植酸酶的酶活测定时需要了解的问题

胡文辉 · 发表于 2009-7-6 15:48:22

译者杨威
原作者NELSON E.WARD
DONNIE R.CAMPBELL

尽管饲料工业中淀粉酶应用已经很多年，但猪鸡饲料中植酸酶的快速广泛使用却是前所未有的。植酸酶的广泛应用带来了新的挑战，那就是在植酸酶活力的表达和测定方法上还未能形成统一的规定。
随着植酸酶检测方法的不断修改，新的检测方法正在被研究。很显然植酸酶本身的活力在被测定时不会被改变，这与淀粉酶、生长促进剂、球虫和其他饲料添加剂的情况相同。在没有统一酶活单位的情况下，这些产品习惯上由一些生产厂家进行检测分析。
日粮中，植酸酶如何替代无机磷是很关键的，因为磷对动物体的生化功能和骨骼发育非常重要。因此，对植酸酶酶活检测方法及酶活单位表述的理解显得更加重要。在此，我们综述了植酸酶的检测方法，讲述了当酶活检测方法不同的情况下对确定酶活单位时那些非常规方法的关注。

不同性质

植酸酶是一种具有精确性和专一性的催化剂，当它的结构被修改，其活力也因此被破坏，构型的微小变化都会引起植酸酶与目标底物－植酸结合能力的显著改变。由于蛋白对温度，PH这些因素的敏感，所以蛋白发挥作用所在的环境至关重要，不是所有植酸酶在相同条件下反应都一致。
植酸酶酶表达和发酵条件的不同，可以通过糖基化作用或者植酸酶分子与糖类的连接的方式改变植酸酶（Wyss 等1999a），而这些会削弱植酸酶的构造、稳定性和活力（wang 等1996）或者改变其动力学基础。黑曲霉植酸酶的糖基化可分别引起在酶活活力和热稳定性上9%和40%的差异（Han 等1999），但是有一些植酸酶可以不受影响（Wyss等1999）。
矿物质在植酸酶的作用中起很重要的作用。在溶液中，一些植酸酶的活性会因为结合了钙离子的EDTA的存在而失活。在这个研究中，在缺乏钙离子时，圆二色光谱方法在分子构型上显示出了有意义的变化（Kerovuo等2000），表示这种植酸酶需要钙离子。相反，对不同的植酸酶，EDTA具有相反的作用（Wyss 等1999）。
植酸酶对ph尤其敏感，因为蛋白氨基酸残基的离子状态可能会控制其催化能力。不同植酸酶的最优ph也不同。因此，在化学分析中一个特定的ph可能只是对一种植酸酶有利，而对其他植酸酶不利，但是，小肠消化中的ph范围可能会使这些植酸酶发挥相似的作用。
植酸酶作用的发挥受温度的限制，出于这个考虑，检测植酸酶活力时必须选择介于“最佳”温度（植酸酶表现最高的酶活）和“目标动物所需要的温度（可能不是酶活最高的温度）”之间。
关于植酸酶人们进行了大量的试验，每一个试验都具有独特性。单个因素（如ph，胃蛋白酶稳定性等）在体外试验中的反应已经限制了人们对动物体内植酸酶活力的预测（Simon 和Igbasan2002），因为，酶的功能应该是影响它们活力的所有因素共同作用的结果。最终，消化道的主导条件会调节这些个别因素。

酶活单位混乱

因为植酸酶的生化特性变异较大，所以没有一个表达植酸酶活力的国际标准（Selle和Ravindran，2006），这造成在检测不同来源植酸酶酶活时的混乱，尤其是在用相同的活力单位名称（FTU）检测时（见表1）。检测过程中与实验室间差异无关的其他变异也会导致在植酸酶活力单位表述上3-4倍的差别。
修改植酸酶检测方法越来越普遍。不是不正确，只是所有的检测方法都使用FTUs作为单位是不合适的，它可以导致错误的产品评价。在2002年，FEFANA（欧洲饲料添加剂生产商协会）认识到这一问题并开始致力于在14个商业和政府实验室间统一这个分析方法（FEFANA2005）.

分析原理

现行的植酸酶检测方法是建立在与AOAC检测方法相似的基础上的（Engelen，2001），包括3个主要的步骤：提取、培养和分光光度计定量（图1）。现行的分析方法是Gist－brocades/DSM研究出来用于它们的黑曲霉植酸酶检测的。
简而言之，AOAC分析方法是基于饲料样品中提取出来的植酸酶从植酸钠底物中释放出磷的基础上的。选择Ph5.5是因为对黑曲霉植酸酶来说它是最优ph（Engelen ，1994）而选择37℃因为它与动物的消化道温度相似。
含有氯化钙的乙酸缓冲液（钙离子作为辅助因子）和植酸钠被用作分离和培养饲料中的植酸酶。然后，酸性的钒酸钼试剂用于2个反应：终止60分钟的培养及与释放出来的无机磷形成黄色的复合物。
在415nm，分光光度计测定亮度，在黑曲霉植酸酶标准曲线的基础上用这个读数去估计样品中的植酸酶活力（Engelen，2001）。当检测其他来源植酸酶时使用黑曲霉的标准曲线是值得怀疑的，因为在相同的条件下这些酶很少与黑曲霉同步反应。最终，一个植酸酶酶活单位（FTU）定义为在ph5.5，37℃下每分钟从5.1mM植酸钠中释放1uM的无机磷所需要的植酸酶的量。

分析方法的修改

FTU定义中没有描述缓冲液、缓冲液浓度、酶的辅助因子或者完成反应所需要的时间。这个酶活定义完全集中在分析条件上，而没有反映出对改变结果其关键作用的隐藏在幕后的那些差异。

缓冲液

在这个酶活单位定义中一个很重要而未被确认的因素是缓冲液。乙酸缓冲液正在成为植酸酶分析中最常用的缓冲液，柠檬酸（Rodriquez等2000）和硼酸（Basu等2006）也被使用过。
我们发现商业植酸酶（真菌和细菌）的活力，用柠檬酸作为缓冲液其检测值只有乙酸缓冲液的65-70%（表2）。对于相同的植酸酶样品，柠檬酸缓冲液的检测值为250单位时，如果用乙酸缓冲液分析其值为750单位。而这种缓冲液上的差异不会影响所有的植酸酶，所以就使得解释这两种缓冲液对植酸酶活力单位的影响变得很困难。
相似的，柠檬酸和乙酸缓冲液的不同摩尔浓度对植酸酶的热稳定性也有很重要的影响（Rodriguez，2000）。Dalsgaard （2007 ）提到乙酸和柠檬酸缓冲液对削弱2个大肠杆菌植酸酶的相对活性有主要的作用。BASU （2006）得出制粒饲料中的植酸酶的酶活结果取决于ph、化学特性和缓冲液浓度。他们已经成功使用硼酸缓冲液（ph＝10）测定大肠杆菌植酸酶并且讨论了转换单位“QPU”为 FTU”时需要校正的因素。
值得注意的是，螯合剂如柠檬酸盐（和EDTA）可能会增打植酸酶活性结果，可能原因是减少了植酸钙中有效钙离子。（Maena ，1999）。使用各种不同的缓冲液和螯合剂得出不一致的检测结果（Greiner，1997；Shimizu，1992；Yoon,1996），可能因为不是所有植酸酶都是金属酶或者它们需要不同的辅助因子，再或者或者植酸盐矿物质复合物的形成被阻止。

缓冲液pH

尽管大多数植酸酶在pH4.5-6.0之间有一个最优pH，但是检测时一般采用pH5.5，而一些植酸酶在此pH下活力只有最佳活力的70%或者更少（Rodriquez，2000），而对于其他的植酸酶来说，pH5.5可能是它们最优的pH（Engelen，1994）。
在对比2个检测方法中的pH（图2）时，我们发现一些商业植酸酶的活力可能受其影响较大。同样在较低的ph下，一个植酸酶的酶活增加了170%，另一个却降到只有5%，而另外一个的活力却几乎不受影响。
进而，在这个ph条件下，同一个植酸酶产品的两个不同剂型表现出20%的差异。当产品剂型增加时，这可能会成为大的问题。我们的试验表明造型产品可能要求更多的分析程序以确保样品中植酸酶的完全提取。
在特定pH下活性的减少可能不是真实反映，因为植酸酶可能折叠或复原，这取决于植酸酶蛋白的变性程度。环境和pH的共同影响会使小肠消化道运载植酸酶的效率变得忽高忽低。
当然，一般情况下，动物体内的真实条件不同于实验室、体外试验中所采用的特定某点的pH。图2中植酸酶A 就是这样一个例子，体外某点pH下其酶活较低，但是根据动物试验，植酸酶A 可以提供约0.1%有效磷。

缓冲液添加剂

有些植酸酶需要钙（Kerovuo，2000），所以氯化钙通常被添加到缓冲液中，其添加量并不固定有时可能完全不加入氯化钙。根据植酸酶的检测结果，钙离子缺乏可能会降低酶活结果（Sequeilha 等1992）。
另一方面，过量的钙会形成难于降解的不溶性植酸钙。但在大多数的植酸酶检测中，这可能不会是一个大问题，因为植酸结合钙是发生在中性pH条件下。在pH5.0时，钙对植酸酶（黑曲霉）降解植酸的影响很小（Maenz，1999）。例如，植酸酶分析大多都在pH5.5。
通过4种商品植酸酶，DSM研究（Vogel，2005）发现AOAC中氯化钙的水平使一种植酸酶的酶活增加了40%，但是却降低了另一种植酸酶的酶活分析值。因此，缓冲液中一些辅助因子的内容物对酶活有一定影响。

温度

植酸酶的最佳温度一般都在37℃以上（Lei 和Porres，2003），而37℃时酶活只有最大酶活的40-60%。植酸酶酶活检测一般都在37℃下，尽管目前有一个方法是在60℃下测量大肠杆菌来源的植酸酶酶活（Basu等2006），但这个温度已经超过了猪、禽的体温。培养温度的改变肯定会影响酶活结果。

饲料中提取植酸酶及培养时间

检测方法中，从饲料中提取植酸酶的时间和对植酸酶的培养时间是不同的，关于培养时间的报道也很少。我们期待提取或培养植酸酶时间上的改变会影响植酸酶。此外，颗粒饲料中植酸酶的提取可能需要特别的条件（Basu,2006）。

底物

植酸酶检测中利用植酸钠作为底物，它比饲料中的植酸更容易被降解（Selle，2006）。植酸易于结合饲料中各种成分，尤其是二价阳离子如钙离子（Pallauf 和 Rimbach，1997）。但是植酸钙不如植酸钠容易水解（Maddaih,1963）.
另外，基于对底物的特异性，Wyss （1999b）把植酸酶分为2类。一个是作用范围狭窄、特定作用于植酸的植酸酶，另一个是其偏向作用于一定范围磷复合物的植酸酶。值得注意的是，在体外试验中，更多的磷由植酸酶从饲料中释放出来，表明一些磷的复合物可以作为底物。
固有的底物限制了植酸酶的检测，检测方法中不同底物的应用必将拓展目前植酸酶检测的条件。
另外，植酸钠供货出现了中断。植酸钠主要供应商现在提供的植酸含有高水平的无机磷并且不稳定，这将促使植酸酶结果的不确定性。DSM目前正从其他供应商处筛选植酸钠作为底物。

实践中的分析差异

以前，我们发现植酸酶结果存在很大的差异，这引起了我们的关注。例如图3中，不同厂家商业饲料的样品，用2个的植酸酶分析方法各自在2个不同的试验室进行分析。然而，在不同的实验室分析导致结果存在差异，在此试验中，存在25-60%的差异。

最后的说明

植酸酶的检测为我们提供了一个基本的产品保证和制定标签的依据，酶活检测和生产性能的联系必须建立在磷替代试验基础上，因此，检测酶活和产品间有了联系。然而，植酸酶酶活的检测方法总是变化，但这不影响所有的植酸酶。植酸酶的评价需要在评估前对分析方法有一定的理解。

图1 植酸酶分析方法的一般程序
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图2 乙酸缓冲液为0.25M时，pH对植酸酶酶活的影响
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（以pH=5.5时的酶活作为100%）

图3，两个不同的植酸酶检测方法中，饲料样品中植酸酶的酶活
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注：两个分析方法都是商业上的检测方法
资料来自于DSM营养公司。

表1，不同生产厂商的植酸酶分析方法的差异

分析方法	酶活单位1	样品	提取植酸酶的时间	培养		是否加入辅助因子	标准曲线	吸光度
分析方法	酶活单位1	样品	提取植酸酶的时间	缓冲液	时间分钟	是否加入辅助因子	标准曲线	吸光度
A	FTU	5	60	乙酸	60	是	酶（黑曲霉）	415
B	FYU	80	45	乙酸	30	否	磷	415
C	FTU	10	10	乙酸	30	是	磷	415
D	FTU	60	60	柠檬酸	15	是	磷	820

1酶活单位是指：在pH5.5，37度下，每分钟从5.1mM植酸钠溶液中释放出1uM磷所需要的植酸酶数量。

表2，不同分析方法中商业植酸酶的活力

分析方法1	0.25mM缓冲液，Ph5	植酸酶样品
分析方法1	0.25mM缓冲液，Ph5	黑曲霉	大肠杆菌	大肠杆菌	大肠杆菌	P.lycii
DSM	乙酸	1.00	1.00	1.00	1.00	1.00
AOAC	乙酸	1.08	1.19	1.11	1.14	1.10
C2	柠檬酸	0.53	0.31	0.34	0.31	0.32
D2	乙酸	1.04	1.25	1.20	1.23	1.11