猪病实验室常规诊断技术之十三、猪喘气病间接血凝试验操作方法

nnii521 · 发表于 2009-6-24 21:20:15

十三、猪喘气病间接血凝试验操作方法

本方法系用肺炎霉形体（M.hyopneumeniae）抗原致敏戊二醛处理的绵羊红细胞，冻干后作为抗原，供作间接血凝反应检测猪霉形体肺炎（猪喘气病）抗体之用。

（一）准备

1．冻干的10%抗原致敏红细胞，至6~8℃或低温保存，使用时每支加1/15M，pH7.2磷酸盐缓冲盐水（PBS下同）5毫升，即为2%抗原致敏红细胞，供作抗原之用。

2．冻干的阳性、阴性猪血清：在4~8℃或低温保存，使用时每支各加PBS 1毫升（已为2.5倍稀释），混匀后，供作阳性，阴性猪血清对照之用。

3．冻干的健康兔血清：在4~8℃或低温保存，使用时，每支（1毫升）启封后加到50毫升 PBS中即为1%健康兔血清稀释剂，供作稀释被检血清，阴性、阴性对照猪血清及预湿稀释棒之用。

4．10%戊二醛化红细胞：在4~8℃或低温保存，使用时，摇匀后取需要量经低离心去掉上液，将红细胞用PBS稀释液成2%的悬浮液，作吸收初检猪血清中的嗜异性因子之用。

5．被检猪血清的处理：分离出来的猪血清先经56℃30分钟灭活，然后每头猪血甭取0.2毫升，加0.3毫升2%戊二醛红细胞37℃吸收30分钟，经低速离心或自然沉淀后，用稀释棒小心地蘸取上面的血清（已为2.5倍稀释）作检验抗体之用。

6．微量反应板：为72孔“V”型有机玻璃制品（市售品），供作微量间接血凝反应之用。

7．微量稀释棒：备有每支载量为0.025毫升的微量稀释棒1~2套（每套12支），供作稀释血清之用（市售品）。

8．微量移液器：供滴加稀释剂和抗原致敏红细胞之用（市售品）。

（二）操作方法

1．首先用记号笔在微量反应板的一边标明被检血清，阳性、阴性对照猪血清及抗原对照，各占一横排孔。

2．滴加稀释剂：用微量移液器每孔加0.025毫升稀释剂。

3．血清稀释：使用微量稀释棒先在稀释剂中预湿后，以滤纸吸干，再小心地蘸取被检猪血清，立于第一孔中，可以同时稀释11个血清，以又手合掌迅速搓动11根稀释棒，达60次，然后11根稀释棒小心移至第2孔，搓动同样转速和次数，再移至第3孔（被检猪血清可以只测到第3孔，即血清稀释到1：20），而阳性、阴性对照猪血必须稀释到第6孔。

4．滴加抗原致敏红细胞：用微量移液器吸取摇匀后的2%抗原致敏红细胞，每孔加0.025毫升。

5．抗原对照：为0.025毫升稀释液+0.025毫升2%抗原致敏红细胞,只用2孔。

6．振荡：以上加样完毕后，置微型振荡15~30秒，静置室温1~2小时观察记录结果。

（三）结果判定

以呈现（++）血凝反应的最高稀释度作为血清效价终点。血凝反应强度表示如下。

++++：红细胞在孔底凝成团块，面积较大。

+++：红细胞在孔底形成较厚层凝集，卷边呈锯齿状。

++：红细胞在孔底形成薄层均匀凝集面积较上二者大，“++”以上的凝集为红细胞凝集阳性。

+：红细胞不完全沉于孔底，周围少量凝集。

±：红细胞沉于孔底，但周围不光滑或中心空白。

-：红细胞呈点状滤于孔底，周边光滑。

微量反应板静置1~2小时后，正常结果是阳性对照猪血清效价≥1：10，阴性对照猪血清效价<1：5，抗原对照无自凝现象。