投喂益生菌对黄河鲤鱼免疫效果的研究

胡文辉

殷海成 赵红月

摘要：本试验研究苏云金芽胞杆菌（Bacillus thuringiensis）对黄河鲤鱼血液免疫应答强度的影响。将苏云金芽胞杆菌按1.0×1011、3.0×1011、5.0×1011 cfu/kg三个浓度添加在鱼用全价颗粒饲料中，投喂经嗜水气单胞菌（A. hydrophila）疫苗免疫(A0～3)和未免疫组(B0～3)黄河鲤鱼，分别于0，15，30，40d时检测各组鲤鱼白细胞吞噬活性、血清溶菌酶活性、血清凝集抗体效价，并进行攻毒试验。结果表明：添加苏云金芽胞杆菌均能显著提高黄河鲤的白细胞吞噬活性和溶菌酶活性，增强黄河鲤的凝集抗体效价；各实验组与对照组免疫应答强度差异显著（P<0.05），免疫组免疫应答强度明显高于未免疫组，且差异显著（P<0.05）；苏云金芽胞杆菌能提高黄河鲤经活菌攻毒后的存活率，其中，当菌株添加浓度为5.0×1011cfu/kg时，受免疫的鲤免疫保护率（Relative percent survival）最高。即投喂苏云金芽胞杆菌对黄河鲤鱼血液免疫应答有明显促进作用。
关键词：益生菌；黄河鲤鱼；免疫
Effects of Feeding on Probiotics on the Immune Response of Cyprinus carpio in Yellow River

YIN Hai-Cheng
ZHAO Hong-Yue

Henan University of Technology,Zheng zhou 450001, China

Abstract:

To study the effect of Bacillus thuringiensis（Bt）on the immune response of Cyprinus carpio in Yellow River, the concentrations of Bacillus in test groups feed were respectively 1.0×1011, 3.0×1011, 5.0×1011cfu/kg for the fish were immunized with A.hydrophilain group (A0～3) and the fish weren’t immunized in group (B0～3), Phagocytic activity of leucocytes, lysozyme activity, agglutinating antibody titer and by challenging with live A·hydrophila were checked for 0，15,30,40days. The results showed: Feed contain different concentrations Bacillus thuringiensis all could reprove the phagocytic activity of leukocytes, lysozyme activity and reprove agglutinating antibody titer. Difference is notable between adding and contrasting groups, were immunized and weren’t immunized (P <0.05). Bacillus could reprove the survival rate of cyprinus carpio in Yellow River after challenged with live A.hydrophila. When he concerntration of Bacillus is 5.0×1011cfu/kg feed, the RPS of immunized cyprinus carpio in Yellow River is the highest.

基金项目：河南工业大学校基金 (06XJC024)

Namely feeding with the Bacillus thuringiensis having promoting an effect obviously to cyprinus carpio in Yellow River blood immunity response.

Keywords: Probiotics; Cyprinus carpio in Yellow River; Immunity

苏云金芽胞杆菌(Bacillus thuringiensis，Bt)属于革兰氏阳性菌，广泛应用于防范作物、森林、果蔬虫害，如杀灭寄生线虫、捻转血矛线虫、日本血吸虫等，在生物防治中占有极其重要的地位（李今煜等，2008）。随着对Bt结构功能、遗传、工程菌构建、以及全基因组序列等深入研究，使Bt的应用前景更加广阔。对于鱼类的免疫研究，主要体现在应用中草药、免疫多糖、肽类、益生菌制剂以及免疫增强剂等。如李清等（2005）应用小肽探讨鲤鱼的免疫应答，添加1%的剂量取得较好的免疫效果；Kozinska A,Guz L（2004）用脂多糖注射鲤鱼，可提高其免疫力。然能否将Bt作为微生态制剂，应用于水产养殖，目前没有报道，故值得研究。本试验应用全价饲料添加不同剂量的Bt，研究Bt对黄河鲤鱼免疫应答反应的效果，探讨Bt在水产动物养殖中的应用价值。

1 材料和方法

1.1 黄河鲤鱼分组与免疫处理

选择400尾体重75±0.52 g的健康黄河鲤，随机均分8组，每组50尾，编号分别为：A0（对照组）、A1、A2、A3（含A四组在7 d和14 d分别注射A．hydrophila菌苗免疫0.2 mL/尾（1×108 cells/mL）和B0（对照组）、B1、B2、B3（含B四组未免疫），养于直径2 m的专用箱驯养15 d，开始试验。

免疫结束后，开始试验。试验期间投喂饲料成分相同，试验组饲料中分别添加苏云金芽胞杆菌1.0×1011、3.0×1011、5.0×1011 cfu/kg，对照组不添加。每日喂食两次（8:00，17:00），连续30 d。之后改投相同的不含芽孢杆菌饲料。日投饵量为试验鱼体重的2.50%-4.50 %。整个试验期间，保持微流水，24 h充气。

1.2 饲料选择及加工

饲料选用河南大德饲料科技开发有限公司生产的鲤鱼全价配合颗粒饲料（101＃，粗蛋白34%、粗脂肪5.0%、粗纤维8.0%），粉碎后加入需要量苏云金芽胞杆菌，充分拌匀，用小型制粒机（曲阜市应用科技研究所，93KWP-105）加工成直径为1.5 mm的颗粒，于38 ℃下烘干，保存备用。

1.3 抗原

将嗜水气单胞菌（A．hydrophila）接种于FWA培养基，28℃培养36 h，集菌。然后加入终浓度为0.5%的福尔马林，28℃灭活24 h，即为福尔马林灭活的A．hydrophila菌苗，以0.65%的灭菌生理盐水将灭活的A．hydrophila菌苗浓度调整为1×108cells/mL作为抗原。置4℃冰箱中保存备用。

1.4 采血及处理

试验的第0d、15d、30d、40d（停喂后的第10d）上午进行血样采集，采用心脏和断尾采血两种方法。每组取10尾。取血后，将每尾鱼的血液样本分成2份，1份置室温1h，再置冰箱内4h，以2000r/min离心15min分离血清，供检测溶菌酶活性；另一份以肝素抗凝，供测定白细胞吞噬活性。

1.5 白细胞吞噬活性测定

将金黄色葡萄球菌（Staphylococcus aureus）接种在FWA培养基上，28℃培养36h，集菌，并用无菌生理盐水离心洗涤2次，制成金葡菌悬液。取金葡菌悬液，加入终浓度为0.5%的福尔马林，28℃灭活24 h，作为本试验中的吞噬原。在0.25mL抗凝血中加入0.1mL用灭菌生理盐水调整为1×108cells/mL的金葡球菌悬液，摇匀后置于28℃恒温水浴锅中，孵育1 h，每个血样做血涂片5张，自然晾干，甲醇固定，Giemsa染色，油镜观察并计数。计算：吞噬百分比（PP）=（100个白细胞中参与吞噬的细胞数/100）×100；吞噬指数（PI）=被吞噬的细菌数/吞噬细菌的细胞数。

1.6 血清溶菌酶活性测定

1.6.1菌液的制备

以粉状溶壁微球菌（micrococcus lysoleikticus）配成4×106 cfu/mL菌液，再用722型分光光度计于640 nm测定并调整其浓度，使OD640=0.3。

1.6.2溶菌酶活性的测定

取0.1 mL血清2份，一份于28 ℃水浴锅中预热5 min后加入1.8 mL菌液，2 min时加入2滴5 mol/L KOH溶液终止反应，测640 nm波长下透光率为T1％。另一份重复上述步骤，测透光率为T0％。T1％－T0％即溶菌酶所致透光率的变化。与标准曲线对比，查血清中溶菌酶活性。

1.7 凝集抗体效价测定

采用血凝板依常法进行。反应抗原采用F-AH。
1.8攻毒试验

于免疫后第40d采用A．hydrophila（1×108cells/mL）对各组试验鱼进行攻毒。每组分别取供试鱼20尾，经胸鳍基部注射0.2mL A．hydrophila活菌悬液。饲养观察14d，统计各组的死亡率，依下式计算免疫保护率（relative percent survival, RPS）。

免疫保护率（RPS）=[1－（免疫组死亡率/对照组死亡率）]×100%

1.9 数据处理

试验数据用STATISTIC6.0软件进行统计分析，组间差异用Dunca，s多重比较，显著水平为0.05。

2 结果与分析

2.1 投喂芽孢杆菌对黄河鲤白细胞吞噬活性的影响

投喂苏云金芽胞杆菌对受免和未免黄河鲤白细胞吞噬活性的影响见表1。

表1
投喂苏云金芽胞杆菌对受免和未免黄河鲤白细胞吞噬活性的影响；*表示停止Bt后10d

Table1
Influence of the phagocytic activity of leukocytes of immunized Huanghe cyprinus carpio before and after feeding Bt.（Mean±SD）;* 10 d after feeding without Bt

天数 Days	吞噬活性 Phogocytic activity	组别 （Groups）
		A0 A1 A2 A3 B0 B1 B2 B3
0	PP	32.91±3.08a 31.88±2.29a 32.30±2.51a 33.12±2.44a 32.45±3.14a 31.72±1.86a 32.21±2.25a 33.41±2.51a
	PI	1.16±0.19a 1.41±0.11a 1.34±0.07a 1.36±0.19a 1.15±0.07a 1.32±0.31a 1.08±0.14a 1.12±0.30a
15	PP	38.81±3.06b 60.81±2.54c 64.67±5.12c 63.15±4.23c 32.15±3.37a 55.03±2.05c 58.48±1.58c 58.83±3.21c
	PI	1.26±0.16b 3.45±0.22c 2.60±0.11c 3.27±0.32c 1.22±0.41a 2.18±0.81c 2.35±0.15c 3.01±0.26c
30	PP	38.24±2.09b 58.67±2.15c 62.52±1.23c 60.23±4.14c 34.80±3.04a 57.28±1.05c 59.12±1.82c 58.67±3.08c
	PI	1.47±0.16b 3.02±0.11c 2.46±018c 2.45±0.25c 1.28±0.14a 3.36±0.24c 3.51±0.33c 3.74±0.24c
40*	PP	39.80±3.01b 59.62±3.44c 60.45±1.83c 61.45±2.20c 34.24±2.18a 51.48±1.42c 53.80±3.44c 52.35±3.19c
	PI	1.58±0.11b 3.96±0.34c 4.15±0.30c 4.28±0.21c 1.33±0.23a 3.44±0.23c 3.72±0.11c 3.57±0.48c

由表1可以看出，各试验组在投喂芽孢杆菌前，PP、PI均无显著性差异。投喂芽孢杆菌后第15 d，免疫组A1、A2、A3组的吞噬活性达到最强，分别为60.81±2.54c、3.45±0.22c，64.67±5.12c、2.60±0.11c，63.15±4.23c、3.27±0.32c，对照A0组为38.81±3.06b、1.26±0.16b，15d后，A1、A2、A3组的PP和PI虽有不同程度的下降，但仍显著高于A0组。Dunca，s多重比较A1、A2、A3组间PP和PI无显著性差异（P>0.05），与A0组对比差异显著（P<0.05），A0组在投喂前后则差异显著（P<0.05）。试验对未受免组，芽孢杆菌也能提高黄河鲤白细胞的吞噬活性，表现和免疫组相似，但白细胞的PP和PI均低于免疫组（30d时最高）。说明投喂一定量苏云金芽胞杆菌可提高受免黄河鲤的白细胞吞噬活性。

2.2 投喂芽孢杆菌对鲤血清溶菌酶活性的影响

投喂苏云金芽胞杆菌对鲤鱼血清溶菌酶活性的影响见表2。试验各组在投喂苏云金芽胞杆菌前，溶菌酶活性并无显著性差异（P>0.05）。投喂开始之后的第15d，免疫组A1、A2、A3各组的溶菌酶活性显著增高，且达到最高值，分别为99.87±2.12c、106.10±1.21b、100.94±1.47a。而未经免疫各组同样增高，但增速小于免疫组。Dunca，s多重比较，A2组与A3组无显著性差异（P>0.05），但于A1组间差异显著（P<0.05），免疫组与未免疫组差异显著（P<0.05）。30d之后到停止投喂，溶菌酶活性虽然稍有下降，但差异不显著（P>0.05）。且仍显著高于对照组（45.32 u/mL-52.80 u/mL）。由此可知：饲料中添加苏云金芽胞杆菌可提高黄河鲤的血清溶菌酶活性，添加浓度越高效果相对越好（3.0×1011；5.0×1011
cfu/kg）。

表2
投喂苏云金芽胞杆菌对受免和未免黄河鲤血清溶菌酶活性的影响（单位u/mL）

Table 2
Influence of the lysozyme activity in serum of immunized Huanghe cyprinus carpio before and after feeding Bt.（Mean±SD）;( u/mL)

天数 Days	组别和溶菌酶活性（Groups and lysozyme activity）
	A0 A1 A2 A3 B0 B1 B2 B3
0	45.32±1.52a 45.42±2.02a 45.82±2.07a 45.24±3.70a 44.90±2.81a 45.04±2.51a 45.22±0.23a 45.70±1.08a
15	52.32±1.41a 99.87±2.12b 106.10±1.21c 100.94±1.47c 47.84±3.64 a 78.50±1.74d 86.12±1.60d 90.54±1.84d
30	52.80±2.42a 98.92±3.51b 100.40±2.04c 99.54±2.36c 47.78±4.01a 74.48±4.82d 85.34±5.65d 88.56±4.82d
40*	52.50±1.24a 95.84±2.34b 96.52±2.03c 95.93±2.10c 47.94±2.59a 68.51±3.30d 65.47±1.87d 66.30±3.81d

*表示停止投喂芽孢杆菌后10d ; * 10 d after feeding without Bt

2.3 投喂苏云金芽胞杆菌对黄河鲤凝集抗体效价的影响

免疫组（A0、A1、A2、A3）的凝集抗体效价随投喂天数逐渐上升，在30d时达到最高值。以A2组凝集抗体效价最高，达1:120.56，其次为A3为1:119.40，二者近似相等；A0组最低为1:101.32。投喂浓度高（5.0×1011 cfu/kg），所获得的凝集抗体效价也高。而未免疫组（B0、B1、B2、B3）的凝集抗体效价在整个试验期内处于1:＜4-8之间，明显低于免疫组。说明投喂苏云金芽胞杆菌能提高受免黄河鲤的凝集抗体效价（见表3）。

表3
投喂苏云金芽胞杆菌后黄河鲤凝集抗体效价的变化

Table 3
Agglutination antibody titer of Huanghe cyprinus carpio before and after feeding Bt

组别group	天数和凝集抗体效价 days and agglutination antibody titer
	0 15 30 40*
A0 1:＜4 1，(＜4)2 1:16-256(82.50) 1:64-256(101.32) 1:32-256(90.61)
A1 1:＜4，(＜4) 1:64-256(89.61) 1:64-256(111.09) 1:64-256(104.06)
A2 1:＜4，(＜4) 1:64-256(95.74) 1:128-512(120. 56) 1:64-256(111.02)
A3 1:＜4，(＜4) 1:64-256(98.01) 1:128-512(119.40) 1:64-256(106.75)
B0 1:＜4，(＜4) 1:＜4-8 (4.01) 1:＜4--8(4.75) 1:＜4-8(4.20)
B1 1:＜4，(＜4) 1:＜4-8 (4.90) 1:＜4-8(5.21) 1:＜4-8(4.38)
B2 1:＜4，(＜4) 1:＜4-8(5.01) 1:＜4-8(5.32) 1:＜4-8(4.21)
B3 1:＜4，(＜4) 1:＜4-8(4.98) 1:＜4-8(5.17) 1:＜4-8(4.73)

*表示停止投喂芽孢杆菌后10d；1 表示凝集抗体效价的范围；2 表示凝集抗体效价的几何平均数

*10 d after feeding without Bt;1 indicate spectrum of agglutination antibody titer;2 indicate geometric mean of agglutination antibody titer

2.4 攻毒后的存活率

各组鱼经活菌攻毒后，死亡情况见表4。从表5可以看出，经过免疫接种后的鲤鱼均获得了一定的免疫保护率，且苏云金芽胞杆菌能提高受免鲤鱼的存活率。当苏云金芽胞杆菌在饲料中的添加浓度为5.0×1011cfu/kg饲料时，受免鲤鱼获得了最高的免疫保护率（>70%）。而未免疫组攻毒试验结果，其死亡率大于60%。

表4 活菌攻毒后鲤的死亡率和免疫保护率

Table4 Mortality and relative percent survival of the experiment and control Cyprinus carpio after challenged with live A.hydrophila

组别 groups	攻毒鱼尾数 No. of fish challenged	死亡鱼尾数 No. of dead fish	死亡率 Mortality（％）	免疫保护率 RPS(%)
A0	20	15	75	16.67
B0	20	18	90
A1	20	11	55	31.25
B1	20	16	80
A2	20	5	25	61.54
B2	20	13	65
A5	20	3	15	75.00
B3	20	12	60

3 讨论

3.1苏云金芽胞杆菌对黄河鲤鱼白细胞吞噬活性、溶菌酶活性的影响

近年来，微生态制剂在畜禽饲料中应用较多，主要能提高其免疫应答能力，但在水产动物饲料以及预防疫病研究较少。在本试验应用苏云金芽胞杆菌投喂黄河鲤鱼，观察鲤鱼的血液免疫应答能力，效果明显。
这与刘克林、何明清（2000）用益生菌对鲤鱼免疫功能影响研究结果一致；同时证实蜡样芽孢杆菌对肉鸡血中L细胞值有明显提高。温俊、孙东岩（2008）应用合生素对鲤鱼抗病力研究，取得较好的保护率。陈昌福（1998）利用细菌脂多糖对鲤鱼淋巴细胞培养结果也表明有明显的激活作用，使淋巴细胞数量的增强。溶菌酶是动物非特异性免疫物质之一，在动物防御机制中同样起着重要作用。王宏田等（2000）、王雄等（2004）报道微生态制剂对水产动物溶菌酶活性有增强作用。Marja和Antti（1992）研究表明，在一定程度上，血浆中的溶菌酶水平变化是与循环系统中的白细胞数目变化是一致的。本实验研究结果，添加苏云金芽胞杆菌显著提高鲤鱼血液中细胞吞噬活性、溶菌酶活性以及免疫保护力。其中当芽孢杆菌浓度为5.0×1011cfu/kg时效果最为明显。

3.2 苏云金芽胞杆菌对黄河鲤凝集抗体效价及免疫效果的影响

高等动物通过检测抗体和依据抗体滴度反映免疫应答水平。Inooka和Kimura（1983）报道用纳豆芽孢杆菌饲喂雏鸡后，能够增强雏鸡对抗绵羊红细胞的凝集抗体的产生；卢胜明（2002）报道益生芽孢杆菌制剂能显著提高雏鸡的新城疫血凝抑制效价，对雏鸡具有免疫调节作用。但关于微生态制剂对鱼类凝集抗体效价的作用的报道并不多见。杨先乐等（1990）研究草鱼出血病发现免疫保护力较高时，血清中抗体水平也较高。从本试验研究发现，受免疫鲤的血清凝集抗体效价随着芽孢杆菌浓度的增加而升高。在4个免疫组中，第30d时，A2组凝集抗体效价最高，平均为1:120.56，其次是A3组，平均凝集抗体效价为1:119.40，这说明芽孢杆菌可以提高鲤的特异性免疫机能。但也有文献报道免疫保护力与血清中抗体水平不一致的现象。Toranzo等（1995）用肠球菌的二价疫苗免疫鳟鱼，血清凝集抗体效价非常低，但对攻毒表现了良好的免疫保护效果。这种现象被认为可能是受免疫鱼类对菌苗的免疫应答中，所产生的特异性抗体不全是保护性抗体的缘故。

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其实益生菌在很多动物上都做过试验，而且专家的数据还都不错，但是关键在于实际生产的效果啊