猪病实验室常规诊断技术之十五、猪传染性胸膜肺炎间接血凝试验（IHA）操作方法

nnii521 · 发表于 2009-6-24 21:22:20

十五、猪传染性胸膜肺炎间接血凝试验（IHA）操作方法

本方法系用猪传染性胸膜肺炎嗜血杆菌多血清型抗原致敏戊二醛—鞣酸化处理的绵羊红细胞作为抗原，供作间接血凝试验检测猪传染性胸膜肺炎抗体之用。

（一）试验材料

1. 96孔V型医用血凝板

2. 稀释液：含1%健兔血清（56℃30分钟灭活）的pH7.2 0.15M PBS液。

3. 诊断液为1%致敏血球抗原。

（二）操作步骤

1．滴加稀释液：用微量移液器每孔加0.025毫升稀释液。

2．血清稀释：使用微量稀释棒蘸取被检猪血清，置于第1孔中，作倍比稀释至7孔，8孔为空白对照，各孔稀释度分别为1：2、1：4、1：8、1：16、：1：32、1：64、1：128。

3．滴加致敏红细胞：给被检测血清各稀释孔滴加嗜血杆菌致敏的绵羊红细胞悬液25微升。置于微型振荡器上振荡1~2分钟，置37℃温箱作用2小时后判定结果。

4．设对照：在同一V型板上设嗜血杆菌阳性血清对照、阴性血清对照和稀释液对照。在所有对照成立时，方可判定结果。

（三）结果判定

被检测猪血清血凝效价大于或等于1：8（++）以上者，判为阳性（暂定）。血凝价小于1：4（++）者为阴性。

附：玻片沉淀试验

该方法采用环状沉淀试验的胸膜肺炎嗜血杆菌可溶性耐热抗原和玻片凝集试验所用抗血清进行快速玻片试验。

用途：各血清型的定型

操作方法：将用于环状沉淀试验的一滴抗原与玻片上一滴血清混合，摇动，1~3分钟后判定结果。

结果判定：如发生肉眼可见的絮状凝集者为阳性，不凝集者为阴性。

(逯忠新)

猪传染性胸膜肺炎放线杆菌病聚合酶链式反应
1 材料准备：待检组织、培养基
   引物：预期扩增的片段大小为610bp，由上海生物工程公司合成。

序列为，上游引物P1： 5’_CCGACTTTTAAATCCGT-3’
            下游引物P2:
5’_GAACAGTTGTTCCGCTAA-3’
仪器设备有：凝胶电泳紫外线检测仪，PCR扩增仪，电泳仪，CO2培养箱
2操作步骤：
2．1
培养基的制备：PPLO巧克力培养基的制备。取35克PPLO琼脂加热溶于1000ml水中，121℃ 灭菌30min，冷却到60℃左右加10%（v/v）脱纤绵羊脂和1%的葡萄糖（w/v）于80℃水浴，培养基颜色由红色变为巧克力色，倒平皿，4℃保存。
2．2
样品的采集：取病猪的肺组织，低温保纯。
2． 3 样品的处理：采病猪的肺组织无菌接种于PPLO培养基，37℃，10% CO2培养箱培养24-36h后，将菌落透明，圆润，直径1-2mm的菌株用刮取2个菌落洗脱于含100ml无菌水的离心管中，1000r/m离心5min，弃上清，用无菌水悬浮，涡旋后，于沸水中水浴10 min后，再放置-20℃冻结。冻融后10000r/min离心5min,取上清作模板。
2．4
PCR操作程序

PCR反应体系：  总体积50µl ,5µl 10倍缓冲液，3µl 25 m mol/L Mgcl2, 1µl
2 m mol/L dNTPs,5µmol/L上游引物，下游引物各3µl,Taq 0.5µl,模板7µl，无菌
水27.5µl.

PCR.反应条件：于94℃变性3min后，进入循环94℃ 1 min,50℃ 1min30s,

72℃ 1min40s,进行30个循环后72℃延伸10min。PCR产物于4℃保存.
2.5 PCR扩增产物的检测：取8µl.扩增产物和5µl DNA分子量标准，加到含EB的0.8%琼脂凝胶中，电压为80V，电流为40-60mA，电泳15min左右，然后在紫外灯下观察。

猪2型圆环病毒聚合酶链式反应

1 材料准备:待检组织、组织匀浆器、蛋白酶K，十二烷基磺酸钠（SDS），苯酚、氯仿，异戊醇（分析纯）、TEN缓冲液。溶液配制见附录C(标准的附录)

引物：扩增伪狂犬病病毒基因中1093-1586bp之间494bp基因片段，由上海生物工程公司合成。

序列为,
上游引物P1:
5’-CAC GGA TAT TGT AGT CCT GGT-3’

下游引物P2:
5’-GAC AGT ATA TCC GAA GGT GCG G-3’

仪器设备有：凝胶电泳紫外线检测仪， PCR扩增仪，电泳仪
2操作步骤：
2.1 样品的采集：采集病猪的淋巴结、肺脏置-20℃
2.2 样品处理 所采病料经组织研磨器充分研磨，按1:5用TEN缓冲液悬浮收集于离心管内，-70℃反复冻融3次，7000r/min离心5min。取上清液472.5μl,加入25μl 10％SDS和2.5μl的20mg/ml 蛋白酶K，50℃水浴摇床上放置2h后加入等量的饱和酚500μl，涡旋20s。离心取上清液，加等量的酚：氯仿：异戍醇（25:24:1）抽提一次，再用氯仿：异戍醇（24：1）抽提一次，最后用乙醇沉淀，真空抽干后加入20μl双蒸水溶解，-20℃贮存备用。
2.3.
PCR的操作程序PCR反应体系为：总体积50μl，含有50m mol/L KCl,10m mol/L Tris-HCl（pH 9.0），0.1％Triton X-100，100μmol/L dNTPs，5μmol/L引物，2 m mol/L MgCl2，及0.5U Taq酶，1μl模板DNA。
常用的反应体系组成如下

10×缓冲液
5.0μl

15mM MgCl2
3.0 μl

dNTPs
1.0 μl

引物
各2.5μl

Taq聚合酶
0.5μl

DNA模板
1.0μl

灭菌去离子水
34.5μl

扩増条件为:94℃变性3分钟，进入循环，94℃60秒，55℃60秒，72℃90秒，35个循环后72℃延伸10分钟。
2.4
PCR产物的检测

PCR扩增产物在0.8％的琼脂糖凝胶上电泳，溴化乙锭染色，在紫外光下观察结果,可见一494bp的特异性片段。