木聚糖酶酶活力的测定方法

和兴

1．木聚糖酶的活力单位定义：
在50℃，pH为6.50条件下，每分钟从浓度为10mg/mL的燕麦木聚糖溶液中释放1μmol还原糖所需要的酶量为一个活力单位（IU）。
2．测定原理
在50℃，pH为6.50条件下木聚糖酶水解木聚糖，产生分子量较小的聚合物和还原糖，还原糖可将3，5-二硝基水杨酸中的硝基还原成橙色的氨基化合物。利用比色法测出还原糖的量，从而计算出酶活力。
3．试剂和溶液
3.1 10.0mg/mL 的木糖溶液
称取的无水木糖1.0000g加水溶解后定容至100mL。
3.20.05mol/M 的磷酸二氢钠-磷酸氢二钠中性缓冲液
a、 0.5mol/L磷酸二氢钠溶液
准确称取39.0g磷酸二氢钠完全溶解于400mL的蒸馏水中，定容至500mL，标记为A溶液；
b、0.5mol/L磷酸氢二钠溶液
准确称取89.5g磷酸氢二钠完全溶解于400mL的蒸馏水中，定容至500mL，标记为B溶液；
c、0.5mol/L的磷酸盐缓冲液
取342.5mL的A液与157.5的B液混匀，标记为C液。
d、0.05mol/L的中性缓冲液（pH=6.50）
取C液500mL加入到4000mL 的蒸馏水中，必要时用3mol/L的盐酸溶液或3mol/L的氢氧化钠溶液调pH为6.50，再定容5000mL，混匀后标记为0.05mol/L的中性缓冲液，同时标记pH=6.50、配制日期。在4℃冰箱内保存。
3．31.0％木聚糖溶液（底物）
精密称取燕麦木聚糖1.0000g溶于40mL0.1mol/L的氢氧化钠溶液中，室温下磁力搅拌12小时以上。用3mol/L盐酸溶液或3mol/L的氢氧化钠溶液调pH值为6.5，加0.05mol/L的磷酸氢二钠-磷酸二氢钠中性缓冲液至90mL，再调pH值为6.50，然后用0.05mol/L的磷酸氢二钠-磷酸二氢钠中性缓冲液定容至100mL。标记为1.0%木聚糖底物，同时标记pH=6.50、配制日期。保存在4℃的冰箱内。
3．4DNS试剂
溶解10.0g 3，5-二硝基水杨酸、16g氢氧化钠和300g酒石酸钾钠于约700mL蒸馏水中，加热搅拌使完全溶解至澄清，放至常温并定容至1000mL，置棕色试剂瓶中，暗处保存一个星期后使用。
4．仪器和设备
4．1 分析天平：感量0.0001g
4．2 精密pH计：精确至0.01
4．3 磁力加热搅拌器
4．4 分光光度计：应符合GB9721有关规定，5mm比色皿
4．5 电热恒温水浴锅：30-100℃，±0.1℃
4．6 计时器：每小时误差不超过五秒
4．7 移液器：100-1000μl
4．8 微样进量器：0-50μl
5．标准曲线的绘制
取8支试管按下表加入试剂，稀释木糖标准液；再加入3mL DNS试剂。充分混匀置沸水中煮5min，水浴冷却后，用0号试管做对照在540nm下测其它试液的吸光度。以吸光度为纵坐标，以木糖含量为横坐标绘制标准曲线。

试管号	0	1	2	3	4	5	6	7
缓冲液加入量（μL）	500	490	480	475	470	465	460	455
1.0%中性木聚糖酶底物（μL）	500	500	500	500	500	500	500	500
木糖标准液（μL）	0	10	20	25	30	35	40	45
木糖含量	0	100	200	250	300	350	400	450

6．待测酶液的制备
精密称取固体原酶粉1.0000g溶于80mL蒸馏水中（稀释倍数≤100倍直接用缓冲液溶解）；室温下磁力搅拌15min以上，用100mL容量瓶定容，离心后取上清液用缓冲液稀释，使其吸光度在0.2-0.25之间。
7．水平控制液的制备
称取1.000木聚糖标准品（标示酶活力为5000IU/mL），溶于80mL蒸馏水中，室温下磁力搅拌5min以上，用100mL容量瓶定容，离心后取上清液用0.05mol/L的磷酸氢二钠-磷酸二氢钠中性（pH=6.50）的缓冲液稀释300倍。新鲜水平控制液需现配现用。
8．测定步骤
8．1 取三支试管各加入0.5mL底物，与待测酶液一起在50℃（±1℃）水浴中预热5min。
8．2在第一、二试管中各加入0.5mL的待测酶液，50℃水浴中反应15min。
8．3 在三支试管中各加入3mL 的DNS试剂，然后在第三支试管中加入0.5mL的待测酶液。
8．4摇匀三支试管后，在沸水浴中煮10min。
8．5水浴冷却至室温后，以第三支试管为对照在540nm条件下测第一、二支试管的吸光值。吸光值以0.2-0.25之间为宜，若不在此范围内可改变稀释倍数重做。
9．结果计算
酶活力（IU/g或IU/mL）=（木糖等量值/150/15/0.5）×n
式中：150指木糖从微克换算成微克分子数
15指待测液与低物的反应时间
0.5指低物反应的待测酶液量
n指原酶液的稀释倍数
10．允许分析结果可以接受标准：
10．1允许总分析误差范围，两次取样并且检测结果相对误差小于10%。
10．2水平控制检测酶活力与标准酶活力误差小于10%
10．3标准曲线至少由五点组成

崔若伟

这种测定方法的名称叫什么？

yaya200199

分光光度计法测木聚糖酶活性，这个方法跟国标的不太一样啊。

y242168

呵呵现在没有燕麦木聚糖了只有桦木木聚糖。还有你的底物溶解时有问题的，你测定的结果会有误差。在说饲用类木聚糖酶测定时和工业用木聚糖酶在测定时的温度有差异。要考虑到你的木聚糖酶的作用动物体生理活性温度。