通过育种技术有可能降低PCVAD的发病率

朱春明

　　通过对65日龄体重、猪圆环病毒（PCV2）病毒血症以及抗体滴度等性状进行选育，可能降低猪圆环病毒相关疾病（PCVAD）的发病率，这是Jared S. Bates及其同事得出的结论。他们的试验已在2009年《内布拉斯加养猪报告》上发表。


摘要

科研人员对内布拉斯加窝产仔数选育品系当中的3,440头猪进行了试验，研究了遗传和环境对猪圆环病毒相关疾病（PCVAD）的发病率和猪对圆环2型病毒（PCV2）的免疫反应的影响，以及这些因素与体重之间的关系。

　　分别于出生、断奶、65日龄和180日龄对试验猪进行称重，并于70至180日龄之间每隔10天对试验猪的PCVAD症状进行评分。为了验证评分的准确性，还对试验猪进行了剖检。采集了不同日龄活猪的血清样本，以及剖检猪的组织样本，针对PCV2病毒血症、PCV2抗体、猪繁殖呼吸综合征病毒、猪肺炎枝原体Mycoplasma hyopneumoniae以及胸膜肺炎放线杆菌Actinobacillus pleuropneumoniae进行了测定。经证实，b型PCV2是导致PCVAD的病原；研究涉及的其它病原与之无关。

　　无PCVAD症状的猪体重显著比患猪更高（出生、断奶、60日龄和180日龄时体重分别高0.22、1.12、6.6、46.0磅）。PCVAD评分的遗传力为16％± 4％。试验猪饲养的位置因素造成了PCVAD评分22％的变异。几乎所有的猪90日龄之前都没有出现病毒血症，但断奶和60日龄时许多猪出现了抗体。看来这些母源抗体在大约90日龄以内能够保护猪只免遭PCVAD侵害。90日龄病毒血症水平的遗传力高于125日龄（分别为38 ± 11％和11 ± 8％）。90日龄（h2 = 55 ± 21％）和125日龄（h2= 10 ± 8％）抗体滴度均存在遗传变异。
PCVAD的发病率与体重、PCV2病毒血症水平、PCV2抗体滴度相关，并且这种相关受遗传因素的影响。对PCVAD评分进行直接选育的效果预期会非常低（-0.89％每代），然而，如果采用育种指数，对65日龄体重、90日龄PCV2病毒血症水平和抗体滴度进行综合选育，则每代改进可达-8.0％，这比直接选育的效果要高998％。通过基因组选择降低PCVAD发病率是可行的。

介绍

猪圆环病毒相关疾病（PCVAD）是由猪圆环二型病毒（PCV2）导致的，这类疾病会给养猪生产带来很大的经济损失。内布拉斯加大学林肯试验猪群首先于2002年出现了PCVAD的症状。该猪场并非所有的猪都受到感染，而且发病率与猪的遗传品系、所处的位置以及季节因素有关。杂交猪的发病率非常低，但内布拉斯加大学（UNL）针对窝产仔数选育的品系当中感染个体明显更多。有的个体看来对这种病很敏感，而同栏的其它个体却仍然健康，无任何症状。

通常地，同一栏位当中只有一、两头猪发病，但有时某一窝猪会出现较高的发病率，即使分养在不同位置也是一样，这种现象也很常见。

　　这个现象说明，猪对PCV2病毒的免疫反应存在遗传变异。另一家科研机构对PCVAD的研究结果也支持这项假说，因为不同杂交方案生产的后代发病率也存在差异。然而，该项研究的样本量太小，无法确定PCVAD发病率以及PCV2病毒免疫反应的遗传变异（遗传力）。假如遗传变异足够大，那么就有可能通过选育来提高猪对PCV2病毒的抵抗力，降低PCVAD的发病率。如果在核心群当中进行这种选育，那么高抗病力的性状就可以沿着繁育金字塔传递到商品代猪群，这样就有可能降低对免疫接种的依赖。

　　本文作者于是开展了一项研究，对猪进行系统的PCVAD评分、称重并采集血样，建立数据库用于遗传分析。因为PCVAD的表现常受继发病原的影响，所以研究当中还对猪繁殖呼吸综合征病毒（PRRSV）、猪肺炎支原体Mycoplasma hyopneumoniae和胸膜肺炎放线杆菌Actinobacillus pleuropneumoniae等病原进行了测定，以便确定这些病原是否影响了PCVAD的表现。

　　试验猪来自第24至26代的UNL选育品系2系和45系，对照品系来自16系和61系，这些品系来自1979年形成的一个大白-长白杂交品种。2系和45系的选育方向为提高窝产仔数（1至20代）、提高增重速度和降低背膘厚（21至27代）。16系和61系为随机选择。各品系每代保持40至45窝的规模。2系和16系为7月和8月产仔（标记为同龄组1，CG1），45系和61系1月和2月产仔（CG2）。

饲养管理、PCVAD评分以及血清采样

分娩两天之内实行了寄养，既有品系内寄养也有品系间寄养。寄养无法做到对各个窝次完全一致。对窝产仔总数、窝产活仔数、产仔总数（n=3,440）、断奶体重（n=3,438），以及寄养后窝仔数和每头寄养母猪断奶仔猪数（NW）等数据进行了记录。

　　仔猪大约17日龄断奶，断奶后按日龄分群，每栏30头。在60至65日龄上，从2系和45系窝产仔数前15名当中每窝选出四头公猪，从前20名中每窝选出四至五头母猪，作为候选种猪。从16系和61系的每头种公猪的后裔当中随机选出两头公猪，每窝当中随机选出一至两头母猪，作为候选种猪。180日龄时进行最后选种。

　　所有候选种猪都养在六栋猪舍当中，每栋八个栏位，每栏10头，这些猪舍为封闭式，机械通风，标记为位置1。其余猪只分养在三个不同的位置。位置2有25个栏位，每栏10头猪，为封闭式猪舍，自然通风，靠窗上的温控卷帘调节通风量。位置3有23个栏位，每栏10头猪，为封闭式猪舍，采用自然通风，人工调节门窗控制通风量。位置4为舍外饲养场，安置了小型猪棚，猪棚中有秸秆垫料。每个饲养场50至60头猪。CG1的猪养在位置1、2、3；CG2的猪养在位置1、2、4。

　　首次观察到PCVAD症状是在2002年（21代）。经过此后几年的观察，研究人员决定收集数据进行遗传分析。在24、25和26代当中，对猪进行系统地称重、PCVAD评分并采集血样。转入肥育舍时对2,646头猪进行了65日龄称重（有些个体未称重），180日龄时又称重（n=3,115）。从转入肥育舍第七天开始，每隔7至10天针对PCVAD症状进行一次评分，直至180日龄称重为止，每头猪大约有10个评分。无症状的猪评分为0，轻微症状为1，明显症状为2。评分根据肌肉消瘦、生长受阻、被毛粗糙、腹泻以及呼吸困难程度进行。评分为1、2的个体被视为PCVAD阳性。

　　对25代CG2、26代CG1和CG2的所有个体都分别于60、90和125日龄采集了血样。25代CG2断奶时也采了血样，26代CG1断奶时对母猪也采了血样。对所有PCVAD评分为2的个体、同栏随机选择的一头0分个体、不同栏全同胞个体，以及同日龄组当中未出现PCVAD阳性的窝中随机选择的两头个体测量了PCV2病毒血症水平，该指标可以反映病毒在猪体内复制的能力。血清送交依阿华州Ames的依阿华州立大学兽医诊断实验室进行检测，在那里进行了PCV2 C-ELISA PCR试验和PCV2病毒定量（qPCR）试验，以便确定PCV2病毒血症以及抗体水平。

　　还针对猪肺炎支原体Mycoplasma hyopneumoniae（MH）、胸膜肺炎放线杆菌Actinobacillus pleuropneumoniae （APP）以及猪繁殖呼吸综合征病毒（PRRSV）等病原对血清子样本进行了ELISA（酶联免疫吸附试验）试验。来自25代CG2组90日龄（n=261）和125日龄（n=228）的样本检测了MH；125日龄25代CG2组（n=228）和26代CG1与CG2组（n=511）的样本检测了APP。UNL猪群当中无PRRSV。为了证实这一点，从24至26代当中随机抽取了52头猪检测了PRRSV。

　　从24代CG1（n=10）和CG2（n=11）、25代CG2（n=17）抽取了2分样本，并从25代CG2当中随机抽取了11头0分样本进行了剖检。剖检样本来自各个位置，而且均来自不同的窝。取这些猪的肺、颈淋巴结、肠系膜淋巴结、扁桃体、肾脏和回肠等组织，针对PCV2进行了免疫组化和RT-PCR试验。取五头猪的鼻腔涂样进行了RT-PCR试验；其中两头未发现PCVAD相关损伤。剖检和RT-PCR在内布拉斯加大学兽医与生物医学系兽医诊断中心进行。还通过ELISA试验对这些猪进行了PRRSV抗体检测。在剖检并确诊为PCVAD的个体中取三个血清样本送交依阿华州Ames的依阿华州立大学兽医诊断实验室，在那里进行了猪圆环二型病毒C-ELISA PCR试验，这是PCV2的定量试验，可对病毒基因进行定序，以便确定猪群中流行的PCV2病毒的特别碱基序列。

统计过程
　　数据分析采用了适合于遗传分析的统计过程。两个性状均为二项式分布，因为结果要么为是，要么为否，编码为0和1。一个性状是PCVAD评分（1=阳性，0=阴性），另一个性状为病毒血症（0=无病毒复制，1=发生病毒复制，病毒血症水平高于0）。对于存在病毒血症（编码为１）的个体，病毒血症水平（每毫升基因组数）用log10表示，以便对分布进行正态化。PCV2抗体滴度和体重均为正态分布。

　　表1给出了性状的描述以及记录数。表2给出了PCVAD评分、PCV2病毒血症和PCV2的联合分布。遗传分析采用的系谱文件当中有12,032头猪，其中包括了本研究用到的个体，及其上溯到第一代所有祖先个体当中有表型数据的个体。分析的性状包括PCVAD评分、出生重、断奶重、65日龄重、180日龄重、90日龄和125日龄病毒血症评分（编码0、1）、病毒血症评分阳性个体90日龄和125日龄病毒血症水平的log10，以及60、90和125日龄PCV2的抗体滴度。抗体滴度大于或等于.5者视为阳性，说明猪接触过病毒，滴度.2至.49为疑似范围，低于.2者视为阴性。
结果观察与固定效应

总体来看，14.4％的个体至少得到过一次阳性PCVAD评分，但不同代之间发病率差异很大（图 1）。阳性评分个体的死亡率为35.4％．不同品系间PCVAD发病率差异不显著。

图 1. PCVAD阳性评分百分比例

60日龄采集的血清样本当中，PCV2病毒血症结果几乎全部（94.6％）为阴性，因此未对60日龄的病毒血症数据进行分析。26代CG2组90日龄采集的血清样本病毒血症结果除2例为阴其余均为阳（表 2），因此该组数据也从分析当中剔除。断奶仔猪血清样本病毒血症结果除两例为阴性以外，其余均为阳性，但其母系77头母猪当中有37头为阳性。母猪和后裔的抗体平均滴度分别为1.07 ± 0.15和0.90 ± 0.16。

图 2示各同龄组60、90和125日龄时的PCV2抗体滴度。25代CG2和26代CG1的60和90日龄抗体滴度相似，26代最高。

图 2. PCV2抗体滴度均值

不同世代、同龄组和日龄之间病毒血症的出现频率差异很大（图 3）。在26代CG2，53.9％的个体90日龄时未出现病毒血症，但抗体滴度却高于0.5（表 2）。其它各组仅有5.9％的个体未出现病毒血症却表现高抗体滴度。26代CG2当中60.8％的个体未表现病毒血症，同时抗体滴度低于0.2，而其它各组当中这样的个体仅占10.2％的比例。

图 3. 90和125日龄病毒血症的比例

PCVAD的发病率雄性高于雌性，并且雄性60（0.03）和90日龄（0.05）的PCV2抗体滴度更高（P<0.05）。90日龄出现病毒血症的概率雌性低于雄性（-0.30, P<0.05）。

PCVAD评分为0的个体出生、断奶、65日龄和180日龄的体重（分别高0.22、1.12、6.6和46.0磅）均高于1分个体（P<0.0001）。并且0分个体90日龄（相差0.26±0.15）和125日龄（相差0.85±0.12）的病毒血症水平低于1分个体，抗体滴度高于1分个体（分别相差0.04±0.01和0.05±0.02）。

PCV2定序

进行PCV2 mRNA定序的三头猪结果均为PCV2b基因型阳性。其中一头猪的基因序列与国家生物技术信息库当中收录的先前检测过的一种病毒100％一致。另两头猪的结果未与数据库中的任何病毒基因序列完全相同。其中一个在116位点上存在一个单碱基变异（G变为A）；另一个在116（G变为A）和465（C变为G）位点上存在两个单碱基变异。试验结果证实，PCV2b确实是本猪群中PCVAD的致病病原，但该病毒发生了突变，造成核苷酸系列与先前检测到的病毒之间存在轻微变异。

剖检结果

38头PCVAD阳性个体当中，36头的组织样本也呈PCV2病毒阳性。其余两头组织样本呈阴性，但鼻腔涂样呈阳性。PCVAD阴性的11头猪组织检测结果均为阴性。PCVAD阳性猪表现出严重的消耗性体质、体重丧失、被毛粗糙、肠系膜淋巴结肿大，存在肺炎损伤，以及慢性大肠炎。观察到肠系膜淋巴结淋巴细胞减少，淋巴滤泡、脾小结和集合淋巴结当中出现巨细胞，以及淋巴细胞减少造成的胸腺萎缩。19头猪有猪肺炎支原体症状；18头猪有猪链球菌Streptococcus suis症状，4头有细胞内罗松菌Lawsonia intracellularis症状。

ELISA排查

所有试验血清的PRRSV和猪肺炎支原体结果均为阴性。25代CG2当中125日龄采集的228个血清样本当中有32个APP呈阳性。26代90日龄采集的513个血清样本中有21个APP呈阳性，16个滴度疑似，其余为阴性。APP阳性的八头猪和疑似的五头猪PCVAD评分为阳性。然而，142头PCVAD阳性的猪APP为阴性。这样的话，可以排除PRRSV和猪肺炎支原体作为继发病原的可能，而APP也不大可能作为继发病原影响PCVAD在本猪群当中的表现。

遗传与环境因素

PCVAD评分和体重方面遗传因素和环境因素变异占总变异的百分比参见表3，PCV2病毒血症和抗体滴度方面的变异参见表4。PCVAD评分的直接遗传力为16 ± 4％，这个指标可衡量猪的基因的相对重要性。体重方面，断奶体重的遗传力为16％，出生体重的遗传力为27％。母系的基因、母系遗传力对出生和180日龄体重具有重要影响。饲养位置构成了PCVAD评分的最大变异，而若干个环境因素则在体重变异当中占主要比重。对于病毒血症阳性的个体来说（病毒血症水平高于0），90日龄病毒血症水平的估计遗传力要高于125日龄（分别为38 ± 11％和11 ± 8％）。抗体滴度在125日龄存在遗传变异（h2 = 10 ± 8％），而当全部数据都投入分析的情况下90日龄抗体滴度则不存在遗传变异。然而，如果把26代CG2的数据剔除，那么90日龄PCV2抗体滴度的遗传变异就很高（h2=55 ± 21％）。90日龄和125日龄病毒血症评分的变异大部分是由位置以及猪舍造成的。而这方面的因素对病毒血症水平和抗体滴度变异的影响则相对较小。

对这些性状之间的遗传相关和残余相关进行了计算，但本文不做逐一陈述。重要的相关包括，PCVAD评分与90日龄病毒血症（rg = 0.75）与抗体水平（rg = -0.67）之间存在相当高的遗传相关，与65日龄体重之间存在中度相关（rg = -0.53）。而出生重和断奶重与病毒血症和抗体水平之间均不存在显著遗传相关。然而，断奶重与125日龄病毒血症之间存在高度遗传相关，180天体重与90和125日龄病毒血症之间存在高度遗传负相关，与90日龄抗体滴度之间存在正相关。90与125日龄抗体滴度之间存在遗传正相关（rg=0.59），90日龄病毒血症与抗体滴度之间存在负相关（rg=-0.51）。90与125日龄抗体滴度之间存在正相关（rg=0.59）。

尽管有些性状间存在显著环境相关，但都不是很强。最明显的是，PCVAD评分与65日龄内的体重之间存在环境相关（-0.47e=-0.38），90日龄病毒血症与体重之间存在负相关（-0.26 < re < -0.16）。

讨论

总结本次研究以及其它文献的成果，作者得出结论，PCVAD发病率和PCV2免疫反应指标方面存在遗传变异。PCVAD评分的遗传力为16％，90日龄病毒血症和抗体水平的遗传力分别为38％和55％。125日龄病毒血症和抗体水平的遗传变异较低，并不显著，这可能是因为90日龄至125日龄之间有PCVAD患猪死亡，造成记录减少，从而遗传变异在存活下来的猪当中变得不显著。

　　90日龄病毒血症和抗体水平以及65日龄体重与PCVAD评分之间存在相当高的遗传相关。因此，针对这些性状进行选育有可能能够有效降低PCVAD的发病率。对不同的选种策略计算了预期的选种效果。这些策略包括 1）直接选种 - 仅自从未表现过PCVAD症状的个体当中选留种猪，2）针对体重、病毒血症或抗体水平等性状进行单性状选种，以及 3）采用相关性状或PCVAD评分结合相关性状进行指数选种。

　　尽管PCVAD评分是可遗传的，但直接选种的效率相对较低，PCVAD发病率每代仅能降低0.8％。原因是，评分为0的个体比例高达85％，而这些个体都可以成为候选个体，选择率过低。其它性状呈连续分布，因此个体会在整个分布范围内变异。假如选留90日龄PCV2抗体滴度最高的10％的公猪和30％的母猪，那么就可以获得最高的单性状选种效果（1代的选种效果 = -6.5％）。如果采用65日龄体重、90日龄病毒血症和抗体滴度这三个指标建立选种指数，则可获得最佳的遗传效果（-8.0％）。如果这三个性状之外再加上PCVAD评分建立四性状指数，预期每代选种效果与前者相同。通过相关性状进行指数选种的效果比直接选种的效果好414％至998％。

　　剖检结果证实，在本群当中PCV2是PCVAD的主要致病病原。PCV2基因分析现实，病原多半是PCV2b。然而，至少有三种不同形式的基因存在，并且可能会更多。因此，PCV2b的基因组发生了突变，但这种突变会造成什么样的后果尚未可知。

　　本研究中，猪繁殖呼吸综合征病毒、猪肺炎支原体Mycoplasma hyopneumoniae和放线杆菌胸膜肺炎Actinobacillus pleuropneumoniae并非影响PCVAD病情的继发病原。其它研究发现，PCV2和格兰氏阴性细菌的混合感染会诱发PCV2病毒的复制。本次研究中并未针对这些病原进行诊断，但已知本群当中存在诸如大肠杆菌Escherichia coli、流感嗜血杆菌Haemophilus influenzae、格兰氏阴性细菌等病原，这种情况可能增加了PCVAD的发病风险。

　　90日龄PCV2病毒血症水平与PCVAD发病率之间存在强相关。26代CG2的PCVAD评分阳性率为3.9％，而这些猪90日龄表现病毒血症的比例只有1％。25代CG2和26代CG1的PCVAD发病率高于93％，二者病毒血症阳性比例分别为75％和93％。

　　PCVAD阳性猪在出生重、断奶重、65日龄体重和180日龄体重等方面均表现出差异，尽管有些体重测量的时间远早于PCVAD症状出现的时间。PCVAD评分与出生和断奶体重之间存在正遗传相关，但不显著。然而，环境相关为负相关，且显著，这说明表型的变异很大程度是由环境影响造成，这些环境影响会降低早期体重，增加PCVAD发病风险。

　　猪断奶时抗体滴度均值高，这多半是母源PCV2抗体造成的，因为这些猪均未表现病毒血症。断奶至60日龄之间抗体滴度下降，但60日龄病毒血症阴性的比例仍高达94.6％。60至90日龄期间抗体滴度继续下降，说明母源抗体正在消失。出生窝次的不同是造成60和90日龄抗体滴度变异的主要原因，这进一步证明母源抗体方面存在显著的变异。其它研究已经显示，母源PCV2抗体滴度高总的来说可针对PCV2病毒起到保护作用，反之则没有保护作用；然而，母源抗体并不能完全预防PCV2病毒感染。这样看来，在我们的这项研究当中，母源抗体至少在60日龄上起到了部分的保护作用。

意义

PCV2免疫反应是可遗传的。因此，有可能通过遗传选育来降低PCVAD发病率。尽管遗传进展是肯定的，但要想大幅降低发病率，需要若干代的选育才能实现，而且选育必须在核心群进行，然后沿繁育金字塔传递到商品猪群。因此，通过这种策略降低商品群的PCVAD发病率需要相当长的时间。

　　此外，只有在核心群存在PCV2病毒感染的情况下才有可能针对PCVAD评分、病毒血症和抗体水平进行选育，只有这样各性状的遗传变异才能体现出来。通过基因标记辅助进行基因组选育可能会更有效，因为一旦确定了与各个效果变量相对应的标记基因，那么就可以在无PCV2病毒的情况下对任猪群进行选种。

　　从长远来看，将PCV2抵抗力与PCVAD发病率降低相结合的基因组选育可能是最有效的育种方案。

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