三聚氰胺的检测方法！

韩新华

请大家看看这几种方法对大家是否有用？

韩新华

三聚氰胺的检测方法（山东六和集团）

1 三聚氰胺的性质

  
三聚氰胺简称三胺, 别名蜜胺、氰尿酰胺, 分子式:C3N6H6, 分子量: 126.12, 是一种重要的氮杂环有机化工原料。物理性能: 白色结晶粉末, 无味, LD50( 半数致死量) :4550 mg/kg(小鼠经口); 3000 mg/kg(大鼠经口), 相对密度:1570 kg/m3。熔点: 在常压下, 354℃分解。升华温度:300℃。溶解性: 能溶于甲醇、甲醛、乙酸、热乙二醇、甘油、吡啶; 微溶于水、乙醇; 不溶于乙醚、苯和四氯化碳。水溶液呈弱碱性。化学性能: 三聚氰胺显弱碱性, 能够与各种酸反应生成三聚氰胺盐。在强酸或强碱液中, 三聚氰胺发生水解, 胺基逐步被羟基取代, 生成三聚氰酸二酰胺、三聚氰酸一酰胺和三聚氰酸。三聚氰胺与醛类反应生成加成化合物。其中三聚氰胺与甲醛水溶液的反应是最重要的反应。

2 饲料原料中混入三聚氰胺的原因分析

很多饲料厂控制饲料原料时, 基于条件所限, 常用凯氏定氮方法测定粗蛋白的含量, 因为凯氏定氮只能测出含氮量而无法测出氮的来源, 加上蛋白质原料价格比常规的谷物原料要高很多, 为谋取不当得利和弥补饲料原料中蛋白含量低的问题, 不法商人常常加入非蛋白原料, 如工业尿素、二脲等非蛋白氮而冒充粗蛋白质。对于加入尿素以及尿素类成品可以通过检测氨氮的方法检测出来, 而三聚氰胺不溶解在水里, 抗氨氮测定, 所以一般的饲料分析化验部门也很难分析出来。有时在化验一些蛋白质原料时, 蛋白质含量高, 而氨基酸含量低, 也可能是加入三聚氰胺。另外, 三聚氰胺含氮量为66.6%, 折合成粗蛋白含量为416.27%, 掺入少量就可以迅速提高蛋白含量。加上三聚氰胺为白色粉末, 易被染色, 很容易混入原料中而不被发现。三聚氰胺通常被掺入蛋白饲料中, 如大豆蛋白粉、鱼粉、肉骨粉、玉米蛋白粉以及饼粕类原料等。三聚氰胺是一种有机化工产品, 不是国家许可的饲料和食品添加剂, 加入饲料原料中对人和动物产生的危害也在进一步研究中。

3 三聚氰胺的检测方法

   
工业上测定三聚氰胺的纯度通常采用苦味酸法和升华法。苦味酸法方法原理: 将水加入试样, 加热溶解后, 加人苦味酸溶液, 称量所生成的苦味酸三聚氰胺沉淀的质量, 即测得三聚氰胺纯度含量。分析步骤: 称取试样, 置于500 ml 锥形瓶中, 同时加入水, 加热溶解; 冷却后, 加入酚酞指示液3 滴, 若显色, 加入硫酸溶液, 直至溶液颜色消失, 若有不溶物, 需过滤, 水洗; 把滤液和洗液合并, 移入500 ml 容量瓶中, 加水至刻度, 仔细振摇混合后, 准确吸取100 ml 置于500 ml 烧杯里; 将此溶液加热至80℃, 另加入已加热至80℃的100 ml 苦味酸溶液, 冷却至室温后, 保持在15℃以下约8 小时; 用已恒重的玻砂过滤器过滤, 之后,先用约100 ml 苦味酸三聚氰胺的饱和溶液洗涤, 再用水洗; 烘干玻砂过滤器, 置于干燥器中冷却后, 称量求得沉淀物质量。升华法测定原理: 在升华装置中将试样在负压下进行加热, 让三聚氰胺完全升华后, 称其残渣量, 即测得三聚氰胺纯度。分析步骤: 称取试样, 置于预先干燥了的且已知质量的试样容器里; 将试样容器置入减压升华装置内,待完全密闭后, 开启真空装置缓缓吸引, 并调节装置内的

温度, 经2 小时升华结束; 取出试样容器, 冷至室温后, 称量试样容器的质量。上述两种测定方法准确度均较高, 但操作繁琐, 分析时间太长,有人推荐采用电位滴定法。具体测定方法, 首先测定三聚氰胺溶液中总固体的含量, 称取样品于200 ml烧杯中, 加入100 ml 蒸馏水, 放于石棉网的电炉上加热,在沸腾的情况下搅拌溶液, 使试样完全溶解。在电磁搅拌状态下, 用硫酸标准溶液滴定热溶液至pH 值为5 左右。流水冷却溶液至室温, 滴定, 每次准确加入0.1 ml 硫酸标液,并记下相应的pH 值, 直至pH 值约为3。计算出等当量点时消耗硫酸标液的体积。结果计算按公式Me=S×6.307×V×F /m ( 其中式中:Me 为溶液中三聚氰胺的含量, %; S 为溶液中总固体的含量, %; V 为等当量点时消耗硫酸标液的体积, ml; F 为0.5 mol /L 硫酸标液的校正系数; m 为滴定时所标取总固体的质量; 6.307 为换算系数) 。

韩新华

饲料中三聚氰胺的测定
1　范围
本标准规定了用高效液相色谱法（HPLC）和气相色谱质谱法（GCMS）测定饲料中三聚氰胺的方法。高效液相色谱法为筛选法，气相色谱质谱法为确证法。
本标准适用于配合饲料，预混料、浓缩饲料、饲料添加剂、植物性蛋白粉、宠物饲料中三聚氰胺的测定，方法最低定量限高效液相色谱法和气相色谱质谱法分别为2.0mg/kg和0.05mg/kg，高效液相色谱的最低检测浓度分别为0.5mg/kg。
2　规范性引用文件
下列文件中的条款通过本标准的引用而成为本标准的条款。凡是注日期的引用文件，其随后所有的修改单（不包括勘误的内容）或修订版均不适用于本标准，然而，鼓励根据本标准达成协议的各方研究是否可使用这些文件的最新版本。凡是不注日期的引用文件，其最新版本适用于本标准。
第一法 高效液相色谱法
3　原理
试样中的三聚氰胺用1％三氯乙酸提取，离心后取部分提取液，用阳离子交换柱净化，洗脱物用具有二极管阵列检测器的高效液相色谱仪进行定量。
4　试剂与材料
除非另有规定，仅使用分析纯试剂。水为蒸馏水，色谱用水符合GB/T 6682一级用水的规定。
4.1 甲醇：色谱纯。
4.2 乙睛：色谱纯。
4.3 氨水。
4.3 阳离子交换柱(SPE柱)：60mg，3mL或150mg，6mL。
4.4 1％三氯乙酸：称取10g三氯乙酸溶解于1000mL水中。
4.5 5％氨化甲醇：量取5mL氨水，溶解于100mL甲醇中。
4.6乙酸铅溶液（ρ（PbAc2）=22g/L）：取22g乙酸铅用约300mL水溶解后定容至1L。
4.7 滤膜：0.45m，有机相
4.8 三聚氰胺标准品（﹥99.0％）
4.9 标准储备液（1mg/mL）：称取100mg（精确到0.1mg）的标准品，用甲醇/水（2:8，V:V）溶解并定容于100mL容量瓶中。
4.10 标准工作液：标准工作液按照需要逐级稀释配制。
5 仪器与设备
5.1 高效液相色谱仪，配有二极管阵列检测器。
5.2 离心机：10000rpm
5.3 涡旋混合器
5.4 氮吹仪
5.5 固相萃取装置
5.6 高速匀质器
5.7 索式提取器
6 测定步骤
6.1 提取
6.1.1 植物蛋白和饲料中三聚氰胺的提取
称取5.0g样品，准确加入48ml1％的三氯乙酸溶液，加入2mL饱和醋酸铅溶液。摇匀，超声提取20min。取提取液约30mL转入离心管，在10000rpm离心机上离心5min。
6.1.2 宠物饲料中三聚氰胺的提取
称取5.0g样品，在索式提取器中用乙醚回流6h去除脂肪。脱脂残渣准确加入48ml1％的三氯乙酸溶液，加入2mL饱和醋酸铅溶液。摇匀，超声提取20min。取提取液约30mL转入离心管，在10000rpm离心机上离心5min。
6.2 净化
   MCX柱活化和上样：分别用3ml甲醇，3ml水活化MCX柱，准确移取10mL离心液分次上柱。再用3ml水和3ml甲醇洗涤MCX柱，抽近干后用5％氨化甲醇溶液（4.5）3ml洗脱。洗脱液于氮吹仪上50℃氮吹至干，用2+8甲醇水定容，过0.45m滤膜，滤液用于液相色谱测定。
6.3 测定
6.3.1液相色谱条件
色谱柱：C8柱，1504.6mm(i.d)，5m；
柱温：室温
流动相：10+90（乙腈：10mM庚烷磺酸钠，10mM柠檬酸缓冲液）
检测波长：240nm
进样量：20L
根据试样中被测物的含量情况，选取响应值适宜的标准工作液进行色谱分析，按照保留时间和二极管阵列的紫外光谱进行定性，标准工作液应有五个浓度水平。标准工作液和待测样液中三聚氰胺的响应值应在仪器线性响应范围内。
6.4        结果计算和表述
按照下式计算试样中三聚氰胺的含量：

式中：
W－试样中三聚氰胺的含量，单位为毫克每公斤（mg/kg）；
V－样品最终定容体积，单位为克（g）；
c－由标准曲线而得的样液中三聚氰胺的含量，单位为微克每升（g/L）；
m－试样量，单位为克（g）。
n — 稀释倍数。

6.5 结果表示
平行测定结果用算术平均值表示，结果保留三位有效数字。

7重复性
在同一实验室由同一操作人员使用同一仪器完成的两个平行测定的相对偏差不大于10%

气相色谱－质谱法（确证法）
8 方法提要
试样中的三聚氰胺用1％三氯乙酸提取，用阳离子交换柱净化，用BSTFA衍生化，用气相色谱-质谱进行定性和定量分析。
9 试剂和材料
衍生化试剂：N,O-双三甲基硅基三氟乙酰胺（BSTFA）
其他同5
10 仪器和设备
气相色谱-质谱，其它同6
11 分析步骤
前处理同6.1和6.2
11.1 衍生化
将6.2的净化液吹干，加入200L的吡啶和200L的BSTFA，混匀，在70℃衍生30min。同时用三聚氰胺标准系列做同步衍生。
测定
11.2 气相色谱－质谱条件
柱子：DB-5MS柱
载气：He 流速: 1.3 ml/min 平均线性速度: 35 cm/sec 压力: 17.5 psi (initial) 模式: 恒流
进样：不分流或分流进样 (1:20)，进样体积为1µl，进样温度: 250ºC
升温程序：起始温度为75ºC，持续1.0 min，以30ºC/min升温至300ºC，保持2.0 min。传输线温度为280 ºC。
运行时间:  10.5 min
质谱条件：质量范围: 40-450 amu
扫描模式：全扫描 (Electron Ionization)
溶剂延迟:  4.2 min (splitless); 3.8 min (split)
四极杆: 150ºC
离子源: 230ºC
监测离子：特征离子 171，99，73；分子离子：327，342
11.3 定性定量方法
定性方法：样品与标准品保留时间的相对标准偏差不大于0.5%。特征离子基峰百分数与标准品相差不大于20％。
定量方法：选择离子监测（SIM）法计算峰面积，单点或多点校准法定量。
12 结果结算和表述
按照下式计算试样中三聚氰胺的含量：

式中：
W－试样中三聚氰胺的含量，单位为毫克每公斤（mg/kg）；
V－样品最终定容体积，单位为克（g）；
c－由标准曲线而得的样液中三聚氰胺的含量，单位为微克每升（g/L）；
m－试样量，单位为克（g）。
平行测定结果用算术平均值表示，结果保留三位有效数字。
13 允许差
取平行测定结果的算术平均值为测定结果，两个平行测定的相对偏差不大于20％。

songping

国家也在征集好的方法，关键是实用，易操作，气相液相一般的做不来的

wangliguo429

正需要，谢楼主提供:xuehu:

wfcllyb

方法不错，但楼主是不是在第三楼将计算公式给忘了！

毅石

查过一些文献，大都用气相色谱。一般的饲料企业做不到的！

laomo7909

我觉得现在我们已经不是研究怎么测三聚氰胺了，最需要研究的是怎么改进测蛋白的方法。在这个掺假横飞的年代，利用传统的方法测粗蛋白还能代表什么？只能带来对人们生活的伤害，国家不顾劳动人们的死活，一生令下，奶牛只能把白白的牛奶给倒掉，只能是让世界人民看中国人的消化，只能是让“made in china”成为假货的代名词。可悲啊。

xnkiller

就是这个检测方法，但是这个方法的成本非常高，重要的是原料控制和和科学合理的管理

新新宝贝

这样的话,我们只能用一些常规的大众原料,那些当地的一些好的杂粕等原料不敢用就真的是可惜