喹乙醇--------想说爱你不容易

言西早 · 发表于 2010-4-17 10:11:39

[p=30, 2, left][b][font=SimHei][size=15pt]穿梭质粒pSP189/哺乳动物Vero细胞检测系统在[b]喹[/b][b]乙醇[/b]诱变分子机制研究中的应用[/size][/font][/b][/p][p=30, 2, left]郝利华，肖希龙，周宗灿[/p][p=30, 2, left](1.中国兽医药品监察所，北京 100081；2.中国农业大学动物医学院，北京　100094；3.北京大学医学部，北京　100083)[/p][p=30, 2, left][b][size=12pt]Molecular Mechanism of Mutag-enesis Induced by OlaquindoxUsing a Shuttle Vector pSP189/Mammalian Cell System[/size][/b][/p][p=30, 2, left]HAO Li-hua, XIAO Xi-long,,ZHOU Zong-can[/p][p=30, 2, left](1.China Institute of Veterinary Drug Control, Beijing 100081,China;2.Department of Pharmacology and Toxicology, College of Veterinary Medicine,China University of Agricnltwre,Beijing 100094,China; 3.Department of Health Toxicology, College of Medicine, Beijing University, Beijing 100083,China)[/p][p=30, 2, left]　　【摘要】背景与目的：将短暂复制型穿梭质粒pSP189与非洲绿猴肾细胞(Vero细胞系)组成穿梭质粒/哺乳动物细胞诱变检测系统，并将该系统应用于[b]喹[/b][b]乙醇[/b]的诱变性检测。材料与方法：质粒经6.6μg·ml－1[b]喹[/b][b]乙醇[/b]处理后，转染Vero细胞，从细胞中回收质粒转化E.coli MBM7070指示菌筛选突变体。结果： [b]喹[/b][b]乙醇[/b]处理组的诱变频率(24×10－4)明显高于溶剂对照组(1.2×10－4)；试验进一步对61个突变子中的24个突变子质粒靶基因进行序列分析，发现[b]喹[/b][b]乙醇[/b]引起质粒靶基因核苷酸序列改变主要表现为点突变和连续缺失，且以引发点突变为主，占总数的70％。点突变主要集中在G:C碱基对，且包含在5'-NNTTNN-3'的序列中，其中的N位易发生突变，主要表现为G:C-T:A或G:C-A:T置换；而缺失以连续缺失为主，包含在含ANGGCCNAAA的序列中。结论： [b]喹[/b][b]乙醇[/b]能诱发质粒pSP189靶基因突变。[/p][p=30, 2, left]　　【关键词】穿梭质粒； Vero细胞；突变； [b]喹[/b][b]乙醇[/b][/p][p=30, 2, left]　　中文分类号： S816.2;R394.6　　　　文献标识码： A　　　　文章编号： 1004－616X(2006)01－0023－03[/p][p=30, 2, left]
[/p][p=30, 2, left]　　【ABSTRACT】 BACKGROUND ＆ AIM: Using a new SV40-based shuttle vector pSP189 and African green monkey kidney cells(Vero E6 cell line)，we constituted a shuttle vector /mammalian cell system to detect mutagenesis in vitro induced by olaquindox. MATERIAL AND METHODS: The vector plasmids were trealed by olaquindox , then transfected into Vero cells. After recovery from cells, the plasmids were transformed into MBM7070 and mutant colonies were selected. The mutation in 24 mutants was determined by dideoxy sequence analysis. RESULTS: The lesion induced by 6.6μg·ml－1 olaqiunxox included a large number of base substitutions, in addition to tandem base deletion. Point mutation frequencies of modified plasmids in vitro were dramatically increased to 70％ the spontaneous background level,and base substitutions concentrated on the G:C base pair, the predominant mutation was G:C-T:A or G:C-A:T. Olaqiundox-induced mutations on the SupF shuttle vector was not distributed randomly, they had mutation hot spots (155bp) and sequence specificity, which were contained in the sequence 5＇-NNTTNN-3＇. Mutation was common in N site,tandem base deletion or rearrangement focused on ANGGCCNAAA sequence. CONCLUSION: Olaquindox could induce plasmid shuttle vector mutagenesis.[/p][p=30, 2, left]　　【KEY WORDS】 shuttle vector; olaquindox; mutagenesis; Vero cells[/p][p=30, 2, left]　　穿梭质粒带有对突变敏感的靶基因，将诱变剂处理的质粒转染哺乳动物细胞或先转染细胞后经诱变剂处理，在细胞内修复和复制后，回收质粒转化宿主菌，在一定条件下筛选突变子，并进一步对突变子靶基因测序以分析突变的位点、类型、序列特异性等信息，从而研究诱变剂的诱变机制。由于诱变是在哺乳动物细胞内发生的，因而能够较真实的反映高等动物的诱变机制；且诱变的发生通过宿主菌显色反应来显示，其任一位置发生的单碱基置换都能从表型改变表现出来；进一步对突变子靶基因进行序列分析，使表型的改变在DNA分子水平上得到证明，敏感性极高[1]。因此穿梭质粒被广泛应用于各种诱变剂的诱变性研究[2～4]。[/p][p=30, 2, left]　　[b]喹[/b][b]乙醇[/b]由于其优良的[b]抗菌[/b][b]促[/b][b]生长[/b][b]作用[/b]，在我国被广泛应用于猪和鱼类的饲料添加剂中。[b]喹[/b]　啉类药物分子结构有很大的相似性，均为[b]喹[/b]叨嗪的衍生物，[b]喹[/b]叨嗪由于其遗传毒性被禁用 [5]，由此引发人们对这类药物遗传毒性的研究[6，7]。试验证明卡巴氧和[b]喹[/b][b]乙醇[/b]在啮齿类动物表现出基因毒性和致癌性[8，9]；研究还发现[b]喹[/b][b]乙醇[/b]引发饲养场工人发生过敏和光敏感性皮炎[10]。鉴于上述原因，欧盟委员会认为[b]喹[/b][b]乙醇[/b]和卡巴氧的休药期不能确定，其对人体健康存在可能的不良[b]作用[/b]，于1999年1月1日正式撤消[b]喹[/b][b]乙醇[/b]和卡巴氧用作[b]促[/b][b]生长[/b]添加剂[11]。而[b]喹[/b][b]乙醇[/b]在我国仍然作为[b]抗菌[/b][b]促[/b][b]生长[/b]添加剂被广泛使用，我们用穿梭质粒pSP189/哺乳动物Vero细胞系统研究[b]喹[/b][b]乙醇[/b]的诱变性，探讨[b]喹[/b][b]乙醇[/b]对质粒靶基因SupF上[b]作用[/b]的位点、诱变类型及序列特性。[/p][p=30, 2, left]
[/p][p=30, 2, left]　　1　材料与方法[/p][p=30, 2, left]　　1.1　细胞、质粒及其宿主菌　穿梭质粒pSP189及其宿主菌E.Coli MBM7070由美国NIH9900医学中心Seidman教授赠送。Vero细胞由浙江省医学科学院病毒病研究所柴少爱副所长惠赠，在含1×105 U/L青霉素、100 mg/L链霉素、10 ％小牛血清的DMEM培养基中常规培养。[/p][p=30, 2, left]　　1.2　试剂[b]　[/b][b]喹乙[/b]醇(含量：99 ％)：中国兽医药品监察所；转染试剂盒Lipofectamine2000、DpnⅠ内切酶promega公司产品；X-gal(5-溴-4-氯-3-吲哚-β-D-半乳糖苷)、IPTG(异丙基-β-D-半乳糖苷)，Gibco公司产品；其它试剂均为国产和进口分析纯。[/p][p=30, 2, left]　　1.3　质粒染毒及转染　转染前一天接种5×105个细胞于25 cm2培养瓶中，用不含双抗的DMEM培养基常规培养使细胞密度达70 ％～90 ％；于细胞体外直接将[b]喹[/b][b]乙醇[/b]以6.6 μg/ml[12]的剂量在37 ℃[b]作用[/b]质粒60 min，形成质粒DNA-[b]喹[/b][b]乙醇[/b]加合物[13]，用高效转染试剂Lipofectamine2000进行转染，按说明书操作。转染细胞在含10％小牛血清的DMEM培养基中常规培养 48～72 h后收获质粒。[/p][p=30, 2, left]　　1.4　质粒回收　从Vero细胞中回收质粒按Seidman提供的材料操作。[/p][p=30, 2, left]　　1.5　质粒转化筛选突变体　取2 μl回收的质粒用CaCl2法转化MBM7070指示菌，在含氨苄西林(100 mg/L)、X-gal(2 ％)和IPTG(20 ％)的LB固体培养基上筛选突变体。蓝色菌落为野生型，白色菌落为突变型，用双脱氧链法对突变子质粒靶基因进行序列分析。[/p][p=30, 2, left]
[/p][p=30, 2, left]　　2　结　果[/p][p=30, 2, left]　　2.1　[b]喹[/b][b]乙醇[/b]诱发质粒靶基因突变频率分析　质粒从Vero细胞中回收后，转化指示菌在含Amp、X-gal、IPTG的LB固体培养基上培养所得转化子、突变子数以及突变频率结果见表1。结果表明溶剂对照组获得的约8496个转化子中有1个白色的突变子，自发突变频率为1.2×10－4，而[b]喹[/b][b]乙醇[/b]诱发突变频率为24×10－4，高出溶剂对照近22倍，突变检出明显。[/p][p=30, 2, left]
[/p][p=30, 2, left]　　2.2　[b]喹[/b][b]乙醇[/b]诱发质粒靶基因突变序列测定结果[/p][p=30, 2, left]　　2.2.1　突变谱[b]　[/b][b]喹乙[/b]醇诱发的61个突变子中所测24个突变子质粒靶基因SupF tRNA核苷酸序列测定结果见图1，图中结果显示[b]喹[/b][b]乙醇[/b]诱发质粒靶基因发生点突变、缺失和重组。[/p][p=30, 2, left]　　2.2.2　突变类型、突变位点及突变次数[b]　[/b][b]喹乙[/b]醇诱发的质粒靶基因突变类型、突变位点、突变次数结果见表2。表中结果显示[b]喹[/b][b]乙醇[/b]引起质粒靶基因发生点突变、碱基插入、碱基缺失和重组；以诱发点突变为主，点突变集中于155、111和128位点；而缺失发生于108～145 bp，这段序列也可发生碱基重组；172位点发生两次单碱基插入。[/p][p=30, 2, left]2.2.3　突变的序列特异性　对点突变和缺失及重组的位点进行序列分析，见表3，发现其中3个点突变位点(105、155、164)均包含在 5'-NNTTNN-3'(N为G或C)序列中，而突变发生在N位，由此可见-NNTTNN-序列的N位易发生点突变；而缺失和重组主要发生在含有ANGGCCNAAA的序列中，因此ANGGCCNAAA序列易引起缺失和重组。由此可见[b]喹[/b][b]乙醇[/b]诱发质粒靶基因核苷酸序列改变并非随机而是存在一定的序列特异性。[/p][p=30, 2, left]
[/p][p=30, 2, left]　　3　讨　论[/p][p=30, 2, left]　　我们的试验结果表明[b]喹[/b][b]乙醇[/b]主要引起质粒DNA序列发生缺失和点突变，且突变在靶基因SupF tRNA上的分布是存在着一定的序列特异性。[/p][p=30, 2, left]　　我们试验结果表明[b]喹[/b][b]乙醇[/b]诱发质粒靶基因突变，即[b]喹[/b][b]乙醇[/b]有致基因突变的[b]作用[/b]，与Ames实验[8]、体外诱变哺乳动物细胞实验[14]、哺乳动物体内诱变实验[6，7]等结果一致；而本试验首次在质粒DNA一级结构上具体论证了[b]喹[/b][b]乙醇[/b]诱发突变发生的位点、类型、热点以及序列特异性信息，从分子水平上阐明了[b]喹[/b][b]乙醇[/b]诱发突变的特征，为[b]喹[/b][b]乙醇[/b]的致突变性提供新的理论依据。[/p][p=30, 2, left]　　质粒和细胞可以用诱变剂分别处理，既可以分析诱变剂引起质粒DNA的直接损伤，即定标性突变(Targeted-Mutation)；也可分析诱变剂引起宿主细胞内环境改变从而造成质粒DNA分子的间接损伤，即非定标性突变(Non-targeted-Mutation)。本试验只对[b]喹[/b][b]乙醇[/b]引发质粒DNA的定标性突变进行了研究，如果结合其引发的非定标性突变，并比较两者引起质粒DNA一级结构改变的差异，同时测定[b]喹[/b][b]乙醇[/b]引起质粒靶基因核苷酸序列改变是否有剂量-反应关系，则对[b]喹[/b][b]乙醇[/b]在哺乳动物细胞突变机制的研究就更为全面，这有待进一步研究。[/p][p=30, 2, left]　　总之，目前所用的穿梭质粒系统都是检测质粒靶基因DNA的突变结果。而化学致突物干扰细胞DNA复制和修复或直接结合在DNA上造成的损伤还不能被检测，如果能从这一层面研究诱变物的突变[b]机理[/b]，则研究结果将更具体和深入。[/p]

lijiepascal · 发表于 2010-4-17 10:35:21

喹乙醇能诱发质粒pSP189靶基因突变
本文是从分子机理来探讨其毒害机理。
这是什么意思呢，能不能转化为大家很能理解的语言进行表述呢？
他的意义是什么呢？是不是为了以后想扩大喹乙醇使用进行理论基础
很是关注

wht680926 · 发表于 2010-4-17 10:40:50

喹乙醇的毒性很大，坚决避免其在饲料中的添加

yangj · 发表于 2010-4-17 13:19:55

喹乙醇只限制使用在35kg以下的仔猪中，水产及禽料中禁用

songziyunyao · 发表于 2010-5-16 09:31:05

抗生素安全性中有要求：有无三致即致畸、致癌、致基因突变。本文就是对喹乙醇在致基因突变方面的分子级别的研究，非常好，建议好好研究和学习一下。

xingge12345 · 发表于 2010-5-28 17:00:00

喹乙醇只限制使用在35kg以下的仔猪中，水产及禽料中禁用

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