猪圆环病毒病血清学调查

宁衡

　　　　　　　　　　　　　　　　　　　猪圆环病毒病血清学调查
            　　　　　　　　　　　 　　　　　　琚春梅 陈焕春 刘正飞 曹胜波 何启盖 敖艳华
         　　　　　　　　　　　　　　　　　（华中农业大学畜牧兽医学院动物病毒室 武汉 430070）
摘要：本研究用猪2型圆环病毒ORF2基因的表达产物包被酶标板，建立ELISA诊断方法，用此方法对临床1257份送检血清进行了检测，其总阳性率为57.28%（720/1257），仔猪阳性率为30.83%（119/386），肥猪阳性率为64.93%（137/211），母猪阳性率为71.50%（419/586），公猪阳性率为70.27%（52/74）。这一结果表明猪圆环病毒在我国流行较普遍，且抗体阳性率随猪体年龄的增长而升高。
关键词：猪2型圆环病毒；ORF2；ELISA；血清阳性率
猪圆环病毒（Porcine Circovirus,PCV）属圆环病毒科，其基因组为一环状单链DNA，病毒粒子无囊膜，呈二十面体对称，直径约为17nm[1，2]。PCV在细胞核内复制，并产生大量的核内包涵体[3]。目前认为PCV有两种血清型：PCV1和PCV2，其中PCV1是PK-15细胞（ATCC CCL31）的一种污染物，它不引起可见的细胞病变（Cytopathogenic effect,CPE），感染猪也不出现临床症状，而PCV2与进年来新出现的断奶仔猪多系统衰竭综合征（Postweaning Multisystemic Wasting Syndrome,PMWS）密切相关[4]。PCV1与PCV2核苷酸同源性<80%，但其基因组结构相似，都含有两个最大的开放阅读框：ORF1和ORF2，其中ORF1变异很小，同源性为85%，主要编码与病毒复制有关的Rep蛋白[5]，ORF2变异较大，编码病毒的结构蛋白，此蛋白是病毒衣壳蛋白的主要成分。PCV1和PCV2 ORF2同源性约为65%，这表明PCV的型特异性抗原表位可能在相应的ORF2蛋白中。根据这一推测，Mahe[6]等通过对合成肽扫描分析已经绘出ORF2序列中的几个PCV型特异性抗原表位。最近，Nawagitgul应用杆状病毒表达系统表达出了完整的ORF2蛋白，并观察到此蛋白可自我装配成病毒样粒子[7]。
郎洪武等用国外特异性表达抗原对我国PCV2进行的血清学调查表明，PCV2抗体阳性率很高[8]。此外，华中农业大学曹胜波等用所建立的PCR方法检测43份PCV2可疑病料，结果有12份为阳性，阳性率为27.9%，其中有5份还同时检测到了PPV或PRV[9]，据此可推测PCV2在我国可能较普遍。
目前，PCV2的诊断方法主要为PCR、免疫组化（ISH）、原位杂交、免疫过氧化物酶单层试验（IPMA）以及间接免疫荧光（IFA），但这些方法主要用于检测病原，且对实验条件和技术要求较高。由于该病是近年来新发现的猪的传染病，国内在这方面的研究工作才刚刚开始，为了弄清该病在我国的发病和流行情况，急需一种简便、快速、敏感、特异且便于大规模应用的血清学诊断与检测方法。基于此，本研究以本室分离鉴定的猪2型圆环病毒豫A株为材料，应用其ORF2基因表达产物为抗原包被酶标板，建立了ELISA诊断方法，并在临床上进行了初步应用。
1.材料和方法
1.1ELISA最佳包被浓度的选择
　　用ORF2表达产物从1:10开始倍比稀释纵向包被酶标板奇数列6列,同样用空白载体表达产物从1:10开始倍比稀释纵向包被酶标板偶数列6列,阳性血清和阴性血清以相同比例横向倍比稀释8行做方阵滴定,以确定抗原最佳包被浓度。ELISA步骤同1.2，用酶标仪测各孔的OD630值，分别以奇数孔OD630值－偶数孔OD630值作为血清及抗原每一对应稀释度的OD630值，计算各个稀释度的P/N（P、N分别代表阳性、阴性血清的OD630值）值，以P/N值最大时的抗原浓度作为抗原最佳包被浓度。
1.2 ELISA诊断方法的建立
　　按1.1所选择的最佳包被浓度包被酶标板，奇数列包被ORF2表达产物,偶数列包被空白载体表达产物。
具体步骤为：
1.2.1取预包被的酶标板，用洗涤液洗板3次，200μl/孔，每次静置3分钟倒掉，最后一次拍干。除空白对照孔外，每孔加入以样品稀释液1：40稀释的待检样品，每孔加100μl，每份血清作2孔，一孔为ORF2表达产物包被孔，另一孔为空白载体包被孔。同样1：40稀释对照血清，设阳性对照2孔，阴性对照2孔，空白孔不加血清，轻轻振匀孔中样品（勿溢出），置37℃温育30分钟。
1.2.2甩掉板孔中的溶液，用洗涤液洗板3次，200μl/孔，每次静置3分钟倒掉，最后一次拍干。
1.2.3每孔加酶标二抗100μl，置37℃温育30分钟。
1.2.4洗涤4次, 方法同1.2.2。
1.2.5每孔加底物A液、B液各1滴(50μl)，室温避光显色15分钟。
1.2.6每孔加终止液1滴(50μl)，15分钟内测定结果。
1.2.7结果判定
以空白孔调零，在酶标仪上测各孔OD630值，计算待检血清的S/P值。若S/P≥0.45，则判为阳性，反之，则判为阴性。（阳性孔OD630应大于0.4）
1.3 临床血清的检测
　　用此ELISA方法对湖北、江西、上海、湖南、河南等省的1257份送检血清进行了检测，此次送检血清为不同年龄阶段猪的血清，包括仔猪，肥猪，公猪和母猪。
2.结果：
2.1 ELISA最佳包被浓度的确立
　　方阵滴定结果表明ORF2表达产物和空白载体表达产物浓度为20μg/ml时,P/N值最大，因此,以此浓度为抗原最佳包被浓度。
2.2 临床送检血清的ELISA检测结果：
　　本研究对1257份送检血清进行了检测，其总阳性率为57.28%（720/1257），仔猪阳性率为30.83%（119/386），肥猪阳性率为64.93%（137/211），母猪阳性率为71.50%（419/586），公猪阳性率为70.27%（52/74）（见表1）。

检测猪分类	检测数（头）	阳性数（头）	阳性率（%）
仔猪	386	119	30.83
肥猪	211	137	64.93
母猪	586	419	71.50
公猪	74	52	70.27
合计	1257	720	57.28

3 .讨论
　　用我们建立的ELISA方法对1257份临床血清的检测结果表明，PCV2的抗体阳性率随猪体的年龄增长而升高，此结果与郎洪武[8]（2000）的报道相同。此外，我们检测的74份公猪血清中有52份为阳性，阳性率高达70.27%，586份母猪血清中有419份为阳性,阳性率为71.50%,这表明该病在成年种猪中感染率较高,但种猪是否带毒、持续感染以及垂直感染等深层次问题还有待进一步研究。
　　在本试验中，我们也对ELISA阳性判定标准进行了探讨。此阳性标准的计算方法参考了猪繁殖与呼吸综合征检测试剂盒（HerdChek IDEXX），并结合本研究略加改动。在对血清检测结果进行判定时，我们以S/P=（pGEXORF2表达产物包被孔测得待检血清OD值-空白载体pGEX-KG表达产物包被孔测得待检血清OD值）/（pGEXORF2表达产物包被孔测得阳性血清OD值-空白载体pGEX-KG表达产物包被孔测得阳性血清OD值）>0.45作为阳性标准。

参考文献：(略)

冯春伟

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