饲料中粗蛋白测定方法

泡泡 · 发表于 2008-9-26 09:39:23

1、凯氏定氮法的原理
1.1 消化：样品与硫酸一同加热消化，硫酸使有机物脱水，破坏有机物，有机物中的碳和氢氧化为二氧化碳和水逸出，而蛋白质分解成氨，则与硫酸结合成硫酸铵留在酸性溶液中。其反应式如下：
H2SO4→SO2+H2O+﹝O﹞
2CH3.CH.NH2.COOH+2﹝O﹞→2CH3.CHOH-NH2+2CO2
2CH3.CHOH.NH2+10﹝O﹞→4CO2+2NH3+4H2O
2NH3+H2SO4→(NH4)2SO4
在消化过程中添加硫酸钾可以提高温度加快有机物分解，它与硫酸反应生成硫酸钾，可提高反应温度，一般纯硫酸反应生成硫酸氢钾，可提高反应温度，一般纯硫酸加热沸点330℃，而添加硫酸钾后，温度可达400℃，加速了整过反应的过程。此外，也可以加入硫酸钠、氯化钾等盐类来提高沸点。其理由随着消化过程硫酸的不断的分解，水分的逸出而是硫酸钾浓度增大，沸点增加。加速了有机物的分解。其反应式如下：
K2SO4+H2SO4=2KHSO4
2KHSO4=K2SO4+H2O+SO3
但硫酸钾加入量不能太大，否则温度过高，生成硫酸铵也会分解，放出氨而造成损失。
（NH4）2SO4→NH3↑+NH4HSO4
2 NH4HSO4→2 NH3↑+2 SO4↑+2H2O
为了加速反应过程，还加入硫酸铜，氨化汞或硒粉作为催化剂以及加入少量过氧化氢，次氯酸钾作为氧化剂，但为了防止污染通常使用硫酸铜，其反应式如下：
2GuSO4→Gu2SO4+ SO2↑+O2↑
5O2+2GuSO4→GuSO4+ SO2↑+6O2↑
GuSO4+H2SO4→2GuSO4+ SO2↑+H2O
所以有机物全部消化后，出现硫酸铜的蓝绿色，它具体由催化功能，还可以作为碱性反应指示剂。
1.2
蒸馏：样液中的硫酸铵在碱性条件下释放出氨，在这一操作中，一是加入氢氧化钠溶液要过量；二是防止样液中氨气逸出，其反应如下：
2（NH4）2SO4+2NaOH→NH3↑+Na2SO4+H2O
1.3
吸收与滴定：蒸馏过程中放出的氨可用一定量的标准硫酸或盐酸溶液进行吸收。然后再用标准氢氧化钠溶液反滴定过剩的硫酸或盐酸溶液，从而计算出总氨量。半微量或微量蒸馏定氮通常用硼酸溶液吸收后，再用标准盐酸溶液之间滴定，硼酸呈微弱的酸性，用酸滴定不影响指示剂变色反应，它有吸收氨的作用，其反应如下：
2NH3+4H3BO3→（NH4）2B4O7+5 H2O
（NH4）2B4O7+2HCI+5 H2O→2NH4CL+4H3BO3
1.4 混合指示剂：标准盐酸溶液滴定吸收液中的氨的PH值突跃范围为6.3-4.3。采用甲基红-溴甲酚绿混合指示剂，终点颜色由绿色变为灰红色。

	PH＜5.1	PH=5.1	PH＞5.1
溴甲酚绿	黄色	绿色	蓝色
甲基红	红色	橙色	黄色
甲基红+溴甲酚绿	酒红色	灰色	蓝绿色

2、定氮仪
2.1 对半微量定氮仪的要求：必须是水蒸气蒸馏，蒸馏速度为10-20分钟内蒸出液量达70-100毫升，氨的回收率在97%以上，一起加碱空蒸时，蒸出液空白要低。
2.2 操作定氮仪注意事项：
2.2.1本仪器必须在无氮及氨化物污染的专用实验室内工作。
2.2.2所有的蒸馏水均为无氨水。
2.2.3蒸馏试样前必须清洗仪器，并对仪器进行检漏。
2.2.4新的蒸馏装置或久不使用的装置，冷凝管不要通冷凝水，先通水蒸气洗净。
2.2.5在分析试样前，蒸馏50毫升水溶液检查空白，空白低时才能进行试样分析。
3、饲料粗蛋白测定方法操作注意点
3.1试样消煮，加催化剂［GuSO4.5 H2O:Na2SO4(无水)=1:15(质量比)］3.2克、加浓硫酸13毫升。
3.2 消化时间视不同样品含脂肪、蛋白质而定，一般样液呈现蓝绿色后消化30分钟就可以（高蛋白及有争议的样品应按国标消化至样液出现蓝绿色后消化2小时。
3.3 无损失的将消化液由凯氏烧瓶转入100ml容量瓶中，并用蒸馏水洗凯氏烧瓶2-3次，洗液一并倒入容量瓶中。
3.4 配置的20g/l硼酸液不能被酸污染，三角烧瓶应洗净，一旦显色不对，洗净后重新吸取硼酸液和指示剂。
3.5 加蒸馏水空蒸，一要对定氮仪检漏；二要检蒸馏液的ＰＨ值不能太高，最好控制在ＰＨ值６－７之间。
3.6 要先塞好入口玻璃塞，再加碱液，小心提起玻塞使之流入反应室，将玻璃塞塞好，且在入口出加水封好。防止氨损失和漏气。同时要严防反应室里分解试样和碱液倒吸出来。反应室内液量不能太多。
3.7 控制好水蒸气发生器温度，不能过高（测定结果偏高）；不能过低（测定结果偏低）。可用一台调压器与电炉串联，以硫酸铵校正值确定电压大小。
3.8 应随时用分析纯硫酸铵代替试样来校正加碱，蒸馏和滴定各步骤地操作。
3.9 蒸馏完毕，拔入口处玻璃塞动作要轻柔。防止反应室内碱液倒喷入冷凝管内，避免给下一个试样分析带来较大的误差。
3.10 滴定操作禁止放长线滴定。
3.11 每换一批药品试剂、标液要用蔗糖（分析纯）代替试样进行空白测定。
3.12 消化温度应控制在400℃至420℃内。消化器控温器应良好，电阻丝应使用专用配套电阻丝，拉伸应均匀，使炉内温度均匀，没有房消化管的孔上用瓷坩埚盖盖上。
CP(%)＝(V2-V1)×C×0.014×6.25×100 /W×V1／V
式中：V2—滴定试样时所需酸标准溶液体积，ml；
V1—滴定空白时所需酸标准溶液体积，ml；
C—盐酸标准溶液的物质的量浓度，mol/L；
W—试样重量g；
V—试样分解液总体积，ml；
V1—试样分解液蒸馏用体积，ml；
0.014—氨的摩尔质量g/m mol；
6.25—氨换算成蛋白质的平均系数。
在实际分析应用中通常V1=0.1 ml
V=100 ml如若C（HCL）=0.0493 mol/ ml
V1=5 ml
那么粗蛋白质计算公式可简化为：
CP(%)＝(V2-0.10)×0.0493×0.014×6.25×100 /W×5／100