纤维素酶活力的测定方法

和兴

1．纤维素酶的活力单位定义：
在50℃，pH为4.8条件下，每分钟从浓度为10mg/mL的羧甲基纤维素钠溶液中释放1μmol还原糖所需要的酶量为一个活力单位（IU）。
2．测定原理
在50℃，pH为4.8条件下纤维素酶水解纤维素，产生分子量较小的聚合物和还原糖，还原糖可将3，5-二硝基水杨酸中的硝基还原成橙色的氨基化合物。利用比色法测出还原糖的量，从而计算出酶活力。
3．试剂和溶液
3．110.0mg/mL 的葡萄糖溶液
称取的无水葡萄糖1.0000g加水溶解后定容至100mL。
3．20.05 mol/L的柠檬酸盐酸性缓冲液
a、0.5mol/L柠檬酸溶液
准确称取105.0g柠檬酸完全溶解于800mL的蒸馏水中，定容至1000mL，标记为A溶液；
b、0.5mol/L柠檬酸三钠溶液
准确称取147.0g柠檬酸三钠完全溶解于800mL的蒸馏水中，定容至1000mL，标记为B溶液；
c、0.5mol/L的柠檬酸钠缓冲液
取600mL的A液与1000mL的B液充分混匀，标记为C液。
d、0.05mol/L的柠檬酸盐酸性缓冲液（pH=4.80）
取C液1000mL加入到8000mL 的蒸馏水中，必要时用3mol/L的盐酸溶液或3mol/L的氢氧化钠溶液调pH为4.80，再定容10000mL，混匀后标记为0.05mol/L的酸性缓冲液，同时标记pH=4.80、配制日期。在4℃冰箱内保存。
3．31.0％CMC底物
精密称取羧甲基纤维素钠1.0000g溶于80mL0.1mol/L的酸性缓冲液中，室温下磁力搅拌至完全溶解(3小时以上)。用3mol/L盐酸溶液或3mol/L的氢氧化钠溶液调pH值为4.80，再用0.05mol/L的酸性缓冲液定容在100mL的容量瓶中。标记为1.0%酸性羧甲基纤维素钠溶液，同时标记pH=4.80、配制日期。保存在4℃的冰箱内。使用前恢复到室温并摇均。
3．4DNS试剂
溶解10.0g 3，5-二硝基水杨酸、16g氢氧化钠和300g酒石酸钾钠于约700mL蒸馏水中，加热搅拌使完全溶解至澄清，放至常温并定容至1000mL，置棕色试剂瓶中，暗处保存一个星期后使用。
4．仪器和设备
4．1 分析天平：感量0.0001g
4．2 精密pH计：精确至0.01
4．3 磁力加热搅拌器
4．4 分光光度计：应符合GB9721有关规定，5mm比色皿
4．5 电热恒温水浴锅：30-100℃，±0.1℃
4．6 计时器：每小时误差不超过五秒
4．7 移液器：100-1000μl
4．8 微样进量器：0-50μl
5．标准曲线的绘制
取8支试管按下表加入试剂，稀释葡萄糖标准液；再加入3mL DNS试剂。充分混匀置沸水中煮10min，水浴冷却后，用0号试管做对照在540nm下测其它试液的吸光度。以吸光度为纵坐标，以葡萄糖含量为横坐标绘制标准曲线。

试管号	0	1	2	3	4	5	6	7
缓冲液加入量（μL）	500	490	480	475	470	465	460	455
葡萄糖标准液（μL）	0	10	20	25	30	35	40	45
葡萄糖含量（μg）	0	100	200	250	300	350	400	450

6．待测酶液的制备
精密称取固体原酶粉1.0000g溶于80mL蒸馏水中（稀释倍数≤100倍直接用缓冲液溶解）；室温下磁力搅拌15min以上，用100mL容量瓶定容，离心后取上清液用缓冲液稀释，使其吸光度在0.2-0.25之间。
7．水平控制液的制备
吸取1.0mL纤维素酶标准液，（标示酶活力为2500IU/Ml），用0.05mol/L的柠檬酸盐酸性（pH=4.80）的缓冲液稀释10000倍。新鲜水平控制液需现配现用。
8．测定步骤
8．1 取三支试管各加入0.5mL底物，与待测酶液一起在50℃（±1℃）水浴中预热5min。
8．2在第一、二试管中各加入0.5mL的待测酶液，50℃水浴中反应10min。
8．3 在三支试管中各加入3mL 的DNS试剂，然后在第三支试管中加入0.5mL的待测酶液。
8．4摇匀三支试管后，在沸水浴中煮10min。
8．5水浴冷却至室温后，以第三支试管为对照在540nm条件下测第一、二支试管的吸光值。吸光值以0.2-0.25之间为宜，若不在此范围内可改变稀释倍数重做。
9．结果计算
酶活力（IU/g或IU/mL）=（葡萄糖等量值/180/10/0.5）×n
式中：180指葡萄糖从微克换算成微克分子数
10指待测液与低物的反应时间
0.5指低物反应的待测酶液量
n指原酶液的稀释倍数
10．允许分析结果可以接受标准：
10．1允许总分析误差范围，两次取样并且检测结果相对误差小于10%。
10．2水平控制检测酶活力与标准酶活力误差小于10%
10．3标准曲线至少由5点组成

fjcwr

这是国家标准的检测方法吗?

lichoushui

问一下楼主DNS试剂为什么不加苯酚和亚硫酸钠？这对酶活有没影响？会不会影响显色颜色？和国标相差较大

游人学子

？？？自主研发的方法吗？还是厂家提供的？

lichoushui

不是啊
是QB2583-2003