不同方法测定大豆脲酶活性的比较研究

胡文辉

杨奇慧   舒 璐   钟剑锋

摘  要

用滴定法和增值法测定了大豆粉在85℃和140℃下分别热处理0，45，90，135，180min的脲酶活性, 并用0.2%KOH溶解法测定大豆粉在不同热处理下的蛋白质溶解度。结果表明, 在85℃条件下，处理0-180min 大豆粉的脲酶活性和蛋白质溶解度随着时间的延长无明显变化，而在140℃下，大豆粉的脲酶活性和蛋白质溶解度随着处理时间的延长显著降低。通过测定结果的比较可见，同一样品用滴定法和增值法测得的脲酶活性在数值上不相等, 不能互用，但蛋白质溶解度更能反映大豆粉受热过度的程度。

关键词：大豆粉；脲酶活性；蛋白质溶解度； pH增值法；滴定法

众所周知，大豆含有较丰富的蛋白质、脂肪、碳水化合物等，是饲料生产中主要的植物蛋白源之一，具有较高营养价值[1]。然而，大豆中含有多种抗营养因子，如蛋白酶抑制因子、植物凝集素、胃肠胀气因子、抗维生素因子、抗原蛋白等[2]。由于这些抗营养因子在大豆产品中具有较高的生物活性，阻碍营养物质在动物体内的利用[3]，尤其是胰蛋白酶抑制因子的存在不仅会降低饲料营养成分的消化率和适口性，且影响动物对蛋白质的消化吸收，对动物生长发育也产生不良的影响。然而，胰蛋白酶抑制因子的测定较困难，且豆粕中脲酶活性与胰蛋白酶抑制因子活性呈正相关，所以通常通过测定脲酶活性来反映蛋白酶抑制因子的活性[4]。

脲酶活性定义为：在30±0.5 ℃和pH为7的条件下，每分钟每克大豆制品分解尿素后，所释放氨态氮的毫克数[5]。目前，脲酶活性的测定方法有滴定法(国标法)、pH增值法，快速测定法等[5，6]。

目前，对脲酶活性不同测定方法及结果间的差异性的研究较少[7-8]，本文拟对两种方法进行研究，以比较不同方法对测定结果的影响，为实际生产和理论研究提供数字依据和参考。

1材料和方法
1.1实验材料大豆粉：将生大豆粉碎，过60目标准筛。在85 ℃和140 ℃下分别处理0、45、90、135和180min冷却后装入封口袋保存备用。
1.2化学试剂

本实验所用试剂均为分析纯(AR)，实验用水为蒸馏水。

1.3测定方法
1.3.1pH增值法

实验原理：将研细的试样与尿素缓冲液混合，尿素在尿素酶作用下水解产生氨，使溶液pH 值改变，改变的程度与脲酶活性大小相关，因此可以用其与空白溶液的差值表示脲酶活性高低， 单位为△pH 值。

1.3.1.1主要溶液配制（1）磷酸缓冲液：将3.403 g磷酸氢二钾加入100 ml水中溶解；将4.335 g磷酸氢二钾溶于100 ml水中；将两种溶液混合，稀释至1000 ml。用弱酸或弱碱调至pH =7.0。
（2）尿素缓冲液：将15 g尿素加入500 ml上述磷酸缓冲液中。用弱酸或弱碱调至pH =7.0。
1.3.1.2操作方法取0.200 g试样，装入比色管中。加入10 ml尿素缓冲液，迅速盖上盖子，剧烈摇动。将比色管置于30±0.5 ℃的恒温水浴锅中，准确保持30 min。
另称取等量试样放入另一支比色管中，加入10 ml磷酸缓冲液，盖上盖子，将试样与缓冲液混合均匀，置于水浴锅中保持30 min，作为空白试验。
每隔5 min将水浴锅中比色管中的试样摇匀一次。
每个比色管保持30 min后，从水浴锅中取出，倒出上清液于小烧杯中。并在从水浴锅中取出恰好5 min时，用酸度计测出pH值。
1.3.1.3
计算公式UA= pH 1－pH 0
式中：UA——脲酶活性，△pH；
pH 1——样品使尿素分解后的样液pH值；
pH 0——空白样液的pH值.

1.3.2滴定法

原理：样品与中性尿素缓冲液混合，在( 30±0.5) ℃下保持30 min, 样品中脲酶催化尿素水解产生氨，用过量的盐酸中和氨，再用氢氧化钠标准溶液回滴到溶液pH 值为4.70。脲酶活性用每克样品在30±0.5 ℃下每分钟产生氨态氮的毫克数表示，单位为NH3 mg/ g·min。

1.3.2.1
溶液配制（1）尿素缓冲液：将8.95 g磷酸氢二钠和3.40 g磷酸二氢钠溶于水中，并稀释至1000 ml，再将30 g尿素溶于此磷酸缓冲液中。
（2）0.1 mol/L盐酸溶液：8.3 ml盐酸注入1000 ml水中。
（3）0.1 mol/L氢氧化钠溶液：称取4 g氢氧化钠溶于水中，并稀释至1000 ml。
1.3.2.2
操作方法（1）氢氧化钠标准溶液的标定
称取0.6 g于105~110 ℃烘至恒重的基准邻苯二甲酸氢钾，准确至0.0001 g，溶于50 ml水中，加2滴酚酞指示剂，用配制好的氢氧化钠标准溶液滴定至溶液呈粉红色。
同时做空白试验。
（2）UA的测定
称取0.2000 g试样，转入比色管中，加入10 ml尿素缓冲液，立即盖好盖子并剧烈摇动。置于30±0.5℃恒温水浴上准确保持30 min后立即加入10 ml 0.1 mol/L盐酸，迅速冷却到20℃，将比色管内容物全部转入烧杯，用水冲洗比色管2~3次，立即用标准氢氧化钠溶液滴定至pH＝4.7。
另取比色管做空白试验，加入10 ml尿素缓冲液，10 ml 0.1 mol/L盐酸。称取与上述试样量相当的试样，迅速加入比色管中，立即盖好比色管并剧烈摇动，在30±0.5℃恒温水浴上准确保持30 min，冷却到20℃，将比色管内容物全部转入烧杯，用水冲洗比色管2~3次，用标准氢氧化钠溶液滴定至pH＝4.7。
1.3.2.3
计算公式

U=14×c(V0 - V)/30×m

式中: U—— —每分钟每克大豆制品释放氮的毫克量表示的脲酶活性；

c —— —氢氧化钠标准溶液的摩尔浓度(mol/l) ；

V0 —— —空白试验消耗的标准氢氧化钠溶液体积(ml)；

V—— —测定试样消耗的标准氢氧化钠溶液体积(ml) ；

m—— —试样质量( g).

1.3.3蛋白质溶解度的测定

原理：氢氧化钾蛋白质溶解度可以反映大豆粕产品加热过度的情况，不同加热程度的大豆粕，氢氧化钾蛋白质溶解度不同。先测定大豆粕样品在规定的条件下，可溶于氢氧化钾溶液中的粗蛋白质含量，再测定同一大豆粕样品中总的粗蛋白质含量，计算出氢氧化钾蛋白质溶解度[9-11]。

1.3.3.1
操作方法称取样品1.5 g，置于250 ml烧杯中，用移液管移取75 ml
氢氧化钾溶液，用磁力搅拌器搅拌20 min，再将搅拌好的溶液转移至离心管中，以2700 r·pm
离心10 min，用移液管移取滤液15 ml,放入消化管中，用凯氏定氮法测定蛋白含量。
另称取0.3 g样品，按照凯氏半微量定氮法测定原料样品中的粗蛋白含量。
1.3.3.2
计算公式蛋白质溶解度＝15 ml上清液中粗蛋白质的质量(g)/ 0.3 g试样中粗蛋白质的质量(g)

2结果与分析
2.1  85℃下不同加工时间段大豆粉脲酶活性及蛋白质溶解度85℃下大豆粉脲酶活性及蛋白质溶解度结果见表1。由表可见， 85℃加热0-180min的条件下，大豆粉脲酶活性及蛋白质溶解度变化不明显。结果表明85℃下热处理对大豆蛋白破坏作用不明显，该温度大豆粉中的蛋白酶抑制剂的活性不足以破坏。滴定法和增值法测得的脲酶活性大小，在数值上差异较小。

表1
85℃下大豆粉脉酶活性及蛋白质溶解度

Tab.1 The result of urease activit and protein solubility of soybean meal under 85℃

加热时间 min	脲酶活性		蛋白质溶解度（%）
	pH增值法UA（△pH）	滴定法UA (NH3 mg/g·min)
0	2.30	2.47	82.11
45	2.22	2.43	81.05
90	2.16	2.40	80.07
135	2.08	2.38	76.84
180	2.00	2.35	75.03

2.2  140℃下不同加工时间段大豆粉脲酶活性及蛋白质溶解度

由表可见， 140℃加热条件下，大豆粉脲酶活性及蛋白质溶解度随加热时间延长降低，135min时，pH增值法测定的脲酶活性为0；蛋白质溶解度从82.1%降至22.5%。表明140℃热处理对大豆蛋白和脲酶活性破坏明显，说明140℃热处理可以破坏大豆粉中蛋白酶抑制剂活性，但对蛋白质品质也有不良影响。两种方法测得的脉酶活性大小，与85℃热处理一样，在数值上滴定法稍大， 但与增值法无明显区别。

表2. 140℃下大豆粉脉酶活性及蛋白质溶解度

Tab.2 The result of urease activit and protein solubility of soybean meal under 140℃

加热时间 min	脲酶活性		蛋白质溶解度（%）
	pH增值法UA（△pH）	滴定法UA (NH3 mg/g·min)
0	2.30	2.47	82.1
45	0.15	0.20	72.5
90	0.04	0.05	53.8
135	0.00	0.02	33.7
180	0.00	0.00	24.3

3讨论
3.1两种方法对脲酶活性测定结果的比较从本实验结果表明，虽然不同方法测定同一样品的结果在数值上不完全等，但两种方法所测得脲酶活性的强弱趋势相一致。根据国家在制定大豆饼粕脲酶活性的测定方法(滴定法)时，并规定了大豆饼粕脲酶活性用此方法测得的数值不应大于0.4 NH3mg/g·min[7，12]。从表1和表2结果可见，在85℃条件下，作用0~180 min内，大豆粉的脲酶活性均未能达到国家标准。结果表明，在该条件下产品所含胰蛋白酶抑制因子的被破坏程度较低，并对大豆粉蛋白的质量影响不大。相对而言，在140℃下，作用0~180min内，大豆粉的脲酶活性已大大降低，均达到国家标准，尤其是当作用时间超过135 min后，两种方法测定的结果显示被测样品中脲酶活性为0。
3.2脲酶活性与蛋白质溶解度的关系除了脲酶活性外，蛋白质溶解度是近年来判定大豆制品质量的常用指标。由于脲酶活性高低反映大豆饼粕受热程度，可间接反映蛋白酶抑制因子活性高低，但当脲酶活性为0后，进一步加热，脲酶活性仍为0，即此时脲酶活性不再能反映大豆饼粕的受热程度，而蛋白质溶解度仍可随受热程度的增加进一步降低[13]，因此，脲酶活性主要用于评价大豆制品是否过生，在反映大豆及其制品的加工是否受热过度方面，用蛋白质溶解度来评判更为适宜[7]。

20世纪60年代末，Rinehart首先采用0.2%氢氧化钾测蛋白质溶解度的方法来评定大豆粕加工的适宜程度，由于该方法简单、易学，重复性和再现性好，被世界各国广泛采用[14]。Araba和Dale研究结果表明，当大豆粕的蛋白质溶解度低于70%时，很可能影响其营养价值，而当蛋白质溶解度低于65%时，则肯定大豆粕已加热过度[15-16]。近年来，随着加工技术的不断改进和完善，完全可以生产出蛋白质溶解度超过85%甚至达到90%，而脲酶活性接近于零的优质大豆产品[11]。

从表1和2结果显示，大豆粉的蛋白质溶解度随着加工温度的提高和作用时间的延长而下降。在140℃下，随着作用时间的延长，大豆粉蛋白质溶解度降低更加显著。同时，两种方法的测定结果在数值上不能相互替代，由此可见，在对大豆饼粕脲酶活性进行表述或提出具体限量要求时，应明确测定方法，避免引起不必要的纠纷。对于鉴定豆粕质量时，脲酶活性只能判定其内非营养成分的钝化程度，而对过度加热的豆粕蛋白变性程度却无法测定，故建议用脲酶活性与蛋白质溶解度相结合的检测手段进行评价。

xishanzhongke

详细楼主的资料，收藏了！

weihua0608

怎么没看到苯酚红这三个字呢?

LXSLDXH0521

我们没有离心机, 测不了氢氧化钾溶解度

zhenjieli

看后不能光说感谢就行了，分享我的的体会：
1、该方法测脲酶活性比较简单，大部分企业都能做的，而且相对较准；
2、脲酶活性反映胰蛋白酶抗营养因子的多少和大豆加工的生熟程度以及蛋白溶解度——主要是这三点。
3、一般加热过度的豆粕脲酶活性会高，蛋白溶解度会低于65%。较好的豆粕、大豆溶解度胃80左右。