分析方法
使用HPLC测定甜菜糖浆和液体或晶体甜菜碱产品中甜菜碱和某些其他成分的含量
前言
本方法可以用来检测甜菜糖浆和液体或晶体甜菜碱产品中甜菜碱、某些糖和糖醇的含量。通过使用强阳离子交换柱（Na+,Ca2+或Pb2+形式〕的高效液相色谱（HPLC〕和折光率检测器（RI）可以达到目的。
结晶芬菜碱S6产品中含有相当数量的硬脂酸钙，在进行样品预处理的时候必须考虑到这点。
用来进行测定的HPLC系统必须有相应的维护程序，交换柱和管线必需定期清洗以保持系统状态的稳定。
设备和试剂
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HPLC系统
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等速泵，0.6毫升/分钟，如沃特斯公司的Waters 510
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自动进样器，如沃特斯公司的Waters 717+
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柱温为75℃（Na-柱）或85℃（Ca-柱或者Pb-柱〕的交换柱，如沃特斯公司的Waters CHM
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RI检测器，如沃特斯公司的Waters 410
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合成和数据处理系统，如沃特斯公司的WatersMillennium
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Na或Ca形式的保护柱，Pb柱用阴阳离子交换预备柱的形式保护。可以使用如Bio-Rad125-0508(Na),Bio-Rad 125-0128(Ca),Bio-Rad 脱灰分柱125-0118(Pb)
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有机滤器，如Guard-Pak TM BondakapC18.Waters,Ltd.
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机械滤器，如Upchurch ScientificOn-line frit A103x
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分析柱，Na+、Ca2+或者Pb2+形式的强阳离子交换柱，如Transgenomic Coregel 87N或者CHO 820 和Bio-Rad Aminex HPX-87P?
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洗液，超纯水（蒸馏，去离子，过0.2 um(微米)滤膜）适用于Pb柱，超纯水配制的0.001MNa2SO4溶液适用于Na柱，0.001M Ca(NO3)2适用于Ca柱
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0.2um(微米)滤膜,如Schleicher& Schuell ME 24
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分析天平,如MettlerPC 440和Metttler AE100
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抽气泵，如KNF MW63/4
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过滤系统，如Gelman
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水纯化装置，如Gelman Water-1→ultra pure water
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超声波清洗器，如Branson 5200
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0.2um的注射过滤器，如Gelman Nylon Acrodisc 13
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加热器
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冷却水恒温器(20±0.5℃)
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容量瓶,如100ml
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Na2SO4，如 Merck 6649
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Ca(NO3)2·4H2O，如Merck 1.02123
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甜菜碱标准物，如Fluka 14300（一水化合物）
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KCl，如Baker0509
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棉子糖，如Merck 73301（五水化合物）
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蔗糖，如Fluka 84099
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半乳糖，如Merck 41726
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肌醇，如Fluka 57570
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果糖，如Merck，104007
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甘油，如ICN Biomedicals 800687
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赤藓糖醇，如Acros 11782
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甘露醇，如 Fluka 63559
其他可能用到的物品。
操作程序
配制Na-柱冲洗液
称取0.710克无水硫酸钠放入5000ml容量瓶中，注入超纯水至容量瓶容量的一半左右。加入几滴1M NaOH溶液调整pH至9.0。混合均匀后加入超纯水至刻度。
配制Ca-柱冲洗液
称取1.18克硝酸钙（含四个结晶水）放入5000ml容量瓶中，注入超纯水至容量瓶刻度，然后混合均匀。
配制Pb-柱冲洗液
使用超纯水
如果需要的话，可以将配制好的冲洗液经0.2um的滤膜过滤（视水的质量状况而定）。将装有洗液的5000ml容量瓶用超声处理15分钟后，将其接入HPLC系统。洗液应该保持在60℃以防止产生气泡。
标准液
精确称取下述成分，然后在20℃条件下用蒸馏水稀释至100ml。将稀释好的样品经注射
过滤器（0.2um）过滤后收集到集样瓶中。如果使用无水甜菜碱，应该将其在140℃至少干燥24小时，然后储存在干燥器中（最多存放两周）。由于几乎很难将无水甜菜碱完全保持干燥,因此可以使用含有一个结晶水的甜菜碱作为标准品,但是要经常检测其含水量(使用KarlFisher法)。
样品溶液
如果可行的话用折射计测量样品中干物质的含量并将其转换为甜菜碱的干物质量(使用Brix/甜菜碱 干物质表)。或者使用 Karl Fisher干物质。准确称取大约1克（干物质 ）的样品溶于100ml容量瓶中，用超纯水定容至刻度。将样品稀释液通过注射过滤器（0.2um）
后收集到集样瓶中。
结晶样品：称取0.7g（使用分析天平）晶体至容量瓶中，用超纯水定容至100ml。将样品稀释液通过注射过滤器（0.2um）后收集到集样瓶中。
芬菜碱S6 样品必须充分混匀，因为其中的硬脂酸钙难溶于水。称取样品（0.7g，使用分析天平）至玻璃瓶当中，然后添加超纯水至100.0000g。用玻棒充分搅拌后倒入混合器中，混合大约1分钟使其充分作用。将充分混合后的样品溶液通过注射过滤器（0.2um）后收集到集样瓶中。
色谱分析
洗液：0.001MNa2SO4（Na-柱）或者0.001MCa(NO3)2（Ca-柱）溶于超纯水中，通过0.2um滤器。对于Pb-柱,直接使用超纯水。
柱温：75℃（Na-柱）或者85℃（Ca-或Pb-柱）。
流速：0.6ml/分钟（Na-和Ca-柱）或者0.6ml/分钟（Pb-柱）。
进样量：10ul（微升）。
时间：Na-柱,15分钟。如果样品很脏或者含有洗脱很慢的组分时，跑柱时间可以延长到30～40分钟以防止干扰下一次的测量。Ca-柱，35分钟，Pb-柱,50分钟。
使用外标法测量。根据测得的峰高，通过数据处理系统计算出结果。如果柱子的状态不佳并且波峰不尖的话，将根据波峰的面积而不是高度来计算。然而，大多数情况下，使用使用峰高计算更为合适。
单点校正时，使用两次标准样的平均值。当单点校正不能被接受的时候，可以使用其它的方法。特别是当分析很少量的样品时，可使用三点校正。如果三点校正是线性的并且通过零点，那么微量的样品也能很准确地测量出来。
应该使用已知组份的样品作为参比样，或者使用其它已经有校正曲线的样品作为参比样。对于Na-和Ca-柱，最好使用甜菜碱LQD样品。测定参比样的纯度时至少要有6个平行样品，最后取平均值。对于Pb-柱，使用甘油作为参比样。
请使用控制表来监测分析结果。在最初的6次运行时，测定结果的最大偏差不应该超过2倍标准差(2×std)。系统的误差也需要控制在一定的范围内，比如可以通过将标准液作为样品在最后的时候测试分析，允许的最大偏差为0.5%单位（即测定结果为100%±0.5%）。
处理样品（常规最佳处理方式）通常使用Na-柱。对于Na-／Ca-柱，单点校正时进样两次，取平均值。如果样品中甜菜碱含量较高，请使用甜菜碱标准样；如果认为样品中蔗糖含量较高，请使用蔗糖标准样。当标准样跑完柱子以后，立刻注入参比样并且确保结果在允许的误差范围内（使用控制表）。当分析6个样品后，要弃掉旧的标准曲线并重新制作（2×std，参比样，处理样品）。
结晶产品、芬菜碱LQD和甜菜糖浆通常也是适用于Na-柱分析。对于Na-／Ca-柱，单点校正时进样两次，取平均值。使用甜菜碱标准样或者含甜菜碱的标准样作为单一组分（0.7g/100ml）。当标准样跑完柱子以后，立刻注入参比样并且确保结果在允许的误差范围内（使用控制表）。分析2－3个样品并且每个样品进样两次。计算两次进样的平均值并报告。在弃用旧的标准曲线时，以标准液作为样品测试两次以检测系统的误差。然后重新开始（2×std，参比样，2次进样，以标准样为样品测两次）。如果两次进样的结果偏差小于0.5%个单位，参比样在检测范围内并且以标准样为样品的测定结果为理论值的100±0.5%，那么测定结果可以被接受。
结果
结果以%/自然重量或者%/干物质（用含水量校正）表示。
计算
结果由下面的公式计算得出
| | | %/dm
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| | | | %/nw
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| | | 样品中甜菜碱的含量，以%/dm或者%/nw来表示
| | | 集样器给出的浓度，以mg/ml为单位
| | | 样品重量，以毫克（mg）为单位
| | | 干物质
| | | 自然重量
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误差来源
如果管线的清洗不够充分、管线或柱子中粘有结块，那么在色谱中会出现未知峰或者当仅仅注入蒸馏水的时候也会在色谱中出现峰。请冲洗管线和柱子并且使柱子再生。
保留时间的少许变化是可以接受的，但是如果保留时间的变化太大的话，柱子的离子形式可能会改变。请清洗系统并且使柱子再生。
如果峰的形状在变化并且离散度变得很差的话，请更换柱子或者使柱子再生并且重新清洗系统。
可以通过注射0.2M NaOH 1～5次（20～50ul）的方法使柱子快速再生。
每次清洗完柱子以后请确保系统中没有空气，尽管做起来会比较困难。可以通过操作自动进样器的OQ测试来检测系统中是否有空气。
如果结果不可靠，请检查是否所有标准品和样品已经完全充分溶解稀释。标准液和样品溶液在定容以前先经过超声波处理也许是必要的。 | 
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发表于 2009-8-10 09:40:12
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