新 型 鸭 肝 炎 病 毒 的 分 离 及 初 步 鉴 定

peteryuanfeng

新 型 鸭 肝 炎 病 毒 的 分 离 及 初 步 鉴 定
苏敬良1  , 黄 　瑜2  , 贺荣莲3  , 赵继勋1  , 郭玉璞1
(1.  中国农业大学 动物医学院 , 北京 　100094 ; 2. 福建农业科学院 畜牧兽医研究所 , 福建 福州 　350013 ;
3. 广西农业科学院 兽医研究所 , 广西 南宁 　530001)
　　摘要: 从北京和广西发病鸭群中分离到 2 株病毒 ,分别编号为B 株和 G株 ,病毒大小约 40 nm ,无囊膜。血清中和试验
表明 ,2 株病毒为同一血清型 ,与 1 、3 型鸭肝炎病毒和鸭瘟病毒无血清学相关性。人工感染试验表明 , G株对雏鸭具有很强
的致病性 ,可引起典型的鸭肝炎病变 ,但死亡率随雏鸭日龄的增长而明显下降;B 株病毒不能致死正常雏鸭 ,但雏鸭经过环
磷酰胺处理后 ,感染B 株病毒可引起雏鸭死亡 ,死亡鸭肝肿胀、出血。
　　关键词: 新型鸭肝炎病毒; 鸭; 分离
中图分类号: S 852. 659. 6 　　　文献标识码: B 　　　文章编号: 1000    6419 (2002) 01    0015    02
　　1999 年 5 月北京、广西等地 3～13 日龄北京鸭和樱桃谷鸭
发生一种类似于 1 型鸭病毒性肝炎的疾病 ,死亡率 20 %～80 % ;
病鸭表现为突然发病、抽搐并很快死亡;剖检可见肝肿胀 ,其表
面呈树枝状充血或有出血点、出血斑 ,胆囊充盈 ,肾轻度淤血。
取病死鸭肝做细菌分离培养 ,结果为阴性;经病毒分离分别从北
京和广西的病料中各分离到 1 株病毒(编号为 B 株和 G 株)  ,经
过鸭胚血清中和试验表明两者为同一血清型 ,但与 1 、3 型鸭肝
炎病毒阳性血清无交叉中和反应[1～3 ] 。
1 　材料与方法
1. 1 　试验材料 　1 型鸭肝炎病毒: 鸡胚适应毒 65 代 , ELD50 为
10 - 6. 12/ 0. 1 mL ,由本室保存;鸭抗 1 型肝炎病毒阳性血清:鸡胚
中和效价 ≥1∶64 ;抗 3 型鸭肝炎病毒阳性血清:由美国康乃尔大
学B.  W.  Calnek 教授惠赠;鸭抗鸭瘟病毒阳性血清:本室制备。
北京鸭胚及 1 日龄雏鸭:购自中国农业科学院畜牧研究所; SPF
鸡胚:山东家禽研究所秦卓明研究员提供;环磷酰胺:上海华联
制药有限公司生产 ,批号 991109。
1. 2 　材料处理 　无菌取病死鸭肝按 1∶5 加入灭菌 PBS 后研磨 ,
-  20  ℃冻融 1 次 , 10 000 r/ min 离心 30 min ,取上清用 220 nm 针
头式滤器过滤除菌。
1. 3 　病毒分离 　将上述处理材料经尿囊腔途径接种 9 日龄北
京鸭胚 ,0. 2 mL/ 胚 ,观察鸭胚病变和死亡情况 ,收获尿囊液并传
代。
1. 4 　阳性血清制备 　取 B 株第 4 代鸭胚尿囊液人工感染 7 日
龄雏鸭 ,接种 7 d 后仍存活 ,对存活的雏鸭于 10 d 后再用灭活的
尿囊液加强免疫 1 次 ,采血 ,分离血清。
1. 5 　病毒对鸭胚成纤维细胞适应试验 　将分离的2 株病毒第4
代鸭胚尿囊液分别接种鸭胚成纤维细胞单层 ,盲传 5 代后取细
胞培养液接种 9 日龄鸭胚 ,检查病毒是否能够在成纤维细胞中
增殖。
1. 6 　病毒对 SPF 鸡胚适应试验 　取分离的 2 株病毒第 4 代鸭
胚尿囊液经尿囊腔接种 SPF 鸡胚 ,0. 2 mL/ 枚 ,盲传 6 代后收获
收稿日期: 2001    07    23
作者简介: 苏敬良(1967   )  ,男 ,江西省金溪县人 ,副教授 ,博士。
尿囊液返传鸭胚 ,检查分离株是否适应鸡胚。
1. 7 　分离毒株鉴定[2 ,3 ]
1. 7. 1 　乙醚敏感性试验  取第 4 代鸭胚尿囊液病毒 0. 8 mL 加
0. 2 mL 乙醚于灭菌离心管中 ,振荡 10 min ,于 4   ℃放置24 h ,3
000 r/ min 离心 20 min ,吸取病毒液并反复吹打几次使残留乙醚
挥发后分别作 10 - 1～10 - 6稀释 ,每个稀释度接种 5 枚 9 日龄鸭
胚 ,设未加乙醚处理的病毒液作对照。观察 7 d ,记录鸭胚死亡
情况。
1. 7. 2 　鸭胚 ELD50测定  取B 株第 5 代及 G株第 4 代鸭胚尿囊
液毒分别作 10 - 1～10 - 6稀释 ,接种 5 枚 9 日龄鸭胚 ,0. 1 mL/ 枚 ,
观察 7 d ,记录鸭胚死亡情况。
1. 7. 3 　血清中和试验 　分别将 56 ℃灭活的 1 型、3 型鸭肝炎病
毒性血清和鸭瘟病毒阳性血清作1∶5 、1∶10 和1∶40 稀释 ,并与分
离得到的病毒第 5 代尿囊液(100ELD50 ) 等量混合 ,4  ℃过夜 ,每
个稀释度接种 5 枚鸭胚 ,0. 2  mL/ 枚 ,同时设病毒液对照 ,0. 1
mL/ 枚 ,观察 7 d ,记录鸭胚死亡情况。抗B 株病毒阳性血清与 1
型肝炎病毒及 G株病毒交叉中和试验 ,操作步骤与上述相同。
1. 7. 4 　电镜观察  取死亡鸭胚肝经戊二醛固定后做超薄切片 ,
观察细胞中病毒粒子。另取鸭胚尿囊液经 10 000 r/ min 离心 60
min 后取上清 ,经 40 000 r/ min 离心 2 h ,弃上清并用少量蒸馏水
悬浮沉淀 ,再将悬液滴加至250 g/ L 的蔗糖垫上重新超离1 次除
去部分杂质 ,取沉淀并去除蔗糖后用 20 mL/ L 磷钨酸负染 ,透射
电镜观察病毒的形态。
1. 8 　攻毒试验
1. 8. 1 　B 株
1. 8. 1. 1 　取B 株第 5 代鸭胚尿囊液分别经腿部注射 2 日龄和 7
日龄鸭各 10 只 ,0. 5 mL/ 只 ,观察 7 d。
1. 8. 1. 2 　将饲养于正压隔离器中的 16 只 1 日龄雏鸭 ,于 2 、3 日
龄 2 次腿肌注射环磷酰胺 ,4 mg/ 只;4 日龄时经腿内侧注射第 5
代鸭胚尿囊液毒 ,0. 5 mL/ 只 ,共 11 只;另 5 只作对照 ,攻毒后于
隔离器中饲养观察 7 d。饲料和饮水均经过无菌处理。
1. 8. 2     G株 　取 G株第 4 代尿囊液毒腿部注射感染 3 批雏鸭 ,
分别为 2 、7 和 13 日龄雏鸭各 10 只 ,0. 2 mL/ 只 ,每批设 6 只空白
对照 ,攻毒后观察 7 d。2 　结果
2. 1 　病毒分离 　将处理的病料接种鸭胚后 96 h 内可 100 %致
死鸭胚 ,可见胚体水肿、出血 ,肝出血或有白色坏死点。鸭胚尿
囊液传代毒接种鸭胚成纤维细胞连续 5 代均不产生细胞病变;
细胞培养液毒接种鸭胚不能致死鸭胚。经 SPF 鸡胚中连续传 5
代 ,鸡胚发育正常 ,试验表明分离的 2 株病毒不能在鸭胚成纤维
细胞和鸡胚中增殖。
2. 2     乙醚敏感性试验  将 2 株病毒经过乙醚处理后接种鸭
胚 ,鸭胚死亡和病变情况与未经乙醚处理的对照组无差异 ,证明
所分离的病毒为无囊膜病毒。
2. 3     鸭胚 ELD50测定  B 株第 5 代鸭胚尿囊液 ELD50  = 10 - 4. 23/
0. 1 mL ;  G株第 4 代尿囊液 ELD50  = 10 - 4. 12/ 0. 1 mL 。
2. 4     中和试验 　1 、3 型鸭肝炎病毒阳性血清及鸭瘟病毒阳性
血清对 2 株分离病毒均无中和作用 ,抗 B 株病毒阳性血清对 1
型鸭肝炎病毒 65 代鸡胚适应毒无中和作用 ,而对 G株病毒的中
和效价 ≥1∶40 ,说明B 株病毒和 G株病毒为同一血清型 ,但与目
前所报道的 1 、3 型鸭肝炎病毒不同。
2. 5 　病毒形态观察  电镜下 ,鸭胚的肝超薄切片细胞质和超离
沉淀负染样本中可见到少量 40 nm 左右的无囊膜病毒;切片中
未发现有晶格状排列的病毒粒子。
2. 6 　动物感染试验
2. 6. 1 　B 株病毒人工感染雏鸭不能引起发病和死亡;经过环磷
酰胺处理的雏鸭攻毒后 72  h 开始死亡 ,至观察结束共死亡 8
只(8/ 11)  ,剖检可见肝肿胀、充血 ,少数有出血斑和条状出血。
2. 6. 2 　G株病毒人工感染雏鸭可引起明显的发病和死亡 ,但随
着雏鸭日龄增大 ,死亡率明显下降。2 日龄感染鸭死亡率为
80 %(8/ 10)  ,7 日龄为 40 %(4/ 10)  ,13 日龄组未表现发病症状和
死亡(0/ 10) 。大多数雏鸭在感染后 24～48 h 死亡 ,雏鸭临死前
出现明显的神经症状、抽搐 ,并很快死亡。剖检可见肝明显肿
胀 ,肝表面有大量的出血点、出血斑 ,死亡时间越短的病鸭其肝
表面出血越严重 ,96 h 左右死亡鸭肝表面出血点明显减少。
3 　小结和讨论
3. 1 　从北京和广西两地区发病鸭中分离到 2 株病毒 ,经过中和
试验表明两者为同一血清型 ,与 1 、3 型鸭肝炎病毒无血清学相
关性。此结果与临床上对发病鸭群使用 1 型鸭肝炎弱毒疫苗或
高免卵黄抗体进行预防或治疗无效相一致 ,另外从病理组织学
观察发现(另文报道)  , G 株病毒人工感染鸭引起的病变与 1 型
肝炎病毒有所不同。因此 ,本研究将分离到的病毒暂时定为新
型鸭肝炎病毒 ,对其理化及分子生物学特性有待于进一步研究 ,
从而确定其分类地位。
3. 2 　对分离株人工感染试验表明 ,2 株病毒对雏鸭的致病力有
很大的差异 ,在临床上由 B 株引起雏鸭的死亡率约为 20 % ,连
续感染的 5 批鸭雏均在 6 日龄开始出现死亡 ,12 日龄左右停止;
剖检死亡鸭可见肝肿胀、边缘树枝状充血 ,未见典型的肝出血变
化。由 G株感染雏鸭则表现为急性发病和大量死亡 ,与 1 型鸭
肝炎病毒感染极为相似。调查发现 ,由 B 株鸭肝炎病毒在临床
上引起的雏鸭发病 ,可能与鸭场的饲养管理条件差有一定的关
系。
参考文献:
[1 ] 　卡尔尼克B W. 禽病学[ M ] . 第10版. 高福 , 苏敬良. 北
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[2 ] 　Purchase H G, Arp L  H ,Domermuth C H , et  al  .  A laboratory
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[M ].   third  edition.   Kendall/ Hunt  Publishing  Company ,  Iowa
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[3 ] 　黄祯祥.  医学病毒学基础及实验技术 [M].  北京:科学出
版社 ,1990.