沉淀法测定饲料真蛋白质条件的优化

麦海因 · 发表于 2009-7-20 09:26:53

武英利

农业部畜禽产品质量安全监督检验测试中心（石家庄）

摘要：本文就沉淀法测定饲料中真蛋白质的各种条件进行了探索，并就其适用性进行了试验验证。试验结果表明，沉淀法测定饲料中真蛋白质的最适宜条件为：试样粉碎粒度0.5mm、试样重量以0.5～1g、试液煮沸时间30min，氢氧化钠溶液和硫酸铜溶液用量均为20mL，沉淀洗涤用水温度80℃以上，氢氧化钠和硫酸铜溶液以分次交替加入方式为佳；本试验方法能够排除人为因素添加入饲料中的硫酸铵、尿素、三聚氰胺等非蛋白氮物质的干扰，适用于各种不同类型的饲料真蛋白质测定。

关键词：真蛋白质；粗蛋白质；测定条件

真蛋白质的概念是针对粗蛋白质而提出的，《饲料工业通用术语》（GB 10647—1989）中粗蛋白质的定义是“试样中的氮量乘以6.25”[1]，其中的氮量包括非蛋白氮成分，一般不为动物消化利用。我们通常所说的真蛋白质即试样中的蛋白氮部分乘以6.25，其实就是蛋白质；之所以提出真蛋白质的概念是因为随着时间的推移，粗蛋白质已经不能准确地反映饲料产品的品质，当前世人普遍关注的三聚氰胺事件恰恰说明了这一点，而真蛋白质则比粗蛋白质能够准确地反映饲料的品质。
目前，国内尚无饲料中真蛋白质测定的标准方法，沉淀法是测定饲料中真蛋白质常见的方法。其原理是根据蛋白质的性质利用物理化学的方法使试样中的蛋白质溶解、变性凝结而形成沉淀，除去非蛋白氮物质[3]，通过凯氏定氮的方法测定沉淀中的含氮量，再乘以换算系数得出蛋白质含量[2]。沉淀法测定饲料中的真蛋白质的方法由来已久，但方法并不成熟，存在有许多缺陷。本文就沉淀法测定饲料中真蛋白质的各种条件进行试验研究，以期找出真蛋白质测定的最佳条件，为进一步建立标准的检测方法提供依据。
1.试验材料与方法
1.1试验材料
1.1.1试验样品

猪配合饲料，确证没有添加非蛋白氮类物质。
试样处理
采取“四分法”取三份试样按不同粒度要求进行粉碎，试样粒度分别为0.25mm（4#）、0.50mm（5#）和0.75mm（6#）。
1.1.2主要化学试剂及溶液
1.1.2.1试剂

所用试剂未加说明均为分析纯试剂；
氢氧化钠，五水硫酸铜，硫酸（不含氮），无水硫酸钠，硼酸，甲基红，溴甲酚绿，乙醇，盐酸。
1.1.2.2溶液

所用溶液未加说明均为水溶液（W/V）；
2.5%的氢氧化钠溶液，40%的氢氧化钠溶液，1%的硼酸溶液；
10%的硫酸铜溶液
称取五水硫酸铜10g加水溶解定容至100mL，混匀即可；
混合催化剂
6g无水硫酸钠、0.4g五水硫酸铜研细混匀即可；
混合指示剂
甲基红0.1%的乙醇溶液7mL，溴甲酚绿0.1%的乙醇溶液10mL，两者混合后加入1000mL1%硼酸溶液中即可；
0.1mol/L的盐酸标准溶液
按照GB622要求制备并标定。
1.2主要仪器设备

粉碎机（德国Retsh公司 ZM100 筛孔0.25mm、0.50mm、0.75mm）、电子天平
感量0.0001g、可控温电炉、可控温干燥箱、全自动定氮仪（丹麦 FOSS公司 Kjeltec 2300）、烧杯、玻璃棒、刻度吸管、三角漏斗、中速定量滤纸。
1.3试验方法
1.3.1
称取试样1g（精确至0.0002g）置250ml烧杯中，加水75ml煮沸，边煮边搅拌并不时加水使溶液体积不少于75ml，保持沸腾30分钟。稍冷，慢慢滴加2.5%的氢氧化钠溶液2ml边加边搅拌，再慢慢滴加10%的硫酸铜溶液5ml边加边搅拌；重复上述过程三次，每次加氢氧化钠和硫酸铜溶液5～6ml，三次共计氢氧化钠溶液18ml，硫酸铜溶液15ml。静置陈化2小时以上或过夜[4]。
1.3.2
沉淀用中速定量滤纸采用倾泻法过滤，用70℃以上热水洗涤沉淀7-8次，直至用氯化钡溶液检验无硫酸根离子为止（接滤液数毫升，加盐酸数滴，然后，加5%的氯化钡溶液2ml，无浑浊和沉淀产生）；沉淀连同滤纸置75℃干燥箱中干燥1小时[4]。
1.3. 3
干燥后的沉淀连同滤纸一起放入消化管中,加入15ml浓硫酸，6.4g混合催化剂，按照GB/T 6432《饲料中粗蛋白测定方法》—— 凯氏定氮法进行消解、蒸馏、测定其含氮量，然后，将结果乘以6.25即为试样的真蛋白质含量；同时做空白试验[4]。

本实验方法是在山东农业大学王俊峰撰写的《饲料中真蛋白质含量的测定方法》和总结实践经验的基础上制定的，原方法在沉淀洗涤过程中存在一定缺陷，试验的成功率很低。笔者通过大量试验摸索出分次交替加入氢氧化钠和硫酸铜溶液的方法，加快了沉淀的洗涤过程，大大提高了试验成功率，是沉淀法测定饲料中真蛋白质的最佳方式。
2.试验结果与分析

2.1试验样品的均匀性检验
试验样品的均匀性决定实验的成功与失败，为了检验试样的均匀程度，按照GB/T 6432《饲料中粗蛋白测定方法》分别对4#、5#、6#试样进行粗蛋白质测定，测定结果（以干物质计）见表一。
表一：试验样品粗蛋白含量

试样编号	4#	5#	6#
粒度mm	0.25	0.50	0.75
粗蛋白质 %	20.91	20.95	20.99
相对偏差 %	0.2	0	0.2

从表一看来，4#、5#、6#试样之间的粗蛋白质测定结果相差很小，远远低于方法标准规定的2%分析允许误差，平均粗蛋白质含量为20.95%。说明试验样品混合均匀，4#、5#、6#样品均匀一致没有明显的差异。
2.2不同试验条件对结果的影响
2.2.1试样粉碎粒度对测定结果的影响
为了测试试样粒度对真蛋白质测定的影响，依法对不同粒度的4#、5#、6#样品进行真蛋白质测定，测定结果（以干物质计）见表二。
表二：粒度对测量结果的影响

试样编号	4#	5#	6#
试样粒度mm	0.25	0.50	0.75
真蛋白质 %	19.80	19.73	19.77
相对偏差 %	0.2	0.2	0.0

由表二可知，三个粒度试样的平均真蛋白质含量为19.77%，其测定结果的分析误差均在GB/T 6432《饲料中粗蛋白测定方法》规定的2%允许误差范围之内。结果表明，粒度在0.25～0.75mm之间测试结果没明显差异。考虑到样品处理和沉淀洗涤等方面因素，笔者认为试样粉碎粒度以0.5mm为宜。
2.2.2试样重量对测定结果的影响
为了研究样品重量对真蛋白质测定结果的影响，在其它条件不变的情况下，依法测定不同重量条件下6#样品的真蛋白质，测定结果（以干物质计）见表三。
表三：试样重对结果的影响

试样重量g	0.25	0.50	1.00	2.00
真蛋白质 %	19.90	19.75	19.72	19.75
相对偏差 %	0.6	0.2	0.3	0.2

从表三来看，试样重量为0.25g时，测试结果较其他三个重量结果明显偏高，但其他三个重量结果没有明显差异。而这个结果（19.90%）与最低结果（19.72%）比较仍在GB/T 6432《饲料中粗蛋白测定方法》规定的2%的允许相对偏差范围之内。表明试样重量在0.25～2g之间对测试结果影响不大。考虑到分析误差、标准滴定溶液消耗等方面因素，笔者认为试样重量以0.5～1g为宜。
2.2.3 氢氧化钠溶液用量对测定结果的影响
氢氧化钠溶液在试验中的作用，一方面有助于试样中的蛋白质溶出，另一方面为蛋白质变性凝结提供碱性环境，那么，氢氧化钠的多少是否会对试验结果造成影响呢？在其他条件不变的情况下，使用不同体积的氢氧化钠溶液条件依法对5#样品进行测定，测定结果（以干物质计）见表四。
表四：氢氧化钠溶液用量对结果的影响

氢氧化钠ml	18	20	23	25
真蛋白质 %	19.63	19.77	19.95	19.38
相对偏差 %	0.8	0.1	0.9	——

从表四看来，随着氢氧化钠溶液使用量的增加，试样的真蛋白质测定结果增加到一定程度后就不再增加反而降低，但18mL、20mL、23mL三个不同使用量的测定结果相差不大，其分析误差均在GB/T 6432《饲料中粗蛋白测定方法》规定的2%允许相对偏差范围之内。表明氢氧化钠溶液使用量虽然对测定结果有一定影响，但影响不大可以忽略。试验中我们还发现，随着氢氧化钠溶液用量的增加，沉淀洗涤时过滤的速度逐渐下降，这可能与硫酸铜的相对量不足有关。考虑到分析方法的实用性和可操作性，笔者认为选择20mL的氢氧化钠溶液用量比较理想。
2.2.4硫酸铜溶液用量对结果的影响
硫酸铜在试验中为蛋白质变性提供重金属离子，在反应中起重要作用。为了探索硫酸铜溶液使用量对测定结果的影响，在其它条件不变的前提下，选择不同体积的硫酸铜溶液使用量依法对5#样进行测定，测定结果（以干物质计）见表五。
表五：硫酸铜溶液用量对结果的影响

硫酸铜量 ml	18	20	23	25
真蛋白质 %	19.88	19.77	19.64	19.53
相对偏差 %	0.9	0.4	0.3	0.9

表五结果显示，随着硫酸铜溶液使用量增加，试样真蛋白质测定结果呈下降趋势，同时还发现随着硫酸铜用量增加，洗涤时过滤速度有所加快。同样就分析误差来讲，四个不同体积的硫酸铜溶液的测定结果均在GB/T 6432《饲料中粗蛋白测定方法》规定的2%允许相对偏差范围之内。说明硫酸铜溶液的使用量虽然对测定结果有一定影响，但影响并不大。从分析方法的实用性和可操作性角度出发，笔者认为，选择20mL的硫酸铜溶液用量比较适宜。
2.2.5试样煮沸时间对测定结果的影响
煮沸是为了促进试样中的蛋白质溶解。为了研究试样煮沸时间对真蛋白质测定结果的影响，在其他条件不变的情况下，选取20min、30min和40min三个时间段依法对6#样品进行测定，测定结果（以干物质计）见表六。
表六：煮沸时间对结果的影响

煮沸时间min	20	30	40
真蛋白质 %	19.66	19.72	19.51
相对偏差 %	0.2	0.5	0.6

从表六可以看出，试样的煮沸时间对测定结果有一定的影响，但影响不大，分析误差在GB/T 6432《饲料中粗蛋白测定方法》规定的误差范围之内，当煮沸时间为30min时测定结果最高，因此，试样煮沸时间以30min为宜。
2.2.6
沉淀洗涤温度对测定结果的影响
洗涤是为了除去试样中的非蛋白氮成分，是试验的关键步骤。为了了解沉淀洗涤温度对测定结果的影响，在其他条件不变的情况下，使用不同的洗涤温度依法对4#样品进行测定，测定结果（以干物质计）见表七。

表七洗涤温度对测定结果的影响

洗涤温度℃	60-70	70-80	80以上
真蛋白质 %	19.76	19.77	19.84
相对偏差 %	0.2	0.1	0.3

从表七测试结果来看，三个温度段的测定结果均在GB/T 6432《饲料中粗蛋白测定方法》规定的2%分析误差范围之内，而且结果基本一致，也就是说洗涤温度对测定结果影响不大。但试验中发现洗涤用水的温度在80℃以上时沉淀洗涤速度明显快于其他两个温度段。因此，洗涤用水温度选择80℃以上较为合适。
2.3验证试验
为了验证试验方法的可行性和可靠性，检验人为添加非蛋白氮物质条件下本试验方法的适用性，我们组织了非蛋白氮物质添加试验。添加物分别为硫酸铵、尿素和目前大家普遍关注的三聚氰胺等，试验结果如下：
2.3.1硫酸铵对测定结果的影响，
为了检验在添加硫酸铵条件下本试验方法的适用性，以5#样为基础添加硫酸铵，硫酸铵添加量为1.5021%，硫酸铵的含氮量为21.19%，添加后试样增加粗蛋白质1.7%，按照GB/T 6432《饲料中粗蛋白测定方法》和本试验方法分别对其进行粗蛋白质和真蛋白质测定，相关数据和测定结果见表八。
表八：硫酸铵添加试验结果

测定项目	原样	添加样
测定项目	原样	理论值	测定值	相对误差
粗蛋白质%	18.73	20.43	20.24	0.9%
真蛋白质%	17.64	17.38	17.11	1.3%

从表八可以看出，无论是粗蛋白质还是真蛋白质的测定结果其相对误差均小于2.0%，与理论值基本一致。表明在试样中添加硫酸铵不会影响试样真蛋白质测定结果，也就是说本试验方法可以避免硫酸铵的干扰，适合于含有硫酸铵的饲料产品测定。
2.3.2添加尿素对测定结果的影响，
为了检验尿素对试样中真蛋白质测定的影响，以4#样为基础进行尿素添加试验，尿素添加量为1.8035%，尿素含氮量为46.6%，添加后粗蛋白质增加4.76%，按照GB/T 6432《饲料中粗蛋白测定方法》和本试验方法分别对其进行粗蛋白质和真蛋白质测定，相关数据和测定结果见表九。

表九：尿素添加试验结果

测定项目	原样	添加样
测定项目	原样	理论值	测定值	相对误差
粗蛋白质%	18.86	23.62	23.59	0.1%
真蛋白质%	17.86	17.53	17.24	1.7%

由表九可知，添加尿素后其粗蛋白测定值相对于理论值的误差均小于2.0%，真蛋白质测定结果接近理论值，稍微偏低。表明在试样中添加尿素不会干扰试样中真蛋白质的测定；说明本试验方法适用于添加了尿素的饲料产品测定。
2.3.3添加三聚氰胺对测定结果的影响，
为了验证试样中添加的三聚氰胺是否对真蛋白质测定造成影响，以4#样为基础进行三聚氰胺添加试验，三聚氰胺添加量为0.4813%，三聚氰胺的含氮量为66.6%，添加三聚氰胺后试样的粗蛋白质增加1.91%，按照GB/T 6432《饲料中粗蛋白测定方法》和本试验方法分别对其进行粗蛋白质和真蛋白质测定，相关数据和测定结果见表十。
表十：三聚氰胺添加试验结果

测定项目	原样	添加样
测定项目	原样	理论值	测定值	相对误差
粗蛋白质%	18.81	20.72	20.85	0.6%
真蛋白质%	17.92	17.83	17.87	0.2%

从表十可以看出，添加三聚氰胺后试样的粗蛋白质和真蛋白质测定结果与理论值非常接近。这说明本试验方法适用于添加了三聚氰胺的饲料产品的测定，三聚氰胺不会干扰真蛋白质的测定结果。
2.3.4不同类型饲料的真蛋白质测定
为了验证本试验方法对不同类型饲料真蛋白质测定的适用性，选取配合饲料、浓缩饲料、豆粕、棉粕、进口鱼粉和国产鱼粉，按照GB/T 6432《饲料中粗蛋白测定方法》和本试验方法分别对其进行粗蛋白质和真蛋白质测定，测定结果见表十一。
表十一
不同种类饲料的真蛋白质测定结果

饲料种类	配合饲料☆	猪浓缩料	豆粕☆
粗蛋白质%	20.95	40.58	52.91
真蛋白质%	19.73	36.72	51.57
饲料种类	进口鱼粉☆	国产鱼粉※	棉粕☆
粗蛋白质%	64.19	63.73	39.43
真蛋白质%	57.27	53.20	38.12

注：※三聚氰胺检测阳性；☆三聚氰胺检测阴性。
从表十一结果可以看出，配合饲料、豆粕、棉粕三聚氰胺检测阴性，粗蛋白质和真蛋白质测定结果相差不大；国产鱼粉三聚氰胺检出阳性，真蛋白质和粗蛋白质测定结果相差超过10%，说明三聚氰胺不会干扰真蛋白质测定。进口鱼粉虽然三聚氰胺检测阴性，但粗蛋白质和真蛋白质测定结果相差也很大，分析其原因可能与鱼粉的新鲜程度和腐败程度有关，但也不排除其他因素。试验结果表明，本试验方法适用于不同类型的饲料真蛋白质测定，而且，本试验方法能够区别饲料中是否含有非蛋白氮成分。
3.结论
3.1
在沉淀法测定饲料中真蛋白质的过程中，氢氧化钠和硫酸铜溶液的加入顺序、使用量直接影响真蛋白质测定过程和结果，分次交替加入氢氧化钠和硫酸铜溶液的方法是沉淀法测定真蛋白质最佳选择。
3.2
沉淀法测定饲料中真蛋白质的最适宜条件为试样粉碎粒度0.5mm、试样重量以0.5～1g、试液煮沸时间30min，氢氧化钠溶液和硫酸铜溶液用量均为20mL，沉淀洗涤用水温度80℃以上。
3.3
本试验方法能够排除非蛋白氮对饲料中真蛋白质测定的干扰，适用于含有硫酸铵、尿素和三聚氰胺等非蛋白氮物质的饲料真蛋白质检测。
3.4
本试验方法适用于配合饲料、浓缩饲料、豆粕、棉粕、鱼粉等各种类型的饲料真蛋白质检测。

参考文献：

[1]
中华人民共和国国家标准《饲料工业通用术语》（GB 10647—1989）.

[2] 中华人民共和国国家标准《饲料中粗蛋白质测定方法》（GB/T6432—1994）.

[3]
李靖靖等,《有机化学》 “十一五”国家规划教材，化学工业出版社 .

[4]
王俊锋 ,《饲料中真蛋白质含量的测定方法》《广东饲料》第十三卷第六期，2004年12月.