对于霉菌毒素污染的状况启示只需要知道一个相对准确的范围就可以对生产提供直接的指导，根本不需要采用费时、费钱、费人的方法检测出具体的含量。
除此之外，国产技术转化产品在成本上拥有完全的优势，与目前市售的试剂盒相比，具有快速、方便、便宜和现场性等特点，加上其成本只有进口同类产品的40%左右，完全可以替代进口产品。应该说该技术具有很强的实用性，具有较高的推广价值。该技术的应用，必然能够给我国饲料安全、食品安全增加一层强有力的保护层，为国家的经济建设做贡献。
表4 快速检测技术与传统方法的对比
表5 快速试纸与试剂盒对比
表6黄曲霉毒素B1测试结果比较
表7 玉米赤霉烯酮测试结果比较
六、新型霉菌毒素快速检测技术在生产实际中的应用
为了更好的在生产实际中使用好这个快速检测技术，真正实现用最经济的检测投入达到检测目的，从而赢得在霉菌毒素污染问题解决中的空间与时间，各个生产单位技术人员需要从以下几个方面来逐一规范，才能够发挥快速检测的作用。简单的说就是一标二告三测四判五定六选六个步骤，简要分述如下：
6.1一标---制定内控标准
根据企业自身生产产品的特点以及动物不同阶段，参照国标限值和动物耐受限量指标，首先制定本企业内部的各类原料和成品中霉菌毒素含量的限值标准，即内控标准，这点非常重要，没有标准品控人员将无法比判，如果本标准制定不合理，判断的结果将和生产实际产生较大误差，会对生产实际产生指导偏差，那么会大大降低快速检测技术的价值。建议各个单位应该多搜集相关资料和标准，紧密结合自身的产品生产需要来制定。
6.2二告---告知供应商、采购、品控
即将经过论证制定的霉菌毒素内控标准进行备案，并告知原料供应商、采购部、品控部，便于进行统一管理。标准出台后要快速告知相关环节，尤其是企业内部的品控和采购人员，否则容易产生误会和工作上的摩擦，不利于正常的工作开展。
6.3三测---依据标准检测
检测人员按照企业技术部拟定的内控标准进行快速检测，并进行快速的判断。只要拥有了标准，品控人员就可以利用本技术快速的测定结果。
6.4四判---根据检测结果对照标准判定合格与否
根据检测的结果并对照内控标准，快速判断被检对象是否符合安全控制标准。检测过程中一定要严格按照操作有关要求并注意细节，确保结果的准确性。
6.5五定---制定解决应对方案
根据判定结果，参照原料的实际使用状况和毒素吸附剂产品的功能特点，由品控部提出初步的解决方案，技术部进行最后的裁定。
6.6六选---选择合适的脱毒产品
需要使用毒素吸附剂进行脱毒时，则根据技术部门制定的解决方案联系合适的产品供应厂商，在生产饲料时添加使用。
七、小结
霉菌毒素的污染尽管已经非常严重，但是我们毕竟已经研究了多种应对的方法，只要能够在使用含有霉菌毒素的原料之前快速得到污染数据或者污染程度的判断，我们就可以采取有效的积极的应对措施，将霉菌毒素的危害降到更低，从而保障饲料、养殖的健康发展。从这点上说，金标抗体快速检测试纸技术的及时推出，必然能够为整个饲料养殖行业早日摆脱“霉毒”的困扰做出较大贡献，对于饲料中其他物质含量的快速检测技术研发也具有重要的启发和参考作用。
作者及单位联系方法：
徐超 上海澳灵生物科技有限公司 技术总监
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