谷氨酰胺对动物肠道抗氧化能力的影响

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　　肠道是动物重要的吸收消化器官,对生长性能和机体健康起着十分重要的作用。由于肠道不断的暴露于各种外源物质中,因此也极容易产生各种应激反应,损害肠道的正常生理功能。自从Windmueller做了一系列关于非必需氨基酸在小肠中的重要代谢作用研究后，谷氨酰胺(Glutamine,Gln)对肠粘膜功能的重要支持作用被广泛接受。谷氨酰胺在动物体内含量非常丰富,约占总游离氨基酸的25%,是机体合成氨基酸、蛋白质、核酸和多种生物活性物质的前体。在成鼠、仔猪中,有20%~30%的循环Gln是被小肠摄取的。Gln被认为是快速生长的肠细胞中最重要的能量来源。在各种应激条件下Gln能提高肠道抵抗应激的能力,维持肠道的正常结构和功能。而近来年研究发现,Gln对肠道的保护作用与其对肠道抗氧化能力的影响有关。
　　1 机体的氧化和抗氧化系统
　　在机体中，氧化剂和抗氧化剂之间的平衡是严格调节的，因为这种平衡对维持生物大分子和细胞的功能十分重要。对平衡的任何干扰都会引起对细胞和组织的毒害。当氧化剂的增加超过了抗氧化剂的清除能力时就被定义为氧化应激，导致氧化损伤。通常氧化剂是指活性氧簇（ROS）,它可分为自由基和非自由基。自由基都至少含有一对未成对电子，这对未成对电子易于得到或失去电子以维持稳定性，因此自由基的活性十分高。非自由基包括了许多物质，其中的一些活性非常高，但从定义上来说却不是自由基。ROS的来源包括外源性的和内源性的。外源的包括辐射、空气污染物、药物、食品。虽然外源产生的ROS很高，但是内源来源的更重要，因为它能在机体的细胞生命周期中不断产生。线粒体ATP的产生过程中，氧气接受4个电子被还原成水。在这个过程中可形成一些主要的氧衍生物，ROS可从线粒体中泄漏到细胞内环境中。酶组成了内源ROS的另一个来源，ROS是大多数酶的副产物，如黄嘌呤氧化酶能产生超氧阴离子，还有一些酶的主要功能就是产生ROS，如产生NO的一氧化氮合酶。ROS的不断流出引起细胞成分的连续性和积累性的氧化损伤，从而改变细胞功能。
由于不停的暴露在氧化应激中，促使细胞和整个机体形成了一套抗氧化的防御机制。在不同的防御机制中，抗氧化剂尤其重要，因为它能直接清除氧化剂。抗氧化系统主要包括2种类型：抗氧化酶和小分子抗氧化剂。抗氧化酶主要是超氧化物歧化酶（SOD）、过氧化氢酶（CAT）和谷胱甘肽过氧化物酶（GPx）。小分子抗氧剂主要有谷胱甘肽（GSH）、维生素E、维生素C、类胡萝卜素等。
　　2 Gln对肠道抗氧化能力的影响
　　2．1 Gln对应激时肠道结构和功能的保护作用
　　肠粘膜的正常结构与功能是营养物质充分消化与吸收的基本保证，因此维持小肠结构与功能是提高养分消化利用和促进动物生长的重要营养生理基础。应激对动物肠粘膜形态有很大影响，表现为小肠粘膜绒毛高度下降、隐窝加深、肠绒毛成熟细胞数量减少等。辐射损伤的大鼠绒毛细胞的数量只有3.6个/mm，绒毛高度为0.150 mm， 用Gln预处理后，细胞数量增加到7.9个/mm，绒毛的高度也提高到0.398 mm。郑善军（2007）用扫描电镜观察Gln对辐射损伤的大鼠肠粘膜的保护作用，结果表明辐射组绒毛杂乱、窄小，排列无规律，绒毛顶端有明显溃烂，发生溃疡的绒毛数目较多，而补充Gln组动物肠粘膜绒毛宽大、钝圆， 接近正常对照组的形态,排列整齐, 绒毛顶端形成细小溃疡，但溃疡发生不普遍。
Gln还可以保护肠道正常的吸收和消化功能。Gln可以恢复小肠缺血再灌注(I/R)损伤的人肠上皮细胞的Gln、Glu和Leu转运受阻。Alteheld(2005)用过氧化氢诱导Caco-2细胞产生氧化应激后,细胞中PepT1载体介导的二肽转运被抑制。用Gln二肽处理后可显著增加二肽的转运。Gln还能抑制由手术氧化应激引起的离体肠刷状缘的葡萄糖转运降低。可见Gln恢复了肠道氧化应激引起的营养物质的转运受阻。肠道的消化功能可由肠细胞分泌的消化酶活力来反映。目前关于Gln对肠道消化功能的保护作用仅有少量研究。张军民(2001)报道,在日粮中添加Gln后,断奶仔猪35日龄十二指肠中亮氨酸氨基肽酶的活性是对照组的1.5倍。杨彩梅(2006)报道仔猪断奶后7 d,Gln组和Gly-Gln组蔗糖酶活性分别比对照组提高54.90%和60.41%，麦芽糖酶活性比对照组提高45.87%和38.60%。
　　2.2 Gln能抑制肠细胞的死亡
　　氧化应激能使肠细胞生长抑制或死亡，Gln能抑制小肠粘膜细胞的死亡。Wischmeyer(1997)用氯乙烷诱导了大鼠肠上皮细胞的氧化应激，当Gln浓度大于4 mmol/l时能显著降低氯乙烷引起的细胞死亡。方天翔（2003）试验结果表明，输注Gln后使缺血再灌注的小肠绒毛和隐窝细胞的凋亡数量显著降低。Evans（2003）的研究表明，Gln能剂量依赖的抑制大鼠结肠上皮细胞凋亡；并且Gln抑制细胞凋亡的作用是特异性的，Glu或Cys、Gly都没有这个作用。凋亡是细胞主动参与自身死亡的过程。细胞凋亡的途径主要有两条，一条途径是通过细胞外死亡受体激活细胞内的凋亡酶半胱氨酸特异性蛋白酶(caspase-8)；另一条途径是通过改变线粒体外膜通透性使多种促细胞凋亡因子从线粒体内外膜间隙释放到胞质，从而激活caspase-9。两条通路最终都通过激活caspase-3(共同通路)进入细胞凋亡的执行阶段，引起细胞凋亡。经研究发现，Gln可增强小肠粘膜细胞中Bcl-2的表达，说明Bcl-2参与Gln抑制肠粘膜细胞凋亡的保护机制。Bcl-2可抑制小肠上皮细胞凋亡。在细胞凋亡诱导期，线粒体释放细胞色素c，促使Apaf-1激活caspase-9, Bcl-2则抑制细胞色素c的释放，阻碍Apaf-1 与效应分子的结合, 阻断凋亡的联级反应。Gln除了可以影响线粒体凋亡通路外，还可以直接影响caspase-3的活性。Erbil（2005）给辐射损伤的大鼠饲喂Gln后,小肠中caspase-3的活性降低了约60%。Gln还完全抑制了大鼠结肠上皮细胞caspase-3活性的增加。当Gln的代谢关键酶谷氨酰胺酶的表达被抑制后,caspase-3的活性是正常细胞的1.5倍。以上结果均表明Gln可抑制caspase-3的活性,从而减少肠细胞凋亡。
　　2.3 Gln对生物大分子损伤的保护作用
　　在分子水平上，ROS主要引起脂质、蛋白质和DNA的氧化损伤。MDA是脂质过氧化的终产物，测定其含量能直接反映细胞膜被氧化的程度，因此常用它来衡量细胞氧化应激的损伤程度。大鼠回肠缺血再灌注4 h后MDA的浓度为743.84 nmol/g，而Gln能使MDA的浓度降至354.55 nmol/g。戴定威（1999）研究了Gln对缺氧复氧损伤的人小肠细胞MDA含量的影响表明，预先应用Gln处理组MDA水平显著低于缺氧复氧组。Gln还能显著降低放射性损伤、手术、抗炎药引起的大鼠肠组织氧化应激时MDA浓度的增高。Gln还可以保护蛋白质免受氧化损伤。蛋白质羰基由蛋白质侧链氨基酸残基氧化后产生，通过测定羰基含量可判断蛋白质是否被氧化损伤。研究发现在大鼠的肠组织匀浆、刷状缘膜、线粒体中Gln能降低氧化应激诱导的蛋白羰基含量的增加。
　　3 Gln提高肠道抗氧化能力的可能作用方式
　　3.1 Gln对 GSH合成的影响
　　Gln对机体的抗氧化能力的增强可能与其能参与谷胱甘肽(GSH)的合成，增加GSH的含量有关。GSH是含量最多的低分子巯基化合物（0.5~10 mmol/l），为一种重要的低分子抗氧化剂。GSH在抗氧化应激中的主要作用有：①GSH是多种抗氧化酶，如GPx、谷胱甘肽转移酶的辅酶，参与其酶促反应；②GSH直接清除羟自由基和单线态氧，防止ROS对机体产生的氧化损伤；③GSH可参与氨基酸的转运；④GSH能使维生素C和维生素E转变为活性形式。大量研究表明，Gln在正常的生理条件或应激时都可以维持肠道内正常的GSH水平，从而在氧化应激时保护细胞的正常结构和功能。此外，Gln还可以提高肝脏、胰腺、胰腺β细胞、肺细胞、单核细胞等组织和细胞中的GSH含量。可见，Gln能广泛地提高机体组织中GSH的含量。Gln可通过谷氨酰胺酶分解成谷氨酸(Glu)，谷氨酸作为GSH的组成氨基酸，提高了GSH的合成。生理pH值条件下Gln是电中性的，谷氨酸则带负电荷，因此与Gln相比，Glu更难转运入细胞内，所以细胞内合成GSH的谷氨酸主要来自Gln。Gln分解产生的Glu除了作为原料合成GSH外，还可以通过阻止GSH对Y－谷氨酰半胱胺合酶的抑制对GSH合成起调节作用。Y－谷氨酰半胱胺合酶是GSH合成的限速酶，GSH能够反馈抑制Y－谷氨酰半胱胺合酶的活性。Glu可以和GSH竞争结合Y－谷氨酰半胱胺合酶，从而减弱了GSH对Y－谷氨酰半胱胺合酶的抑制作用。当细胞内的Glu浓度异常高时GSH合成会增强。
　　3.2 Gln对其它抗氧化剂的影响
　　在抗氧化防御体系中，各种抗氧化酶从不同角度协助清除体内的ROS，在抗氧化过程中起着不同的作用。SOD可加速超氧阴离子（O2-）发生歧化作用，清除O2-，防止O2-对机体产生的损伤作用。GPx可利用GSH作为底物，还原H2O2和催化几乎所有的有机氢过氧化物（ROOH）转变为ROH，减轻对机体的损伤。CAT主要还原H2O2。现有的研究表明Gln对SOD和GPx的活性有影响。Basivireddy（2004）给大鼠饲喂抗炎药物后，其组织匀浆的SOD、GPx活性显著降低，补充Gln后增强了这些酶的活性。Fillmann（2007）用乙酸诱导大鼠结肠炎后，结肠中的GPx活性与正常组相比降低了21%，预饲喂Gln后，GPx的活性恢复到了正常值。断奶仔猪日粮中添加0.125%和0.25% Gln二肽后，随添加水平提高，断奶后第10 d和第21 d血清GPx活性分别以线性或二次曲线方式升高，第10 d和第21 d血清SOD活性均以线性方式升高。高温下日粮中添加0.5%和0.8% Gln可显著提高黄羽肉鸡的血液GPx活力，对血液SOD活力无显著影响。
Yeh(2003)给烧伤的大鼠饲喂Gln后，发现肝中的GPx和肾中的SOD 活性显著降低。张军民(2002)在日粮中添加1.2%谷氨酰胺后，仔猪35日龄时肝脏和49日龄脾脏中SOD活性均极显著低于未添加组，他推测在机体的抗氧化系统内可能存在着动态平衡机制，即作为抗氧化系统的抗氧化剂在某种状况下并非同时增加，而是一种机制激活时，而另一种可能处于被抑制状态。
从以上的研究中可看出Gln对抗氧化酶活性的研究存在许多不一致的报道，关于Gln对抗氧化酶的影响方式及机制还不清楚，有待进一步研究。
　　3.3 Gln对热休克蛋白表达的影响
　　Gln能诱导热休克蛋白的产生。热休克蛋白(HSP)又称为应激蛋白，是生物细胞（包括原核细胞及真核细胞）在受热、生物因素、理化因素等应激原刺激后，发生热休克反应时所产生的一类在生物进化中最保守并由热休克基因所编码的伴随细胞蛋白。HSP可以增强细胞对氧化损害的耐受程度，维持细胞的正常功能，提高细胞的生存率。Gln主要诱导HSP72和HSP25的表达。Wischmeyer（1997）对肠上皮细胞IEC-18的研究证实，Gln在热应激、氧化应激及无应激的条件下都能增强HSP70的表达，且呈剂量效应，2～4 mmol/l的Gln就能诱导HSP70的表达，当Gln的浓度为10～15 mmol/l时,HSP70的表达量达到最大值。其它的研究者也报道了相似的研究结果。体内研究也发现，Gln能增强LPS感染的小鼠心脏、肺、结肠和肾中HSP72和HSP25的表达。Gln可能增强了热休克因子1(HSF-1)的表达,促进HSF-1移位到细胞核中,与HSP基因上的热休克反应元件结合,从而诱导了HSP的mRNA转录。
　　3.4 Gln对NO产生的影响
　　一氧化氮是含有一个未配对电子的小分子,因此它属于自由基。NO是L-精氨酸氧化产生的。催化这个反应的酶是一氧化氮合酶（NOS),在生理条件下，NO和超氧阴离子反应生成过氧亚硝基盐(ONOO-)。ONOO－是一种强力氧化剂，能消耗巯基,氧化许多分子,引起的损伤类似于羟自由基。它还能引起DNA断裂,蛋白氧化和蛋白质芳香族氨基酸的硝化。因此,NO也能对细胞造成氧化损伤。Suha(2003)研究表明小肠缺血再灌注损伤大鼠血浆中NO的浓度为50.55 μmol/l，而Gln组的NO浓度为33.19 μmol/l，进一步研究发现再灌注4 h和8 h后，Gln组iNOS基因的表达都要显著低于I/R组。 Fillmann（2007）在大鼠的结肠炎模型中发现，诱导性一氧化氮合酶（iNOS）的蛋白含量是正常大鼠的245%，用Gln预饲喂后，iNOS的蛋白含量显著降低，只有正常组的87%。对大鼠实施心肺分流术后，静脉注射Gln后，其心脏、肺脏、肝脏中的iNOS 蛋白含量显著降低。Gln对iNOS表达的抑制作用可能与其对核因子-κB（NF-κB）的影响有关。iNOS基因的表达受NF-κB 的调控。Gln阻止了NF-κB 抑制蛋白（IκB）激酶表达上调，从而减少了IκB的蛋白水解，降低了NF-κB的p65亚基在细胞核中的表达，阻止NF-κB的活化，从而抑制了iNOS基因的表达。
　　4 结语
　　随着研究的不断深入，谷氨酰胺在动物营养中的作用已远远超出了传统的非必需氨基酸的范畴。大量研究结果证明，当动物处于应激或病理状态时，谷氨酰胺维持了肠道的结构和功能，减少了氧化应激导致的细胞死亡和生物大分子的损伤，其机制之一可能是Gln增强了机体抗氧化系统的清除能力，或是直接抑制了自由基的产生。随着养殖生产集约化程度的不断提高，动物抵抗应激的能力变得越来越重要，因此，充分了解谷氨酰胺在动物抗应激中的重要作用，对生产具有重要的指导意义。

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介绍的很全面