木聚糖酶酶活检测

JH_C

底物1%燕麦木聚糖经冰冻保存取出后，会产生沉淀，能否继续使用？

tgz5637

碱溶解法制备，2天内使用无碍。热溶解法一天以上，最好重配。

测木聚糖，燕麦木聚糖用热溶解法制底物，不是很好选择。底物本身的葡萄糖含量高不说，水溶性也不如桦木木聚糖。

   现在一直宣传在饲料用木聚糖酶测定应该采用燕麦木聚糖，我认为是误区，因为这么说的人，忘了不论你换什么底物来测某一品牌的木聚糖酶，该品牌木聚糖酶都是同一种工程菌发酵生产的。它的催化能力，自做成成品后就已经固定下来了。行业标准是控制不了这一点的。因此对该木酶的酶活检测只存在准确与否的问题，而不是什么底物的问题。桦木也好，燕麦也好，只是一个折算的问题。

[ 本帖最后由 tgz5637 于 2008-7-16 12:44 编辑 ]

JH_C

谢谢指点！
有点厂家采用碱溶加热溶的方法。其实关于底物的选择和使用，只是现在行业内没有一个统一的标准，才会出现五花八门的局面。如此说来，使用桦木木聚糖的结果应比燕麦木聚糖的低，一般会低多少呢？在其它检测条件一致的情况下。

tgz5637

桦木木聚糖底物，测过两个牌子 x502, fluck 95588, 结果相近，可以认为几乎等同，可能都属于sigma公司旗下不同品牌，但原料来源一样。按Lot号码查看XYLOSE含量很接近，误差更多来自标准曲线差异。
      燕麦木聚糖x0627不同年份的葡萄糖含量似乎差异大，不知是个别还是普遍，（但想想这些原料象葡萄一样，应该是不同年份不同含量，只是没有红酒那样的价格差异罢了。） 如用x0627 ，最好用碱溶法制备底物，热熔法不容易溶解，要长时间搅拌（确切的说是，不应在酸性条件下溶解，溶完再调pH,可避免减少还原糖发生酸水解。但方法没有强调，我自己按糖类性质分析的。），加热过度可能发生水解，底物空白显色很深，导致结果很低。
     测定结果，不同的木聚糖酶，不同的机器测定结果，差异大 enzymex0627:enzyme0502=2~1.7

[ 本帖最后由 tgz5637 于 2008-7-16 15:28 编辑 ]

JH_C

非常感谢tgz的帮助！:tiaotiao:
      我使用的是S－0627的木聚糖，用碱溶法，配制当天为均匀的混悬体，放置-16度保存第二天取出，就有沉淀析出，50度水浴30分钟也不能重新溶解，按分析，是溶解性问题还是已经发生水解。

tgz5637

燕麦x0627,x0376溶解性就是这样的，放置久了，里面的不溶物悬浮颗粒自然沉降（我倒是希望，有人测测这些不溶物是否就是水不溶性木聚糖），但由于底物浓度一般是饱和浓度，用前搅拌，及每次加入试管前都振荡一下。测定结果与刚配的差异不大，不搅拌吸取的是上清液，可能造成试管中底物浓度偏低。

底物放置久，3天以上，测定结果偏大（之前说的时间，也是指冷藏非冷冻）。  冷冻时间可以好长，试过一个月都可用，要加个已知酶活做参照。

yzlingyz

曾和其它负责技术的同事一同讨论过关于用DNS方法来测木聚糖酶活性，大致认同用DNS方法测木聚糖酶活性得出的结论和实际运用效果不具有相关性，其只能表明如果结果酶活高，其外切酶的活性高；真正具有相关性的方法应该是测粘度的方法，其得出的结果与实际应用效果一致度较高，但其需要粘度计及丰富的经验才可，且所需时间较长。希望国家相关的机构能尽快制定相关的标准。以上观点只是探讨，仅提供参考。

tgz5637

那就得有人再出8万元，来再搞个标准了。
粘度法不是一般饲料企业能够做的，而用染色法测的问题与滤纸法测纤维素酶的问题一样，是在底物不饱和条件下检测，可定性半定量比较，是较可取的方法。

wangyong000216

其实无论木聚糖底物是通过碱溶解也好，还是沸水煮沸溶解也罢，都有各自的局限性。前者通过添加氢氧化钠使木聚糖溶解如缓冲液中，其中在溶解的过程中木聚糖分子结构就已经被强碱破坏了，才使得木聚糖底物全部溶于溶液中（正常的木聚糖，他的溶解性较差），因此所测出的酶活并不能真正反映出对实际饲料中木聚糖的水解活性。而后者通过沸水煮沸，然后离心取木聚糖上清液作为底物溶液，这样测定出来的酶活则只能反应出对可溶性木聚糖的水解活性。