猪病实验室常规诊断技术之十六、乙型脑炎检测方法

nnii521 · 发表于 2009-6-24 21:23:15

十六、乙型脑炎检测方法

猪乙型脑炎乳胶凝集试验（LAT）诊断试剂盒使用说明书
猪乙型脑炎是由流行性日本乙型脑炎病毒（JEV）引起的猪的一种繁殖障碍性疾病。此病引起妊娠母猪流产、死胎、木乃伊胎，公猪睾丸肿胀，萎缩、丧失配种能力及新生仔猪痉挛死亡。临床上该病多呈散发，流行常发生于蚊虫滋生的炎热季节，，患畜病初体温升高、精神沉郁、跛行、有神经症状，病愈后隐性带毒，种猪表现繁殖障碍，该病给养猪业带来较大的经济损失。
猪乙型脑炎乳胶凝集试验是用乙脑弱毒疫苗毒株经纯化、浓缩等程序后致敏乳胶，制成乳胶凝集试验用抗原，用于检测动物血清中的乙脑病毒抗体，可在现场进行，具有安全、简便、快速、特异、敏感之优点。
1．试剂盒的内容：
本品包括猪乙型脑炎致敏乳胶抗原、阳性血清、阴性血清、稀释液、玻片、吸头及使用说明书。
2．制品用途：
用于猪乙脑血清学诊断。
3．使用方法：
3．1
定性试验：
取待检样品（血清）、阳性血清、阴性血清、稀释液各一滴（约15微升左右），分别置于玻片上，再各加乳胶抗原一滴，用牙签混匀，搅拌并摇动1~2分钟，于
3~5分钟内观察结果。
3．2
定量试验：
先将血清作连续稀释，各取1滴依次滴加于乳胶凝集反应板上，另设对照同上，随后再各加乳胶抗原一滴，如上搅拌并摇动，判定。
4．
结果判定：
4．1对照试验：
出现如下结果试验方可成立，否则应重试：阳性血清加抗原呈“++++”；阴性血清加抗原呈“—”；抗原加稀释液呈“—”。
4．2
判定标准：
   “++++”全部乳胶凝聚，颗粒聚于液滴边缘，液体完全透明；
   “+++” 大部分乳胶凝集，颗粒明显，液体稍混浊；
   “++”  约50%乳胶凝集，但颗粒较细，液体较混浊；
   “+” 有少许凝集，液体呈混浊；
   “—”  液滴呈原有的均匀乳状。
   以出现“++”以上凝集为阳性。
5.
贮藏:
在2-8℃冷暗处保存，有效期暂定1年。
6.附注：被检样品采集及处理方法。
6．1 血清：按常规方法分离血清，要求无腐败。

6．2 使用前应轻轻摇匀乳胶抗原。

(吴
斌)

猪乙型脑炎血凝抑制试验操作方法
（一）
实验血清处理
1．非特异性抑制素除净法：取0.1毫升血清（未稀释）加0.9毫升 12.5%高岭土（或白陶土）溶液，混合后放室温中20分钟，然后以约2500转/分钟离心15~20秒，上清液即为1:10的血清。
2．非特异性凝集的除净法：经高岭土（或白陶土）处理好的血清，加入30%（6.4盐水配）鸽或鹅血球0.1毫升；中间振荡混合2~3次，在37℃或4℃过夜，然后1500转/分离心10分钟，上清液即可作HI试验血清。
（二）配制4个单位血凝素，按血凝素滴定结果配制，血凝素单位滴度测定：
1．
取已处理之清洁干燥微量料板。
2．
手持吸入pH9.0盐水之微量吸管直立滴入各孔中，每孔1滴为0.025毫升。
3．
用稀释棒蘸取0.025毫升血凝素于第一孔中，（也可用微量吸管取0.025毫升血凝素加入第一孔中），再用稀释棒作倍比稀释，棒在每孔中要直立旋转30~50次，使血凝素充分混匀，出孔时勿碰孔壁。

孔号成分	1	2	3	4	5	6	血球对照
9.0盐水(ml) 血清(1:10ml)	0.025 0.025	0.025 0.025	0.025 0.025	0.025 0.025	0.025 0.025	0.025 弃 0.025 0.025	0.5
血凝集 (4单位ml)	0.025	0.025	0.025	0.025	0.025	0.025
0.5%鸽血球	0.05	0.05	0.05	0.05	0.05	0.05	0.05

混匀加盖1小时

（三）血凝抑制操作方法按下表进行。

孔号成分	1	2	3	4	5	6	7		血清对照		血球对照
9.0盐水(ml) 血清(1:10ml)	0.025 0.025	0.025 0.025	0.025 0.025	0.025 0.025	0.025 0.025	0.025 0.025	0.025 0.025		0.025 0.025		0.025 弃 0.025
血凝集 (4单位ml)	0.025	0.025	0.025	0.025	0.025	0.025	0.025		0.025		0.025
混匀、加盖置4℃过夜或室温2小时
0.5%鸽血球	0.05	0.05	0.05	0.05	0.05	0.05	0.05	0.05		0.05

混匀，放室溫1—2小时观察结果。

(吴斌)

乙型脑炎反转录聚合酶链反应（RT-PCR）
1．材料准备：待检材料、组织匀浆器、TEN缓冲液、氯仿、无水乙醇、异丙醇、75%乙醇、TRI20L裂解液、RT-PCR试剂盒。
引物：扩增乙型脑炎病毒中447-P77之间50/bp基因片段，由上海生物工程公司合成，其序列为：
上游引物5’—TCA TGT GGC TCG CGA GC—3’
下游引物5’—TCT GTA AGC CGG AGC G—3’
仪器设备：凝胶电泳紫外检测仪、PCR扩增仪、电泳仪
2．操作步骤
2．1 样品采集对于病死或扑杀动物，取脑组织，脑脊髓液血清等，对于待检活猪，无菌采集血液，收集血清，冷藏送检。
2．2 病毒RNA抽提所采病料经组织研磨器充研磨，按1：5用TEN缓冲液悬浮收集于离心管中，反复冻融3次后经7000rpm离心5分钟，取上清液。取上清液（或血清）250μl并加入750μl TRIIOL裂解液于室温作用10-15分钟，加入氯仿200μl，剧烈振荡，室温下放置10-15分钟，再于12000rpm离心15分钟。待分层以后，吸虫上层水相约500μl，加入等体积的异丙醇，混合后置室温下沉淀RNA用适量的灭菌DEPC水溶解，立即进行RT-PCR。
2．3 RT-PCR操作程序按RT-PCR试剂盒操作说明书进行。反应体系（50μl）组成如下：
10×缓冲液
5μl

25mM MgCh
10μl
10mM dNTPs
5μl
RNA酶抑制剂
1μl
AmV Rtase XL
1μl
AmV-optimized Taq
1μl
引物
2μl
Template
10μl
灭菌DEPC水
13μl
反转录条件为50℃ 30分钟
扩增条件，94℃变性2分钟，进入循环，94℃ 3秒，58℃ 40秒，72℃ 2分30秒，35个循环后72℃延伸10分钟。
2．4 RT-PCR产物的检测。扩增产物经0.8%琼脂糖凝胶、电泳、溴化乙锭染色、在紫外光下观察与标准分子量比较，即可获得结果。