Ⅳ型鸭肝炎病毒鸡胚化弱毒疫苗的研制

peteryuanfeng

Ⅳ型鸭肝炎病毒鸡胚化弱毒疫苗的研制
郑献进1 ,2  , 张大丙1  , 曲丰发1 ,3  , 丁春宇1 ,4
(1. 中国农业大学动物医学院 农业部预防兽医学重点开放实验室 , 北京 海淀 100094 ;
2. 大成万达(天津) 有限公司 , 天津 西青 300380 ; 3. 中国质量认证中心 ,北京 丰台 100070 ;
4. 西班牙海博莱北京办事处 ,北京 海淀 100086)
摘要: 将一株 Ⅳ型鸭肝炎病毒(D HV) 用鸡胚传代 ,培育出 Ⅳ型鸭肝炎病毒 63 代鸡胚化弱毒疫苗株 E63 。该苗对 1 日龄
雏鸭安全无致病性 ,免疫剂量为 2. 5 ×105. 12 个 ELD50 / 只。用 E63 免疫 1 日龄雏鸭 ,7 日龄时即可产生高峰期中和抗体 ,并可
完全保护雏鸭抵抗同型强毒的攻击 ,此后中和抗体效价有所下降 ,但可持续至 4 周龄。疫苗在 -  20 ℃保存 3～6 个月后仍能保
持良好的免疫原性。
关键词: 鸭肝炎病毒;  Ⅳ型; 弱毒疫苗
中图分类号:S859. 79 　　　　文献标识码:A 　　　　文章编号:052926005 (2007) 1220006202
Development of a chicken2embryo2adapted attenuated vaccine
of  duck hepatitis type
Ⅳvirus
ZH EN G Xian2jin , ZHAN G Da2bing , QU  Feng2fa , DIN G Chun2yu
( Key Laboratory of  Preventive Veterinary Medicine of  Ministry of  Agriculture , College of
Veterinary Medicine , China Agricultural University , Beijing 100094 , China)
Abstract : A  63rd   chicken2embryo2adapted  duck  hepatitis  type   Ⅳvirus  vaccine  ( named  E63)  was ob2
tained t hrough serial passages of D HV in chick embryo s.   The  E63 was confirmed to  be  nonpat hogenic to
ducklings.   The immunizing do se was determined to  be at  2. 5 ×105. 12    ELD50 .  For t he immunized one2day2
old ducklings , serum neutralizing antibody titers  reach  t he peak and t he immunizatio n p rovided co mplete
p rotectio n against challenge wit h t he  homologous virulent  strain 7  days po stinoculation.   The  serum anti2
body titers could last for 4 weeks wit h a little bit  decrease.   The immunogenicity of  E63 was remained 3 -
6 mont hs when stored at   -  20 ℃.
Key  words : duck hepatitis type  Ⅳvirus ; vaccine
Corresponding author :  ZHAN G Da2bing
　　鸭病毒性肝炎是雏鸭的一种急性高度致死性疾
病 ,其发生和流行严重威胁着我国养鸭业的健康发
展。其病原是鸭肝炎病毒 ( duck  hepatitis  virus ,
D HV)  ,分为 3 个血清型 ,即 Ⅰ型、Ⅱ型和 Ⅲ型[ 1 ]   ,野
外还存在一类毒株 ,与 Ⅰ型仅有部分血清学相关性 ,
Sandhu 等(1992) 称之为 Ⅰa 型[ 2 ]  。1984 年 ,郭玉璞
和潘文石确定我国存在 Ⅰ型[ 3 ]   ,20 世纪 80 -  90 年
代 ,我国学者成功研制出良好免疫原性的 Ⅰ型
D HV 鸡胚化弱毒疫苗[ 4 -  6 ]   ,该苗的推广使用一度有
效地控制我国 Ⅰ型鸭肝炎的流行。然而 ,近几年来 ,
在我国许多地区 ,针对 Ⅰ型 D HV 所进行的主动免
疫或被动免疫并未能有效地控制鸭病毒性肝炎的暴
发。有学者认为我国出现了 Ⅲ型或某种新型[ 7 -  10 ]   ,
亦有学者分离到与 Ⅰ型存在明显抗原差异的 D HV
毒株[ 11 -  12 ]  。笔者的数据显示 , Ⅰ型仍是我国主要流
行的血清型 ,但在一些养鸭地区业已流行一种 Ⅰ型
的变异株 ,这类变异株与 Ⅰ型之间仅存在单向交叉
收稿日期:2006206207
作者简介:郑献进(19792)  ,男 ,硕士 ,从事动物病毒学研究
通讯作者:张大丙 ,  E2mail :zdb @cau. edu. cn
中和作用 ,颇似 Sandhu 等(1992) 提出的 Ⅰa 型[ 2 ]   ,
但由于未能获得 Ⅰa 型参考毒株 ,故暂将这类变异
株称为 Ⅳ型[ 13 ]  。因此 ,进一步研制 Ⅳ型 D HV 疫苗
对于我国鸭病毒性肝炎的控制是非常必要的。
1 　材料与方法
1. 1 　实验动物和鸡胚 　1 日龄雏鸭和 9 日龄鸡胚
分别购自中国农业科学院北京畜牧兽医研究所和中
国农业大学动物科技学院畜牧场。
1. 2 　毒株 　Ⅰ型 D HV 鸡胚化弱毒疫苗株 C80 和
强毒株 C1 H 。Ⅳ型 D HV 毒株 E3 ,2001 年从河北
某鸭场分离 ,用雏鸭将 E3 返强 4 代后作为攻毒用
强毒 ,命名为 E3 H 。
1. 3 　Ⅳ型 D HV 鸡胚化弱毒株的培育 　将 E3 接种
于 9 日龄鸡胚尿囊腔 ,收获 24h 后死亡鸡胚尿囊液 ,
再接种于鸡胚 ,连续传代至 63 代 ,命名为 E63 。收
获 24～48 h 死亡鸡胚的胚胎、尿囊液和绒毛尿囊膜
制成匀浆 ,加庆大霉素抑菌 ,经无菌检验后作为疫
苗 , -  20 ℃保存。按常规方法测定其 ELD50  。
1. 4 　安全性检测 　取 1 日龄雏鸭 30 只 ,分为 3 组 ,
每组 10 只。两组分别经颈部皮下和腿肌接种未稀
6 中国兽医杂志 2007 年(第 43 卷) 第12 期 　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　 Chinese Journal of  Veterinary Medicine 　　
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释的疫苗毒1 mL/ 只 ,第 3 组为不接种对照组。1 周
后 ,对所有鸭只进行剖检。
1. 5 　免疫剂量的测定 　用灭菌生理盐水将 E63 分
别进行 10 倍、20 倍和 100 倍稀释。取 1 日龄雏鸭
40 只 ,分为 4 组 ,每组 10 只。3 个组分别免疫上述
3 个稀释度的疫苗 ,每只鸭均经颈部皮下接种 0. 5
mL ,每只鸭的免疫剂量分别为 5  ×105. 12  、2. 5  ×
105. 12 和 5 ×104. 12    ELD50   ,第 4 组为不免疫对照组。
于 7 日龄时经腿部肌肉注射强毒 E3 H ,0. 5 mL/ 只 ,
观察 1 周。
1. 6 　中和抗体效价的测定 　取 1 日龄雏鸭 35 只 ,
分为 2 组。第 1 组 20 只按确定的免疫剂量经颈部
皮下接种疫苗 ,0. 5  mL/ 只;第 2 组 15 只为不免疫
对照组。在雏鸭 1 、2 、3 、4 周龄时分别采血分离血
清。用固定血清2稀释病毒的方法进行鸡胚中和试
验 ,并计算中和指数。
1. 7 　疫苗的保存期测定 　用确定的免疫剂量免疫
1 日龄雏鸭 , 设不免疫对照组 , 7 日龄攻毒。检测
-  20 ℃保存 3 个月和 6 个月的 E63 。
1. 8 　疫苗交叉保护试验 　用灭菌生理盐水将 Ⅰ型
疫苗 C80 和 Ⅳ型疫苗 E63 分别进行 20 倍稀释。取
1 日龄雏鸭 60 只 ,分为 6 组 ,每组 10 只。第 1 组和
第 2 组免疫 E63 株 ,第 3 组和第 4 组免疫 C80 株 ,
均为颈部皮下接种 0. 5  mL/ 只 ,第 5 组和第 6 组为
非免疫对照组 ,隔离饲养。于 7 日龄时 ,第 1 、3 、5 组
接种 Ⅳ型强毒株 E3 H ,第 2 、4 、6 组接种 Ⅰ型强毒株
C1 H ,均为腿部肌肉注射 0. 5 mL/ 只。观察 1 周。
1. 9 　抗血清交叉保护试验 　按文献[ 13 ]制备兔抗
C80 和 E63 的血清。取 1 日龄雏鸭 60 只 ,分为 6
组 ,每组 10 只。第 1 、2 组经颈部皮下注射兔抗 E63
株血清 ,第 3 、4 组以同样的途径注射兔抗 C80 株血
清 ,每只均接种 0. 5 mL ;第 5 、6 组为对照组 ,不注射
血清。24 h 后 ,第 1 、3 、5 组经腿部肌肉注射 Ⅳ型强
毒 E3 H ,第 2 、4 、6 组经腿部肌肉注射 Ⅰ型强毒株
C1 H ,0. 5 mL/ 只。饲养 1 周。
1. 10 　计算保护指数(p rotective index ,  PI)  　按公
式 PI = (对照组死亡率 -  免疫组死亡率) / 对照组死
亡率 ×100 。
2 　结果
2. 1 　Ⅳ型 D HV 鸡胚化弱毒株 E63 的培育 　最初
几代 ,鸡胚在接种后 60  h 左右死亡 ,传至 63 代 ,所
有接种鸡胚均在 24 ～ 48  h  死亡 , 其 ELD50   为
10 -  6. 12 / 0. 1mL 。死亡鸡胚的胚体表现为出血、水
肿、矮小化 ,部分鸡胚肝脏有较明显的坏死灶 ,有些
死亡鸡胚的肝脏变绿。
2. 2 　E63 的安全性 　1 日龄雏鸭免疫疫苗原液后
无发病和死亡 ,剖检未见肉眼可见的大体病变。
2. 3 　E63 的免疫剂量 　免疫 5 ×105. 12 个 ELD50 和
2. 5 ×105. 12 个 ELD50 的 E63 后 ,雏鸭可获得完全保
护 ,而免疫5 ×104. 12 个 ELD50 的 E63 后 ,疫苗所产生
的保护指数有所下降 ,见表 1 。为了获得 100 %的攻
毒保护 ,在随后的试验中 ,均以 2. 5 ×105. 12 个 ELD50
作为免疫剂量。
2. 4 　E63 的保存期 　-  20 ℃保存 3 个月 , E63 能完
全保护雏鸭抵抗同源强毒的攻击;保存 6 个月 , E63
仍能给雏鸭提供有效的保护 ,但所产生的保护率和
PI 略有下降 ,见表 2 。
表 1 　疫苗株 E63 的免疫剂量
组别   免疫剂量( ELD50 / 只)   死亡数/ 攻毒数(只)      PI( %)
免疫组1 5. 0 ×105. 12
0/ 10
100
免疫组2 2. 5 ×105. 12
0/ 10
100
免疫组3 5. 0 ×104. 12
2/ 10
75
对照组 -
8/ 10
-
表 2 　疫苗株 E63 的保存期
组别     死亡数/ 攻毒数(只)        保护率( %) PI( %)
3 月 0/ 10
100
100
6 月 1/ 10
90
87. 5
对照组 8/ 10
-
-
2. 5 　中和抗体的产生 　雏鸭 1 日龄时免疫 E63 ,1
周龄、2 周龄、3 周龄和 4 周龄时的中和指数分别为
101. 90  、101. 7  、101. 51  、101. 15  。
2. 6  　Ⅰ型和 Ⅳ型弱毒疫苗的交叉保护 　Ⅰ型
D HV 鸡胚化弱毒疫苗株 C80 和 Ⅳ型 D HV 鸡胚化
弱毒疫苗株 E63 均能完全保护雏鸭抵抗同型强毒
的攻毒。但用异型强毒攻毒的结果表明 , Ⅰ型和 Ⅳ
型之间仅存在单向低度交叉保护 ,见表 3 。
表 3 　Ⅰ型和 Ⅳ型 D HV鸡胚化弱毒疫苗的交叉保护试验
疫苗株      血清型
攻毒毒株(血清型)
C1 H ( Ⅰ型)
E3 H ( Ⅳ型)
C80
Ⅰ型       0/ 10 (100)
4/ 10 (55. 6)
E63
Ⅳ型       5/ 10 (37. 5)
0/ 10 (100)
对照 8/ 10
9/ 10
　　结果指死亡数/ 攻毒数( PI %)
2. 7 　Ⅰ型和 Ⅳ型抗血清的交叉保护 　Ⅰ型和 Ⅳ型
抗血清均可完全保护雏鸭抵抗同型强毒的攻击 ,但
针对异型强毒的攻毒只能产生单向低度交叉保护作
用 ,见表 4 。
表 4 　Ⅰ型和 Ⅳ型抗血清的交叉保护试验
抗血清      血清型
攻毒毒株(血清型)
C1 H ( Ⅰ型)
E3 H ( Ⅳ型)
C80
Ⅰ型       0/ 10 (100)
4/ 10 (55. 6)
E63
Ⅳ型       6/ 10 (25)
0/ 10 (100)
对照组         -
8/ 10
9/ 10
　　结果指死亡数/ 攻毒数( PI %)
3 　讨论
检测结果表明 , Ⅳ型 D HV 毒株 E3 经过 9 日龄
鸡胚传代 63 代后 ,所获得的鸡胚适应毒株 E63 是
一株具有良好免疫原性的鸡胚化弱毒疫苗株。该苗
对雏鸭安全无致病性 , 免疫剂量为 2. 5 ×105. 12  个
ELD50   ,保存期为 -  20 ℃,3～6 个月。雏鸭 1 日龄时
经颈部皮下注射鸡胚化弱毒疫苗 E63 ,1 周龄时即
可产生高峰期的中和抗体 ,随后抗体水平有所下降 ,
至 4 周龄时仍可检测到一定水平的中和抗体。由于
鸭肝炎自然暴发时 ,多发生于 3 周龄内雏鸭 ,特别是
1～2 周龄的雏鸭 ,结合攻毒保护试验和中和抗体的
监测结果 ,可认为给1日龄雏鸭免疫鸡胚化弱毒疫
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　　Chinese Journal of  Veterinary Medicine 　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　 中国兽医杂志 2007 年(第 43 卷) 第 12 期
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内源性绵羊肺腺瘤病毒 NM 株 pol
基因的克隆与序列分析
王 　宇 , 刘淑英 , 韩 　敏 , 李建云
(内蒙古农业大学动物科学与医学学院 , 内蒙古 呼和浩特 010018)
摘要: 参照 GenBank 中内源性绵羊肺腺瘤病毒 enJ S56A1 株 pol 基因序列设计了 2 对引物。应用 PCR 技术特异性地扩
增出病毒的 pol 基因片段 ,将其克隆到 PMD192T 载体后测序。应用计算机软件将测定序列与内源性南非代表毒株 enJ S56A1
(A F153615) 的 pol 基因序列比较 ,核苷酸同源性为 99. 3 % ,推导出的氨基酸同源性为 95. 0 %。与外源性南非代表株J SRV2
SA (M80216) 的 pol 基因序列比较 ,核苷酸同源性为 99. 0 % ,氨基酸同源性为 99. 3 %。这也是我国首次报道的内源性绵羊肺
腺瘤病毒 pol 基因序列 ,为我国科研工作者进行更深入的研究奠定基础。
关键词: 内源性绵羊肺腺瘤病毒;  pol 基因; 克隆; 序列分析
中图分类号:Q78 　　　　文献标识码:A 　　　　文章编号:052926005 (2007) 1220008202
Cloning and sequence analysis of  pol gene of  the  Inner Mongolia strain
of endogenous jaagsiekte sheep retrovirus
WAN G Yu , L IU  Shu2ying ,  HAN  Min , L I Jian2yun
(College of  Animal  Science and Animal Medicine ,  Inner Mongolia Agricultural University ,  Huhhot 010018 , China)
　　收稿日期:2006207212
基金项目:国家自然科学基金(30560108)
作者简介:王宇(19812)  ,男 ,硕士 ,主要从事动物临床内科学和动
物毒物检验学研究 , E2mail :hhhtwangyu @sina. com
通讯作者:刘淑英 , E2mail :liushuying_imau @126. com
苗 E63 ,能有效地保护雏鸭安全度过易感期。该疫
苗株与 Ⅰ型弱毒疫苗的抗体消长曲线基本一致[ 5 ]   ,
但总体上 E63 所产生的抗体水平要低。因此 ,还需
进一步提高其 ELD50 以获得更高水平的中和抗体。
基于此 ,本试验暂未进行 E63 的毒力返强试验。
交叉保护试验结果表明 , Ⅰ型和 Ⅳ型 D HV 的
鸡胚化弱毒疫苗或高免血清均能有效地保护雏鸭抵
抗同型强毒的感染 ,但对异型强毒的攻毒缺乏足够
的交叉保护。本实验室于 2001 -  2005 年间从北京、
河北、山东、江苏、内蒙古、重庆等地分离到 10 株
DHV ,血清型鉴定结果表明 ,来自内蒙和山东的 2 株
属于Ⅰ型 ,来自河北、江苏和重庆的 4 株属于 Ⅳ型 ,而
北京地区的 4 株病毒中既包括Ⅰ型 ,也包括 Ⅳ型。结
合已有的研究成果[11 -  12 ]   ,可以认为 ,从上世纪末至
今 ,Ⅰ型D HV 在我国仍呈普遍流行的趋势 ,但至少在
10 年前我国就已存在Ⅰ型 D HV 的抗原变异株 ,且变
异株业已广泛流行于我国北京、河北、重庆、江苏、福
建、广东等地 ,因此 ,在这些地区 ,若仅针对Ⅰ型 D HV
进行被动免疫或主动免疫 ,免疫效果势必表现为不确
实。结果提示 ,进一步研制Ⅰ型和 Ⅳ型二价疫苗对于
有效控制我国雏鸭病毒性肝炎的发生和流行是至关
重要的 ,而对于暴发鸭病毒性肝炎的鸭群 ,必需注射Ⅰ
型2 Ⅳ型二价抗体 ,方可获得较好的治疗效果。
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8 中国兽医杂志 2007 年(第 43 卷) 第12 期 　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　 Chinese Journal of  Veterinary Medicine 　　
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四型鸭肝炎？暂时还没听说过