离体消化法在筛选水产复合酶中的应用

djhnasa

摘 要
　　采用胰蛋白酶来模拟水产动物消化酶，在胰蛋白酶的基础上添加复合酶，以探讨在水产料中添加复合酶的效果。结果显示：复合酶A对鲤鱼料的消化率很低，仅为3.72%，胰蛋白酶的基础上添加复合酶A，鲤鱼料的干物质消化率从11.55%提高到25.46%；复合酶B对饲料样品的消化率为2.82%，在胰蛋白酶的基础上添加酶B，鲤鱼料的消化率并没有提高。这次表明在本实验条件下，以非淀粉多糖酶为主要酶类的复合酶A可有效破坏降解植物原料的细胞壁，促进消化酶对营养物质的消化，而复合酶B活性可能很低，对饲料消化率没有改善作用，根据本实验结果可以推测，对以植物原料为主的理科鱼类，复合酶A可能比复合酶B更合适。

关键词
　　离体消化法；水产复合酶；消化率

外源酶制剂可弥补内源酶分泌的不足，也可以提供某些动物体不能分泌的酶类，从而促进动物对饲料的消化消化利用，目前在畜禽料中已广泛应用。水产用酶制剂也日渐兴起，但问题突出，譬如多数水产复合酶制剂并非针对水产动物开发的，其酶的来源与酶活检测均以畜禽为参照等；实际上，畜禽和水产动物的消化生理差异显著，不能仅凭酶活测定结果或厂家宣传就在水产饲料中推广应用，而需对水产酶制剂在水产饲料中应用的可行性进行评估。养殖试验是最好的评估方法，但该方法费时费力，采用离体消化试验，将会节约大量的时间和精力。

本试验旨在于探讨离体消化法筛选水产酶制剂的可行性。采用模拟无胃鱼消化环境(温度、肠道pH值等)，采用一步消化法，用水产酶制剂消化鲤鱼料，测定其消化率，为酶制剂筛选提供参考。

1材料与方法

1.1 实验材料

1.1.1水产复合酶
本次试验选用两种水产酶制剂(酶A和酶B)，主要酶活见表1。

1.1.2胰蛋白酶
Trypsin 1：250酶活力：1000～1500U/mg(上海源聚生物科技有限公司)

1.1.3饲料来源
　　为市场购买某公司鲤鱼料，样品均通过105℃烘干处理，粉碎过80目筛保存备用。

表1
复合酶A和复合酶B主要酶酶活

酶A		酶B
有效成分种类	含量(U/g)	有效成分种类	含量(U/g)
果胶酶	55000	淀粉酶	20000
甘露聚糖酶	5000	蛋白酶	11000
中性蛋白酶	2800	果胶酶	900
纤维素酶	2500	纤维素酶	100
酸性蛋白酶	2200	脂肪酶	70
木聚糖酶	2000
Α-半乳糖苷酶	1400
Β-葡聚糖酶	1000
淀粉酶	380

1.1.4
试验器械及药品
10mL移液管、250mL带塞三角瓶、恒温水浴摇床、烘箱、凯氏定氮仪、冰箱和电子分析天平(感量0.00001g)、试验用样品粉碎机、金属筛(孔径80目)、电炉、消化炉、电热式恒温烘箱、干燥器、过滤装置、磁力搅拌器、离心机。

1.2 试验方法

1.2.1
磷酸缓冲溶液制备
精确称取分子量为358.0的磷酸氢二钠固体结晶115.992g和分子量为156.01的磷酸二氢钠11.8568g
于2000mL烧杯中，加入少许去离子水将其溶解，并定容至2000mL，最后用酸度计将pH值调至7.4，保存备用。

1.2.2
酶液制备
水产复合酶酶液制备：称取5g复合酶制剂于500mL 0.2M pH为7.4的磷酸缓冲溶液中，搅拌30min后静置沉淀并过滤，所得标准复合酶酶液为0.01g/mL，保存备用。

胰蛋白酶酶液制备:精确称取胰蛋白酶2.5g于100mL 0.2M pH为7.4的磷酸缓冲溶液中，所得标准胰蛋白酶酶液为0.025g/mL，保存备用。由于没有匀浆机和冷冻离心机，用胰蛋白酶模拟鱼肠道消化酶。

1.2.3
试验设计
本试验采用胰蛋白酶来替代水产动物消化酶，具体实验设计见表2。

1.2.4
离体消化步骤
A、精确称量饲料样品1g(精确到0.0001g)于250mL带塞三角瓶中，添加0.2mol/L pH7.4的磷酸缓冲液100mL ，并按试验设计添加酶液。

B、28±0.1℃水浴锅中保温进行酶水解12h，摇床以 100rpm 振摇进行酶解

C、将酶水解好的饲料样品过滤瓶(定量滤纸+称量瓶先在103℃下烘干1h，冷却器中冷却恒半小时重后称重记录)。将滤渣+定量滤纸+称量一起在103℃下烘干，恒重后称重并记录。

表2
试验设计

处理组	1（对照）	2	3	4	5	6
0.2M pH7.4磷酸缓冲溶液(mL)	120	110	100	110	100	110
样品消化添加量(g)	1.0000	1.0000	1.0000	1.0000	1.0000	1.0000
复合酶A(mL)	∕	10	10	∕	∕	∕
复合酶B(mL)	∕	∕	∕	10	10	∕
胰蛋白酶(mL)	∕	∕	10	∕	10	10

1.2.5数据处理
本试验结果数据处理均采用SPSS 11.0软件进行方差分析和多重比较。

2
结果与讨论

结果见表3。

从消化数据上看出，空白处理组的干物质离体消化率为31.48%,由于空白对照组无添加任何消化酶，可离体酶解实验的干物质消化率达到31.48%，再结合考虑饲料样品中水溶性物质应占的比例，出现这种原因的可能是所用饲料样品在称量的过程中发生吸湿现象，整体含水量偏大，所以造成实验结果数据整体偏大，但对处理组间的相对比较和分析无太大影响。

从表3可以看出，处理3样品饲料干物质离体消化率最大，显著大于处理1、处理2、处理4、处理5和处理组6(P＜0.05)；其次处理5和处理6干物质消化率显著大于处理1，其余各组之间无显著性差异(P＞0.05)。

表3
干物质离体消化率

处理号	酶制剂	样品消化前后失重（％）	消化率（％）
1	空白对照	31.48±1.22a	.00±.00 a
2	复合酶A	35.20±3.40a	3.72±4.61 ab
3	复合酶A+胰蛋白酶	56.94±4.64c	25.46±3.42 c
4	复合酶B	34.30±3.89a	2.82±5.11 ab
5	复合酶B+胰蛋白酶	42.65±1.34b	11.17±2.55 b
6	胰蛋白酶	43.03±1.65b	11.55±2.86 b

注：同一列内处理间标注字母全部不同表示达0.05的显著水平标准，无字母标识表示各组间无显著性差异。

由此可见，复合酶A对鲤鱼料的消化率很低，仅为3.72%，和对照组相比消化率没有得到显著性提高；但在胰蛋白酶的基础上添加复合酶A，鲤鱼料的干物质消化率从11.55%提高到25.46%。这一结果表明，以非淀粉多糖酶为主要酶类的复合酶A，由于其中的蛋白酶和淀粉酶等酶类含量较低，单独消化饲料时对饲料消化率没有明显改善作用，但由于其中的非淀粉多糖酶能有效的降解植物原料的细胞壁，协助消化酶对营养物质的消化，大大提高了消化酶对营养物质的消化。本试验条件是模拟无胃鱼的消化环境(温度、pH)，因此根据本实验结果可以推测，在无胃鱼的消化道中，复合酶A可以发挥较好的活性，能有效破坏降解植物原料的细胞壁，促进内源消化酶对营养物质的消化，从而提高饲料消化率。

表4
酶B酶活检测条件

酶种类	检测温度（℃）	检测pH
蛋白酶	37	3.0
淀粉酶	40	4.5
纤维素酶	40	4.5
脂肪酶	37	7.0
果胶酶	40	3.5

酶B对饲料样品的消化率只有2.82%，且在胰蛋白酶的基础上添加复合酶B，鲤鱼料的消化率也没有得到进一步提高。从表1可知，复合酶B中蛋白酶、淀粉酶等酶活很高，但为何对鲤鱼料的消化率很低呢？从表4可以看出,复合酶B酶活检测的温度都在37℃以上，除了脂肪酶外，其它几种酶的检测都是pH小于或等于4.5的条件下检测的，而本实验是温度是28℃，pH为7.4，因此造成复合酶B对鲤鱼料的消化率低的原因可能是在本实验条件下复合酶B活性低。这一试验结果可以推测在无胃鱼的消化道环境中，酶B的活性很低，不能发挥作用。

3
小结

本试验结果表明，对以植物原料为主的理科鱼类，酶A比酶B更合适。

djhnasa 于 2010-3-7 11:41 补充以下内容

补充：本人参与制定的对水产动物的离体消化筛选原料的方法，存在一定的原因，请专家提出

liyan123456

谢谢楼主，学习了