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内容提要：免疫血清学技术是利用抗原抗体特异性反应的原理建立的各种检测与分析技术，以及建立这些技术的各种制备方法。可分为免疫血清学技术、细胞免疫技术和免疫制备技术。免疫血清学技术的基本类型、反应特点、影响因素；细胞免疫技术的种类、基本原理；免疫制备技术的基本原理与方法；免疫技术的应用及其发展趋势等是本章的重点掌握内容。
免疫学技术是指利用免疫反应的特异性原理，建立各种检测与分析技术以及建立这些技术的各种制备方法，包括1）用于抗原或抗体检测的体外免疫反应技术，或称免疫检测技术，这类技术一般都需要用血清进行试验，故又称为免疫血清学反应或免疫血清学技术；2）用于研究机体细胞免疫功能与状态的细胞免疫技术；3）用于建立免疫检测方法的免疫制备技术，如抗体或抗原的纯化。凡是与免疫有关的技术都可称为免疫技术。免疫技术已广泛应用于人、动物、植物和微生物等生物科学的各个领域，成为生物科学研究不可缺少的工具。
抗原与相应抗体在体内和体外均能发生特异性结合反应，因抗体主要来自血清，因此在体外进行的抗原抗体反应称为血清学反应或免疫血清学技术，是建立在抗原抗体特异性反应基础上的检测技术。免疫血清学技术自19世纪建立了最早和最简单的凝集试验开始，不断发展，尤其是近20年来，各种新方法、新技术层出不穷，应用面也日益扩大，已深入到生物学科的各个研究领域。
一、免疫血清学技术的类型
免疫血清学技术按抗原抗体反应性质不同可分为：凝聚性反应（包括凝集试验和沉淀试验）、标记抗体技术（包括荧光抗体、酶标抗体、放射性标记抗体、发光标记抗体技术等）、有补体参与的反应（补体结合试验、免疫粘附血凝试验等）、中和反应（病毒中和试验、毒素中和试验）等已普遍应用的技术，以及免疫复合物散射反应（激光散射免疫技术）、电免疫反应（免疫传感器技术）、免疫转印（Western Blotting）和建立在抗原抗体反应基础上的免疫蛋白芯片技术等新技术（表14-1）。
二、免疫血清学反应的一般特点
（一）特异性与交叉性 血清学反应具有高度特异性，如抗猪瘟病毒的抗体只能与猪瘟病毒结合，而不能与口蹄疫病毒结合。这是血清学试验用于分析各种抗原和进行疾病诊断的基础。
但若两种天然抗原之间含有部分共同抗原时，则发生交叉反应。例如鼠伤寒沙门氏菌的血清能凝集肠炎沙门氏菌，反之亦然。一般血缘越近，交叉反应的程度也越高。除相互交叉反应外，也有表现为单向交叉的，单向交叉在选择疫苗用菌（毒）株时有重要意义。
交叉反应是区分血清型和亚型的重要依据，两个菌（毒）株间交叉反应程度通常以相关系数（R）表示，R＝ ×100%。其中r1＝异源血清效价1∕同源血清效价1，r2＝异源血清效价2∕同源血清效价2。
通常以R值的大小判定型和亚型，R>80%时为同一亚型，R在25%和80%之间为同型的不同亚型，R<25%时为不同的型。但这一标准视具体对象不同而异。
在亚型鉴定时，不仅要注意R值，还应重视r1和r2的值，如r1显著高于r2时则为单向交叉，若用作疫苗株筛选，应选用r1的毒株作疫苗株，以扩大应用范围。
file:///C:/DOCUME~1/ADMINI~1/LOCALS~1/Temp/msohtml1/01/clip_image004.gif（二）抗原与抗体结合机理 抗原和抗体的结合为弱能量的非共价键结合，其结合力决定于抗体的抗原结合位点与抗原表位之间形成的非共价键的数量、性质和距离，由此可分为高亲和力、中亲和力和低亲和力抗体。抗原与抗体的结合是分子表面的结合，这一过程受物理化学的、热力学的法则所制约，结合的温度应在0~40℃范围内，pH在4~9范围内。如温度超过60℃或pH降到3以下时，则抗原抗体复合物又可重新离解。利用抗原抗体既能特异性地结合，又能在一定条件下重新分离这一特性，可进行免疫亲和层析，以制备免疫纯的抗原或抗体。
抗原与抗体在适宜的条件下就能发生结合反应。但对于常规的血清学反应，如凝集反应、沉淀反应、补体结合反应等，只有在抗原与抗体呈适当比例时，结合反应才出现凝集、沉淀等可见反应结果，在最适比例时，反应最明显。这种因抗原过多或抗体过多而出现抑制可见反应的现象，称为带（zone）现象。凝集反应时，因抗原为大的颗粒性抗原，容易因抗体过多而出现前带现象，因而需将抗体作递进稀释，而固定抗原浓度。相反，沉淀反应的抗原为小分子的可溶性抗原，因抗原过量而出现后带现象，通过稀释抗原，以避免抗原过剩。通常以格子学说解释带现象，即大多数抗体为二价（IgM），而大多数抗原则为多价，只有两者比例适当时，才能形成彼此连接的大的复合物，而抗原过多或抗体过多时，形成的单个复合物不能连接成可见的复合物。为了克服带现象，在进行血清学反应时，需将抗原和抗体作适当稀释，通常是固定一种成分而稀释另一种成分。为了选择抗原和抗体的最适用量，也可同时递进稀释抗原和抗体，用综合变量法进行方阵测定。
在新的免疫检测技术（如标记抗体技术）中，通常检测微量的抗原或抗体，反应中容易出现抗体或抗原过量，但因其检测的灵敏度高，只要有小的单一复合物存在即可被检测出来，因此不受带现象的限制。但在这些试验中，为了获得更好的特异性和敏感性，也需要用综合方阵变量法滴定抗原和抗体的最宜用量。
血清学反应存在二阶段性，但其间无严格的界限。第一阶段为抗原与抗体的特异性结合阶段，反应快，几秒钟至几分钟即可，但无可见反应。第二阶段为抗原与抗体反应的可见阶段，表现为凝集、沉淀、补体结合等反应，反应进行较慢，需几分钟、几十分钟或更久，实际上是单一复合物凝聚形成大复合物的过程。第二阶段反应受电解质、温度、pH等的影响，如果参加反应的抗原是简单半抗原，或抗原抗体比例不合适，则不出现反应。标记抗体技术中由于检测的不是抗原抗体的可见反应，而是检测标记分子，因此严格地说也不存在第二阶段反应，试验通常所用30min到1h，主要是使第一阶段反应更充分。
（三）免疫血清学反应的影响因素 影响免疫血清学反应的因素主要有电解质、温度、pH等。
1．电解质
特异性的抗原和抗体具有对应的极性基（羧基、氨基等），它们互相吸附后，其电荷和极性被中和因而失去亲水性，变为憎水系统。此时易受电解质的作用失去电荷而互相凝聚、发生凝集或沉淀反应。因此需在适当浓度的电解质参与下，才出现可见反应。故血清学反应一般用生理盐水作稀释液，标记抗体技术中，用PBS作稀释液。但用禽类血清时，需用8%~10%的高渗氯化钠溶液，否则不出现反应，或反应微弱。
2．温度
较高的温度可以增加抗原和抗体接触的机会，从而加速反应的出现。将抗原、抗体充分混合后，通常放在37℃水浴中，保温一定时间，可促使二个阶段的反应。亦可用56℃水浴则反应更快。有的抗原或抗体系统在低温长时间结合反应更充分，如有的补体结合反应在冰箱低温结合效果更好。
3．酸碱度 血清学反应常用pH为6~8，过高或过低的pH可使抗原抗体复合物重新离解。如pH降至抗原或抗体的等电点时，可引起非特异性的酸凝集，造成假象。
细胞免疫技术是指与细胞免疫有关的各种检测技术，包括对其免疫细胞、免疫因子的检测及功能分析。由于人们越来越认识到细胞免疫在肿瘤、病毒感染等疾病免疫中的重要性，使近几年来细胞免疫技术在医学研究与临床中尤为活跃。
根据被检测的物质性质不同可将细胞免疫技术分为淋巴细胞计数及分类技术、淋巴细胞功能试验技术和免疫细胞因子检测技术以及体内细胞免疫试验等四大类。
| | | | | | | | 淋巴细胞分类与计数
| E花环试验
T细胞亚群检测技术
| | | | | | 淋巴细胞功能测定
| 淋巴细胞转化试验
细胞毒性T细胞试验
巨噬细胞移动抑制试验
| | | | | | 免疫细胞因子测定
| 白介素（1~13）测定
干扰素测定
| | | | | | 体内细胞免疫试验
| 皮肤试验
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指制备与免疫检测有关制剂的技术，包括抗原制备、抗体制备、抗体纯化及抗体标记等技术。
免疫制备技术是免疫检测技术的第一步，正由于免疫制备技术的进展，才使免疫检测技术日新月异，层出不穷，因此，免疫制备技术是免疫技术不可缺少的一部分。
在免疫制备技术中，最为主要的是单克隆抗体制备技术，它大大提高了免疫检测技术的特异性和敏感性，推动了免疫检测试剂的标准化，使免疫检测技术进入了一个新的时代。
免疫技术已广泛应用于生物科学各个领域。
一、疾病诊断
用免疫血清学方法对人和动物传染病、寄生虫病、肿瘤、自身免疫病和变态反应性疾病进行诊断，是免疫技术最突出的应用。尤其是酶标抗体技术，已成为多种传染病的常规诊断方法，如已有人各型肝炎、猪瘟等ELISA试剂盒，它们简便、快速，又具有高度的敏感性和可重复性。
二、动植物生理活动研究
动物、植物体中存在一些活性物质，如激素、维生素等，它们在体内含量极微少，但在调节机体的生理活动中起重要作用，因此可通过分析测定这些生物活性物质的含量及变化来研究机体的各种生理功能（如生长、生殖等）。由于这些物质含量极低，用常规化验方法不能准确测出。目前放射免疫测定和酶免疫技术已能精确测出ng（10-9g）及pg(（10-12g）水平的物质，它们已成为测定动物、植物、昆虫体内微量激素及其他活性物质、植物生理和生物防治的重要手段。
三、物种及微生物鉴定
各种生物之间的差异都可表现在抗原性不同，物种种源越远，抗原性差异越大，因此可用区分抗原性的血清学反应进行物种鉴定，物种的分类等工作。血清学反应在细胞、病毒等微生物鉴定和血清型及亚型的分析方面已得到广泛应用。但对动物种源、植物和昆虫分类方面还是一个新领域。
四、动物、植物性状的免疫标记
通过分析动物、植物一些优良性状（如高产、优质、抗逆性等）的特异性抗原，然后用血清学方法进行标记选择育种，这是一个很有前途的方向，它比分子遗传标记选择育种简便。目前已用血清学反应分析找到了鸡抗马立克氏病的免疫标记（B21抗原）。
五、免疫增强药物和疫苗研究
疫苗研究中需用血清学反应和细胞免疫技术测定免疫的效果。在研究一些免疫增强药物，尤其研究抗肿瘤药物时，需用细胞免疫技术分析测定它们对机体细胞免疫功能的增强作用。因为细胞免疫是机体抗肿瘤、抗病毒后个重要机制。
六、发病机理研究
传染病的病原从机体特定部位感染，并在特定组织细胞内增殖，引起发病。以荧光抗体染色或免疫酶组化染色，可在细胞水平上确定病毒等病原微生物的感染细胞，还可用免疫电镜方法在亚细胞水平上进行抗原的定位。还可用于研究自身免疫病和变态反应性疾病的发病机理，如免疫复合物的沉积部位的分析。
七、分子生物学研究领域
在基因工程中，基因的分离、表达产物的定性与定量分析、表达产物的纯化等均涉及到免疫技术。如通常用免疫沉淀方法分离mRNA基因、酶标抗体核酸探针（地高辛核酸探针）检测筛选克隆、免疫转印技术分析表达产物的分子量、ELISA或RIA分析表达量、免疫亲和层析纯化表达产物、免疫方法分析表达产物的性质如免疫原性。由此可见，免疫技术是分子生物学研究必不可少的工具。
免疫血清学试验的发展趋向一直是高度特异性、高度敏感性、精密的分辨能力、高水平的定位、试验电脑化、反应微量化、方法标准化和试剂商品化以及方法简便快速。
用单抗替代多克隆血清抗体以提高特异性；用各种标记技术提高敏感性；结合各种电泳技术提高对抗原分析的分辨能力；结合激光共聚焦显微镜、电子显微镜进行亚细胞水平、染色体，甚至分子水平上的定位；一些血清学技术，如放射免疫测定、酶标抗体测定，在专门仪器上配备有电脑，使试验操作和试验结果处理和记录自动化；以免疫学技术为基础的蛋白质芯片技术，使血清学检测技术向更加微量化、自动化和规模化集成方向发展。无论是标记抗体技术，还是常规的血清学反应目前都倾向于采用的微量反应板孔中进行，即节省材料，又提高工作效率；研制各种诊断试剂盒，其中备有各种标准抗原和参考血清，使其标准化和商品化，这是血清学试验的一个重要发展趋向，因为它将大大促进血清学技术的普及应用。
细胞免疫技术，目前除进一步完善已建立的淋巴细胞功能性测定方法外，用血清学方法检测淋巴细胞表面标记，与流式细胞仪、激光共聚焦显微镜结合，进行分型和免疫信号等研究，用血清学方法检测分析各种淋巴因子（与免疫有关的一类细胞因子），即细胞免疫技术与血清学技术融合为一体是一个发展趋向。
免疫制备技术中，制备单克隆抗体和研制单抗检测试剂，以代替多克隆血清抗体及其试剂，是现在和今后的发展趋向。
1．Ian R. Tizard，Veterinary Immunology, An Itroduction, 5th Edition, London：W. B. Saunders Company, , 1996
2．吴敏毓，刘恭植主编，医学免疫学，第四版，合肥：中国科学技术出版社，2002
3．杜念兴主编，兽医免疫学，第二版，北京：中国农业出版社，1995
4．王世若、王兴龙、韩文瑜主编，现代动物免疫学，第二版，吉林：吉林科学技术出版社，2001
1．何谓免疫技术、免疫血清学技术、细胞免疫技术和免疫制备技术？
2．免疫血清学技术有哪些基本类型？
3．如何理解免疫血清学技反应的特异性和交叉性？有何实际意义？
4．什么是带现象？前带和后带各多发生于什么血清学反应中？
5．影响免疫血清学反应的因素有哪些？
6．免疫技术可应用于哪些领域？其发展趋势如何？
内容提要：凝聚性试验是免疫血清学技术中最古老、简单和方便的检测技术，凝集试验用颗粒性抗原，有直接凝集试验和见解凝集试验之分，在间接凝集试验中，据载体的不同有间接血凝、间接乳胶凝集等方法，用抗体致敏载体颗粒则称为反向见解凝集试验。沉淀试验用可溶性抗原，有液相、凝胶扩散和免疫电泳技术等方法，其中环状沉淀试验、琼脂双向双扩散、双向单扩散和对流免疫电泳等方法是最常用的方法。
抗原与相应抗体结合形成复合物，在有电解质存在下，复合物相互凝聚形成肉眼可见的凝聚小块或沉淀物，根据是否产生凝聚现象来判定相应抗体或抗原，称为凝聚性试验。为最简单的一类血清学试验。根据参与反应的抗原性质不同，分为由颗粒性抗原参与的凝集试验和由可溶性抗原参与的沉淀试验二大类。
细菌、红细胞等颗粒性抗原，或吸附在乳胶、白陶土、离子交换树脂和红细胞颗粒性载体表面的可溶性抗原，与相应抗体结合，在有适当电解质存在下，经过一定时间，形成肉眼可见的凝集团块，称为凝集试验（agglutination test）。参与凝集试验的抗体主要为IgG和IgM。凝集试验可用于检测抗原或抗体，最突出的优点是操作简便，深受基层工作欢迎。此外，还有桥梁凝集试验（又称Combs
凝集试验可根据抗原的性质、反应的方式分为直接凝集试验（简称凝集试验）和间接凝集试验。
一、直接凝集试验
颗粒性抗原与凝集素直接结合并出现凝集现象的试验称作直接凝集试验（direct agglutination test）。细菌、螺旋体、立克次氏体等颗粒性微生物抗原与其相应的抗体发生反应而形成凝集，称之为微生物凝集试验；一个人的红细胞与另一含有其相应抗体的个体的血清混合后，出现血球凝集现象，称为同种红细胞凝集试验，人的ABO血型系统就是据此原理来鉴别不同血型的。按操作方法可分玻片法和试管法两种。
1．玻片法 为一种定性试验。将含有已知抗体的诊断血清（适当稀释）与待检菌悬液各一滴在玻片上混合，数分钟后，如出现颗粒状或絮状凝集，即为阳性反应。此法简便快速，适用于新分得细菌的鉴定或分型。如沙门氏菌的鉴定、血型的鉴定等多采用此法。也可用已知的诊断抗原悬液，检测待检血清中是否存在相应抗体，如布氏杆菌的玻板凝集反应和鸡白痢全血平板凝集试验等。
2．试管法 为一种定量试验，用以检测待测血清中是否存在相应抗体和测定该抗体的含量，以协助临床诊断或供流行病学调查。操作时，将待检血清用生理盐水作倍比稀释，然后加入等量抗原，置37℃水浴数小时观察。视不同凝集程度记录为++++（100%凝集）、+++（75%凝集）、++（50%凝集）、+（25%凝集）和-（不凝集）。以其++以上的血清最大稀释度为该血清的凝集价（或称滴度）。
细菌凝集视参与反应的细菌结构不同而有菌体（O）凝集、鞭毛（H）凝集和Vi凝集之分，O凝集时菌体彼此吸着，形成致密的颗粒状凝集。H凝集通常用活菌或经福尔马林处理后的菌体进行，呈疏松的絮状凝集。Vi凝集需在冰箱中放置20h才能进行得完全，凝集亦较致密。
反应条件视抗原种类不同略有差异，肠道细菌的H抗原通常用52℃水浴2h，布氏杆菌凝集反应有时用37℃，24h断定结果。为了避免在高温中放置过久而招致杂菌生长，可在稀释液中加适量防腐剂，如在生理盐水中加0.5%石炭酸。
某些细菌（如R型细菌）在制成细菌悬液时很不稳定，在没有特异性抗体存在的条件下，亦可发生凝集，谓之自家凝集。此外，某些理化因素亦可引起非特异性凝集。pH降至3.0以下时，即可引起抗原悬液的自凝，称为酸凝集。因此，试验时必须设置阳性血清、阴性血清和生理盐水等对照。
含有共同抗原的细菌，相互之间可以发生交叉凝集（或称类属凝集）。但交叉凝集的凝集价一般比特异性凝集低，不难区别。抗血清中的类属凝集素可用凝集素吸收的方法将其除去。例如甲、乙两细菌，甲细菌含有AB两种抗原，乙细菌含有BC抗原。因含有共同抗原B，故二者能发生交叉凝集。如在抗甲细菌的抗血清中加入含乙细菌悬液，则血清中B凝集素被吸收，该吸收后的血清仍能与甲细菌凝集，但不能凝集乙细菌。本法不仅可用以鉴别特异凝集和类属凝集，也可用以提取含有单一凝集素的因子血清。
3．生长凝集试验 抗体与活的细胞结合，如果没有补体存在，就不能杀死或抑制细胞生长，但能使细菌呈凝集生长，可借显微镜检查观察培养物是否凝集成团，以检测加入培养基中的血清是否含有相应抗体。猪气喘病的微粒凝集试验就是应用了这个原理。将待检血清加入接种有猪肺炎霉形体的培养基中，培养24~48h，离心沉淀，取沉淀物做涂片，染色镜检。如发现霉形体聚集成团即为阳性。微粒凝集试验可用于检出带菌猪。
在某些肠道传染病的快速检验中，曾应用免疫荧光菌球试验，其本质也是一种玻板快速生长凝集试验。如霍乱孤菌的检查，将相应荧光抗体用选择培养液稀释至事先确定的工作浓度，取1滴置清洁玻片上。再以铂耳取患者粪便少许接种于上述液滴中，置密闭湿盒内，37℃培养6~8h，在荧光显微镜下，低倍镜检查，如见成团的荧光团，即可判为阳性。
此外，如猪丹毒的悬浮凝集试验是将可疑病料直接接种于含抗血清及少量琼脂的选择培养基中，培养数小时后，病料中的猪丹毒杆菌与抗血清结合，呈凝集生长，形成肉眼可见的细小菌落，悬浮于培养基上部。此法不仅可用于快速诊断猪丹毒，还可用于从扁桃体中检出健康带菌猪和其它带菌动物。
二、间接凝集试验
A.抗原致敏载体颗粒
B.已致敏的载体颗粒与相应抗体反应产生凝集
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将可溶性抗原（或抗体）先吸附于一种与免疫无关的、一定大小的不溶性颗粒（统称为载体颗粒）的表面，然后与相应抗体（或抗原）作用，在有电解质存在的适宜条件下，所出现的特异性凝集反应称为间接凝集反应，以此建立的检测方法称为间接凝集试验。间接凝集反应由于载体颗粒增大了可溶性抗原的反应面积，因此当颗粒上的抗原与微量抗体结合后，就足以出现肉眼可见的凝集反应。间接凝集反应的优点是敏感性高，它一般要比直接凝集反应敏感2~8倍。但特异性较差。常用的载体有红细胞（“O”型人红细胞，羊红细胞）、聚苯乙烯乳胶颗粒，其次为白陶土、离子交换树脂、火棉胶等。抗原多为可溶性蛋白质如细菌、立克次体及病毒的可溶性抗原、或原虫、吸虫、丝虫的浸出液、或动物的可溶性物质、或激素及各种组织器官浸出液、或植物性蛋白质如花粉浸出液等；某些细菌的可溶性多糖也可吸附于载体上。当载体吸附了可溶性抗原后即称为致敏颗粒。
将抗原吸附于载体（主要为红细胞、聚苯乙烯乳胶颗粒），然后与相应的抗体反应产生的凝集现象，称为正向间接凝集反应，又称正向被动间接凝集反应，以红细胞为载体则称为间接血凝试验（indirect haemagglutination test, IHAT），以聚苯乙烯乳胶颗粒为载体的称为正向乳胶凝集试验（latex agglutination test，LAT）。用特异性抗体吸附于载体颗粒表面，再与相应的可溶性抗原结合产生凝集现象，称为反向见解凝集反应，同样有反向间接血凝和反向间接乳胶凝集试验之分。
先用可溶性抗原（未吸附于载体的可溶性抗原）与相应的抗体作用，使该抗体与可溶性抗原结合，再加入抗原致敏颗粒，则抗体不在凝集致敏颗粒，此反应为间接凝集抑制试验（图15-2）
（一）间接血凝试验（indirect haemagglutination test, IHAT） 亦称被动血凝试验passive haemagglutination assay, PHA），是将可溶性抗原致敏于红细胞表面，用以检测相应抗体，在与相应抗体反应时出现肉眼可见凝集。如将抗体致敏于红细胞表面，用以检测检样中相应抗原，致敏红细胞在与相应抗原反应时发生凝集，称为反向间接血凝试验（reverse passive heamagglutination assay, RPHA）。
试验的主要步骤如下：
1．红细胞 常用绵羊红细胞（SRBC）及人“O”型红细胞。SRBC较易大量获取，血凝图谱清晰，制剂稳定，但绵羊可能有个体差异，以固定一头羊采血为宜。更换羊时应预先进行比较和选择。此外，待测血清中如有异嗜性抗体时易出现非特异凝集，需事先以SRBC进行吸收。人“O”型红细胞很少出现非特异凝集。
采血后可立即使用，也可4份血加1份Alsever’s液（含8.0g/L枸橼酸三钠，19.0g/L葡萄糖，4.2g/L NaCl）混匀后置4℃，1周内使用。
2．抗原与抗体 间接血凝试验时，致敏用的抗原如肌红蛋白、甲状腺球蛋白、细菌或病毒抗原等应纯化，以保证所测抗体的特异性。某些抗原物质性质不明或提纯不易时，也可用粗制的器官或组织浸出液。
作反向间接血凝试验时，致敏用的抗体本身应具备高效价、高特异性、高亲和力，一般情况下可用50%、33%饱和硫酸铵盐析法提取抗血清的g球蛋白组分用于致敏。为提高敏感性，可进一步经离子交换色谱技术提取IgG，甚至再经抗原免疫吸附柱纯化，提取有抗体活性的IgG组分。为排除类风湿因子的干扰，还可将IgG用胃蛋白酶消化，制成F（ab）2片断用于致敏。
3．致敏方法
（1）鞣酸法
高浓度鞣酸使红细胞自凝，低浓度鞣酸处理红细胞后，红细胞易于吸附蛋白质抗原，其机理不明。已知鞣酸可使红细胞对阴离子的通透性降低，使细胞耐受氯化铵的溶解作用，红细胞由圆盘状变为球形。因此认为鞣酸的作用部位为红细胞表面，可能是使后者的理化性质或电势发生改变。
（2）双偶氮联苯胺（BDB）法
BDB以其两端的两个偶氮基分别连接蛋白质抗原（或抗体）与红细胞。这是一种化学结合，较鞣酸处理红细胞对蛋白的吸附要牢固和稳定得多。与BDB法类似的还有碳化二亚胺（carbodiimide）、二氟二硝基苯（difluorodinitrobenzene）等方法。
（3）戊二醛法 戊二醛（glutaraldehyde, GA）是一种双功能试剂，其两个醛基可与蛋白质抗原（或抗体）和红细胞表面的自由氨基或胍基结合，从而使抗原或抗体与红细胞联结。
（4）金属离子法 铬、铝、铁、铍等多价金属阳离子，在一定pH条件下既与红细胞表面的羧基，又与蛋白质（抗原或抗体）的羧基结合，从而将抗原或抗体联接到红细胞。金属离子中以铬离子（CrCl3）最常用。
（5）醛化红细胞法 目前常用丙酮醛、甲醛双醛固定红细胞的方法。醛化后的红细胞可直接吸附抗原或抗体。其原理可能是丙酮醛的醛基先与红细胞膜蛋白的氨基或胍基结合，剩下的酮基与甲醛发生醇醛缩合反应而形成b羟基酮，后者易失水生成a、b-不饱和酮，其碳碳双键可与蛋白质（抗原或抗体）中的亲核基团（氨基、胍基）发生1、4加成反应，从而使红细胞与抗原或抗体共价偶联。
4．血凝反应
（1）反应板 目前，血凝反应均在96孔微量血凝反应板上进行。反应板有两种，一种是U型孔，一
种是V型孔。一般认为V型孔凝集图谱清晰，阳性与阴性易于区别。V型孔的角度应<90º。反应板用前应冲洗干净，使用一段时间后应以7ｍol/L尿素（用粗品即可）溶液浸泡，以消除非特异凝集（也可用50－100g/L次氯酸钠、含40g/L胃蛋白酶的4%HCL或10－20g/L加酶洗衣粉溶液）。
（2）操作步骤 将96孔反应板横置，每孔用25µl移液器（单道或多道）滴加稀释液25µl，加25µl检样于第1孔中，吸吹混匀，取25µl于第2孔中，如此连续稀释至第11孔，最后1孔留作红细胞对照。各孔补加稀释液25µl后将反应板置于微型振荡器上，边混匀边滴加致敏红细胞，每孔25µl。将反应板置湿盒于37℃（或室温）放置2小时后观察结果。
（3）结果判定 红细胞集聚于孔中央，周围光滑为阴性；红细胞平铺孔底或周边稍有皱褶者为100%凝集（+ + + +）；平铺孔底但孔中心稍有红细胞集聚者为75%凝集（+ + +）；孔周边有凝集，孔中央红细胞集聚相当于阴性对照孔红细胞圆点1/2左右者为50%凝集（+ +）。以50%凝集为终点。出现50%凝集的最高稀释度为效价。如效价＞1024（第11孔），必要时可再作连续稀释以测出最终效价。
（二）乳胶凝集试验（latex agglutination test，LAT） 乳胶又称乳胶，是聚苯乙稀聚合的高分子乳状液，乳胶微球直径约0.8mm，对蛋白质、核酸等高分子物质具有良好的吸附性能。用它作载体吸附某些抗原（或抗体），可用以检测相应的抗体（或抗原）。本法具有快速简便、保存方便、比较准确等优点。在对组织抗原、激素等的检测中已广泛应用。
乳胶颗粒致敏
1．乳胶颗粒致敏 聚苯乙烯乳胶已有商品供应，也可自行合成，用时以pH8.2的甘氨酸缓冲液10倍稀释（1%乳胶液），逐滴加入适当稀释的抗原液（抗原浓度和加入的量需预先测定），充分混合后，置37℃30分钟，离心洗涤，恢复至原来1%乳胶体积。有的抗原（如人绒毛膜促性激素）在吸附后需用胰蛋白酶水解，以破坏未吸附的游离抗原，并使吸附在乳胶上的抗原活性基团充分暴露，这样可提高反应的敏感性。
聚苯乙烯乳胶亦可用以吸附抗体，制备乳胶血清。可在25ml的0.4%乳胶液中，逐滴加入1:10－20的抗血清1－7ml，边加边摇，当出现微颗粒时继续滴加，直至颗粒消失即成。本法可用于沙门氏菌的快速诊断。
致敏后的乳胶液加入0.01%硫柳汞作防腐剂，置4℃冰箱可保存数月至1年。乳胶液切忌冻结，一经冻结就易自凝。
在微球上引入官能团，使其能与抗原或抗体分子上的某些特定基团价结合，则此种化学结合较单纯物理吸附更为稳定而牢固。在制备聚苯乙烯乳胶微球时，添加丙烯酸，即可制成
化聚苯乙烯乳胶。此带有 基的乳胶微球可借水溶性碳化二亚胺与带氨基的抗原或抗体缩合。缩合条件温和，在室温、接近中性（pH5.4-6.4）的条件下即可完成。但蛋白质分子上既带氨基，又带 基，因此，在与微球缩合的同时，难免也发生蛋白质分子间的交联，这有可能导致聚集及免疫活性下降。
2．凝集反应 乳胶凝集反应常彩玻板法，因乳胶系乳白色，故最好用黑色玻板。取待检血清（或抗原）和致敏乳胶各一滴在玻板上混匀，阳性者在5分钟内即出现明显凝集，但在20分钟时需再观察一次，以免遗漏弱阳性。
乳胶凝集亦可用试管法，在递进稀释的待检血清管内加等量致敏乳胶，振摇后置56℃水浴2小时，然后用1000g的离心力，低速离心3分钟（或室温放置24小时）即可判读，根据上液的澄清程度和沉淀颗粒的多少，判定凝集程度。
乳胶凝集亦可进行凝集掏试验，如人的妊娠诊断，先将绒毛膜促性激素致敏乳胶，此乳胶能与相应血清发生凝集。操作时，取孕妇尿一滴，加抗血清一滴，充分混匀后，再加乳胶抗原一滴，不发生凝集者为阳性。
吸附抗原（或抗体）后的乳胶可以加入适当赋形保护剂后，滴于涂有黑色塑料薄膜的卡纸上，真空干燥，制成可以长期保存的“诊断卡“。用时加生理盐水1滴于干点上，然后加待检液1滴，混匀后连续摇动2－3分钟，即可在强光下目视观察结果。此法亦可用于做掏试验，如妊娠诊断用的检孕卡，即用胶乳抗原和抗血清分别滴于卡纸上干燥，同时取澄清尿液1滴于抗血清干点上，生理盐水1滴于胶乳抗原干点上在，用牙签混合，摇2－3分钟观察结果，不凝集为阳性，凝集为阴性。
抗体致敏的乳胶加入少量抗原时，乳胶浊度显著降低，利用这一特性可用免疫浊度法对抗原进行超微宣测定，其敏感性很高，几乎可与放射免疫相比，但致敏乳胶不能有丝毫自凝，必须用交联法致敏。乳胶颗粒应细而均匀，大小以0.3μm为宜，乳胶的最佳浓度为1－2mg/ml。使用本法时应注意，当抗原浓度递增至一定程度时，乳胶浊度又可增高。故试验时，需有已知浓度的抗原作对照，并绘制标准曲线。待检抗原用递增浓度试验，根据反应曲线计算含量。
三、协同凝集试验（co-agglutination test，COAG）
葡萄球菌A蛋白（Staphylococal protein A，SPA）是金黄色葡萄球菌的特异性表面抗原，能与多种哺乳动物IgG分子的Fc片结合。SPA与IgG结合后，后者的Fab片暴露于外，并保持其抗体活性，当此SPA-特异性抗体与相应的抗原结合时，就可产生凝集反应。本法广泛应用于多种细菌和某些病毒的快速诊断。
富含SPA的金
IgG类 结合了IgG类抗体 抗 原 金黄色葡萄球菌 黄色葡萄球菌 抗 体 的金黄色葡萄球菌 的协同凝集
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1．SPA菌株 用于协同凝集试验的标准菌株有Cowanl株和国内选育的1800株，以及对照的、不含A蛋白的Z12、Wood46株等。将上述菌株培养于葡萄营养琼脂上18－24小时，用PBS洗下菌苔，洗涤2次，将洗涤后的沉淀按10%的浓度悬于含0.5%甲醛的PBA中，室温搅拌3小时，再在50℃水浴30分钟，洗涤3次，恢复10%浓度，并加叠氮钠至0.1%浓度。此即SPA菌体制剂，亦称SPA稳定液，在4℃冰箱可保存数月。
2．致敏 根据试验对象，用相应抗血清致敏SPA菌：取上述SPA菌液1ml以PBS选2次，将沉淀恢复至1ml，然后加入抗血清0.1ml，置37℃30分钟，取出洗涤2次，最后加入含0.1%叠氮钠的PBS1ml，使成10%SPA致敏菌液。置4℃可保存6个月，用前洗涤1次，使最终菌悬液浓度为1%－4%。
3．试验 通常应用平板法。取1滴待检抗原和1滴致敏SPA菌悬液在平板上混合，2－5分钟内观察结果。试验时，应用不含SPA的对照菌悬液按同法致敏，作为阴性对照。亦可作试管凝集试验，系将抗原倍比稀释加入适当浓度的致敏SPA菌悬液，混合后37℃水浴2－3小时观察结果，结果判定同常规凝集试验。SPA菌悬液的最适浓度可事先测定。
4．应用 本法已作广泛应用于多种细菌性疾病的快速诊断，在沙门氏菌和肠道传染病的快速诊断中，可以直接应用培养－8小时的增菌培养液作抗原，不仅缩短了检验时间，而且其特异性与常规方法相同，敏感性和检出率还高于常规方法。本法用于诊断浒性脑脊髓炎时，可直接应用患者脑脊液作抗原；用于诊断畜禽巴氏杆菌病和猪丹毒等败血性疾病时，可直接应用含菌组织的乳悬液作抗原。方法简便、快速可靠。本法用于钩端螺旋体、链球菌、沙门氏菌等的血清型鉴定，也同样具有简便、快速、特异性强等优点。一些病毒如腺病毒、粘病毒和副粘病毒等亦可应用本法作快速诊断的鉴定，但国内尚少报道。
四、桥梁凝集反应（又称Coombs抗球蛋白试验）
此试验用于检测不完全抗体。不完全抗体在免疫过程的晚期产生。又称为单价抗体或非沉淀性或非凝集性抗体。它属于IgG，能耐热，其体积很小，长度较短（只有25nm），仅为一般抗体长度95nm的1/4左右。因此它只能与一方抗原的决定簇结合，而不能同时与双方抗原决定簇联结，故不会产生凝集反应。当加入抗球蛋白抗体后，可以将二个各连结一方抗原决定簇的单价抗体再连结起来，出现凝集，称为桥梁凝集反应（图15-）。
五、病毒的血凝和血凝抑制反应
有些病毒如粘病毒、痘类病毒、呼吸道肠道病毒、某些腺病毒等，均能凝集某种哺乳类和禽类的红细胞，称之为病毒血凝反应，是病毒的一种生物学特性，而非特异性的血清学反应。但特异性抗体可以抑制这种反应，称之为病毒的血凝抑制反应，这一过程是抗原抗体的特异性反应。
可溶性抗原（如细菌的外毒素、内毒素、菌体裂解液，病毒的可溶性抗原、血清、组织浸出液等）与相应抗体结合，在适量电解质存在下，形成肉眼可见的白色沉淀，称为沉淀试验（precipitation test）。
沉淀试验的抗原可以是多糖、蛋白质、类脂等，抗原分子较小，单位体积内所含的量多，与抗体结合的总面积大，故在作定量试验时，通常稀释抗原不使过剩，并以抗原稀释度作为沉淀试验效价。参与沉淀试验的抗原称沉淀原，抗体称为沉淀素。沉淀试验可分为液相沉淀试验、凝胶扩散试验和免疫电泳试验三大类。
一、液相沉淀试验
抗原与抗体在液相中进行反应形成沉淀物，以此判定相应抗体或抗原，液相沉淀试验又可分为絮状沉淀试验、环状沉淀试验和浊度沉淀试验等类型。在实际应用中最常用的是环状沉淀试验。
环状沉淀试验（ring precipitation test）是最简单、最古老的一种沉淀试验，目前仍广泛应用。方法为在小口径试管内先加入已知抗血清，然后小心沿管壁加入待检抗原于血清表面，使之成为分界清晰的两层。数分钟后，两层液面交界处出现白色环状沉淀，即为阳性反应。本法主要用于抗原的定性试验，如诊断炭疽的Ascoli试验、链球菌血清型鉴定、血迹鉴定和沉淀素的效价滴定等。试验时出现白色沉淀带的最高抗原稀释倍数，即为血清的沉淀价。
二、凝胶扩散试验
利用可溶性抗原和抗体在半固体凝胶中进行反应，当抗原抗体分子相遇并达到适当比例时，就会互相结合、凝聚，出现白色的沉淀线，从而判定相应的抗体和抗原。常用的凝胶有琼脂（Agar）和琼脂糖（Agarose）等，琼脂是一种含有硫酸基的多糖体，高温时能溶于水，冷却后凝固，形成凝胶。琼脂凝胶呈多孔结构，孔内充满水分，1%琼脂凝胶的孔径约为85nm，因此可允许各种抗原抗体在琼脂凝胶中自由扩散。因此这种反应称为琼脂免疫扩散，又简称琼脂扩散和免疫扩散。琼脂免疫扩散试验有多种类型，如单向单扩散，单向双扩散，双向单扩散，双向双扩散，其中以后两种最常用。
1．双向双扩散（double diffusion in two dimension）
双向双扩散试验即Ouchterlony法，简称双扩散。此法系用1%琼脂浇成厚2~3mm的凝胶板，在其上按二分之一图形打圆孔或长方形槽，于相邻孔（槽）内滴加抗原和抗体，在饱和湿度下，扩散24h或数日，观察沉淀带。
抗原抗体在琼脂凝胶内相向扩散，在两孔之间比例最合适的位置上出现沉淀带，如抗原抗体的浓度基本平衡时，此沉淀带的位置主要决定于二者的扩散系数。但如抗原过多，则沉淀带向抗体孔增厚或偏移，反之亦然。
双扩散主要用于抗原的比较和鉴定，两个相邻的抗原孔（槽）与其相对的抗体孔之间，各自形成自己的沉淀带。此沉淀带一经形成，就象一道特异性的屏障一样，继续扩散而来的相同的抗原抗体，只能使沉淀带加浓加厚，而不能再向外扩散，但对其它抗原抗体系统则无屏障作用，它们可以继续扩散。沉淀带的
基本形式有以下三种（土15-）。二相邻孔为同一抗原时，两条沉淀带完全融合，如二者在分子结构上有部分相同抗原决定簇，则两条沉淀带不完全融合并出现一个叉角。两种完全不同的抗原，则形成两条交叉的沉淀带。不同分子的抗原抗体系统可各自形成两条或更多的沉淀带。
双扩散也可用于抗体的检测，测抗体时，加待检血清的相邻孔应加入标准阳性血清作为对照，以资比较。测定抗体效价时可倍比稀释血清，以出现沉淀带的血清最大稀释度为抗体效价。
2．双向单扩散（simple diffusion in two dimension） 又称辐射扩散（radial inmunodiffusion）。试验在玻璃板或平皿上进行，用1.6%~2.0%琼脂加一定浓度的等量抗血清浇成凝胶板，厚度为2~3mm，在其上打直径为2mm的小孔，孔内滴加抗原液。抗原在孔内向四周辐射扩散，与凝胶中的抗体接触形成白色沉淀环。此白色沉淀环随扩散时间而增大，直至平衡为止。沉淀环面积与抗原浓度呈正比，因此可用已知浓度的抗原制成标准曲线，即可用以测定抗原的量。
此法在兽医临床已用于传染病的诊断，如鸡马立克病的诊断，可将鸡马立克高病毒免血清浇成血清琼脂平板，拔取病鸡新换的羽毛数根，将毛根剪下，插于此血清平板上，阳性者毛囊中病毒抗原向四周扩散，形成白色沉淀环。
二、免疫电泳技术
是凝胶扩散试验与电泳技术相结合的免疫检测技术，在抗原抗体凝胶扩散的同时，加入电泳的电场作用，使抗体或抗原在凝胶中的扩散移动速度加快，缩短了试验时间；同时限制了扩散移动的方向，使集中朝电泳的方向扩散移动，增加了试验的敏感性，因此，此方法比一般的凝胶扩散试验更快速和灵敏。根据试验的用途和操作不同可分为免疫电泳、对流免疫电泳、火箭免疫电泳等技术。
图15-7
猪血清的免疫电泳示意（据Tizard）
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1．免疫电泳（immunoelectrophoresis） 免疫电泳技术由琼脂双扩散与琼脂电泳技术结合而成。不同带电颗粒在同一电场中，其泳动的速度不同，通常用迁移率表示，如其它因素恒定，则迁移率主要决定于分子的大小和所带净电荷的多少。蛋白质为两性电解质，每种蛋白质都有它自己的等电点，在pH值大于其等电点的溶液中，羧基离解多，此时蛋白质带负电，向正极泳动；反之，在pH值小于其等电点的溶液中，氨基离解多，此时蛋白质带正电，向负极泳动。pH值离等电点越远，所带净电荷越多，泳动速度也越快。因此可以通过电泳将复合的蛋白质分开。检样先在琼脂凝胶板上电泳，将抗原的各个组分在板上初步分开。然后再在点样孔一侧或两侧打槽，加入抗血清，进行双向扩散。电泳迁移率相近而不能分开的抗原物质，又可按扩散系数不同形成不同的沉淀带，进一步加强了对复合抗原组成的分辨能力。
免疫电泳需选用优质琼脂，亦可用琼脂糖。琼脂浓度为1%~2%，pH应以能扩大所检复合抗原的各种蛋白质所带电荷量的差异为准，通常pH为6~9。血清蛋白电泳则常用pH8.2~8.6的巴比妥缓冲液，离子强度为0.025~0.075mol/L，并加0.01%硫柳汞作防腐剂。
各种抗原根据所带电荷性质和净电荷多少，按各自的迁移率向两极分开，扩散与相应抗体形成沉淀带。沉淀带一般呈弧形。抗原量过多者，则沉淀弧顶点靠近抗血清槽，带宽而色深，如血清白蛋白所形成的带。抗原分子均一者，呈对称的弧形，分子不均一，而电泳迁移率又不一致者，则形成长的平坦的不对称弧，如（球蛋白所形成的带。电泳迁移率相同而抗原性不同者，则在同一位置上可出现数条沉淀弧。相邻的不同抗原所形成的沉淀可互相交叉。
2．对流免疫电泳（Counter immunoelectrophoresis） 大部分抗原在碱性溶液（>pH8.2）中带负电荷，在电场中向正极移动，而抗体球蛋白带电荷弱，在琼脂电泳时，由于电渗作用，向相反的负极泳动。如将抗体置正极端，抗原置负极端，则电泳时抗原抗体相向泳动，在两孔之间形成沉淀带。
Ag抗原，Ab抗体 ＋阳性血清 -阴性血清，1、2、3、4为待检血清图15-8
对流电泳示意图
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试验时，同上法制备琼脂凝胶板，凝固后在其上打孔，挑去孔内琼脂后，将抗原置负极一侧孔内，抗血清置正极侧孔。加样后电泳30~90分钟观察结果。本法较双扩散敏感10~16倍，并大大缩短了沉淀带出现的时间，简易快速，适于作快速诊断之用。如人的甲胎蛋白、乙型肝炎抗原的快速诊断。猪传染性水泡病和口蹄疫等病毒性传染病亦可用本法快速确诊。
并不是所有抗原分子都向正极泳动，抗体球蛋白由于分子的不均一性，在电渗作用较小的琼脂糖凝胶上电泳时，往往向点样孔两侧展开，因此对未知电泳特性的抗原进行探索性试验时，可用琼脂糖制板，并在板上打3列孔，将抗原置中心孔，抗血清置两侧孔。这样，如果抗原向负极泳动时，就可在负极一侧与抗血清相遇而出现沉淀带。
3．火箭免疫电泳（rocket immunoelectrophoresis） 本法系将辐射扩散与电泳技术相结合，简称火箭电泳。将上述巴比妥缓冲液琼脂融化后，冷至56℃左右，加入一定量的已知抗血清，浇成含有抗体的琼脂凝胶板。在板的负极端打一列孔，滴加待检抗原和已知抗原，以电位降10V/cm、每厘米宽度3mA的电场下，电泳2－10小时。电泳时，抗原在琼脂中向正极迁移，其前锋与抗体接触，形成火箭状沉淀弧，随抗
原继续向前移动，此火箭状峰亦不断向前推移，原来的沉淀弧由于抗原过量而重新溶解。最后抗原抗体达到平衡时，即形成稳定的火箭状沉淀弧。在抗体浓度一定时，峰高与抗原浓度成正比。本法主要用于测定抗原的量（用已知浓度抗原作对比）。
抗原抗体比例不适当时，常不能形成火箭状沉淀峰；抗原过剩时或不形成沉淀线，或沉淀线不闭合；抗原中等过剩时，沉淀峰前端不是尖窄而是呈圆形或鞋底状，只有二者比例合适时才形成完全闭合的火箭状沉淀峰。
如将抗原混入琼脂凝胶中，孔内滴加抗体，电泳时，抗体向负极移动，也可形成火箭状沉淀弧，此为反向为箭免疫电泳。
将火箭电泳与放射免疫相结合，谓之放射火箭电泳。此法系将已知抗原用放射性同位素（如125I）标记。试验时将待检抗原与标记抗原混合置检样孔，电泳后生理盐水漂洗1－2小时，盖上湿滤纸，置温箱烘干或电吹风吹干。取X线胶片或普通照相底片切成凝胶板一样大小，将药面密接凝胶面，然后再压一块玻板，用黑纸包严。底片可在放射作用下感光，其曝光时间与同位素及保存期有关。125I在2个月内，曝光10小时。将底片冲出，即可见清晰的火箭状沉淀带。可根据峰的高低测定抗原的量。
1．Ian R. Tizard，Veterinary Immunology, An Itroduction, 5th Edition, London：W. B. Saunders Company, , 1996
2．吴敏毓，刘恭植主编，医学免疫学，第四版，合肥：中国科学技术出版社，2002
3．杜念兴主编，兽医免疫学，第二版，北京：中国农业出版社，1995
4．王世若、王兴龙、韩文瑜主编，现代动物免疫学，第二版，吉林：吉林科学技术出版社，2001
1．何谓凝聚性反应、凝集反因过和沉淀反应？
2．凝集反应和沉淀反应各有哪些类型？其基本原理是什么？
3．间接血凝试验中红细胞致敏的常用方法有哪些？
4．协同凝集试验是根据什么原理设计的？有何用途？
5．琼脂免疫扩散试验有哪些？各有什么用途？
6．试述免疫电泳技术的原理、方法和用途。
内容提要 标记抗体技术是现今应用最为广泛的免疫血清学技术，主要有荧光标记技术、酶标记技术和放射性同位素标记技术三大类。荧光标记技术有直接法和间接法，酶标记技术可分为免疫组化法和ELISA法两类，放射标记技术有液相法和固相法。应注重掌握各种标记技术的原理、方法和试验的基本步骤。
抗原与抗体能特异性结合，但抗体、抗原分子小，在含量低时形成的抗原抗体复合物是不可见的。有一些物质即使在超微量时也能通过特殊的方法将其检查出来，如果将这些物质标记在抗体分子上，可以通过检测标记分子来显示抗原抗体复合物的存在，此种根据抗原抗体结合的特异性和标记分子的敏感性建立的技术，称为标记抗体技术（labelled antibody technique）。
高敏感性的标记分子主要有荧光素、酶分子、放射性同位素三种，由此建立荧光抗体技术、酶标抗体技术和同位素标记技术。其特异性和敏感性远远超过常规血清学方法，被广泛应用于病原微生物鉴定、传染病的诊断、分子生物学中的基因表达产物分析等各个领域。
荧光抗体标记技术（fluorescent-labelled antibody technic）是指用荧光素对抗体或抗原进行标记，然后用荧光显微镜观察所标记的荧光以分析示踪相应的抗原或抗体的方法。
一、原理
荧光素在10-6的超低浓度时，仍可被专门的短波光源激发，在荧光显微镜下观察到荧光。荧光抗体标记技术就是将抗原抗体反应的特异、与荧光素物质的高敏感、以及显微镜技术的精确性三者相结合的一种免疫检测技术。
荧光是一类电磁波。分子是由原子组成，原子是由原子核和核外电子组成。每一个核外电子都沿着自己固有的轨道围绕核旋转，根据电子轨道离核的距离和能量级的不同，电子分布在不同的层上，每一层所容纳的电子数是一定的，外层电子的能量较内层的大。当一个电子被诱发、吸收一个能量相当的光量子后，它就可以跳到外层上去，或跳到同层的高能带上去，这一过程叫电子跃迁。电子在高能状态是不稳定的，经10~8sec后，它又可以跳回原来的位置，并以光量子形式释放出所吸收的能量，这种激发而发射出来的光称为荧光。
在荧光发射过程中，一部分能量被消耗了，辐射出的光量子能量通常小于激发光的光量子，所以荧光的波长几乎总是大于激发光波长。将吸收的光量子转化为荧光的百分率，即发射量子数与吸收量子数之比率，称为荧光效率。其关系式：荧光效率＝发射光量子数/吸收光量子数×100%。
物质激发荧光的效率是个常数，即激发的荧光波长是一定的，不因激发光强度而变化；但发射光强度则与激发光强度呈正相关，在一定范围内，激发光越强，荧光也越强。其关系式为：荧光效率＝吸收光量子数×荧光效率。
因此，选用适当的强光源和吸收量最多的波长作为激发光是提高荧光强度的根本方法。但过强则易引起光分解，破坏被检标本，大大降低荧光粹灭的速度。
分子必须在激发态有一定稳定性，能够持续约10-3 sec的时间，这是产生荧光的最重要的条件。荧光色素虽有这样的稳定性，但很容易受到环境变化的影响，如pH、分子的电离状态、溶剂的性质、粘稠度、温度以及化学基团的加入等，这一切都会影响荧光的特征，其中溶剂的pH的影响最大，与蛋白质结合的荧光色素的荧光在pH6.0时比之pH8.0时降低50%。
二、荧光色素
荧光素是能够产生明显荧光，并能作为染料使用的有机化学物，又称为荧光染料。只有具备共轭键系统，即单键、双键交替的分子，才有可能使激发态保持相对稳定而发射荧光，具有此类结构的主要是以苯环为基础的芳香族化合物和一些杂环化合物。可用于标记的荧光素有异硫氰酸荧光素（FITC）、四乙基罗丹明（RB 200）和四甲基异硫氰酸罗丹明（TMRITC），其中应用最广的是FITC，罗丹明只是作为前者的补充，用作对比染色时标记。FITC分子中含有异硫氰基，在碱性（pH9.0~9.5）条件下能与IgG分子的自由氨基（主要是赖氨酸的e氨基）结合，形成FITC-IgG结合物，从而制成荧光抗体。
抗体经过荧光色素标记后，并不影响其结合抗原的能力和特异性，因此当荧光抗体与相应的抗原结合时，就形成带的荧光性的抗原抗体复合物，从而可在荧光显微镜下检出抗原的存在。
三、荧光素标记
荧光素标记抗体一般都可直接从生物制品公司购买，也可自己标记。
（一）标记 待标记的抗体要求特异性强、纯度高，通常应用亲和层析法提纯。应用于荧光素标记的主要是IgG。异硫氰酸荥光素（FITC）含有异硫氰基，在碱性条件下能与IgG的自由氨基（主要是赖氨酸的ε氨基）结合，形成IgG与荧光素的结合物。
FITC标记的方法很多，有透析法、直接标记法等，一般以直接法应用最广。该法以0.5mol/L pH9.5碳酸盐缓冲液稀释IgG浓度至2%，取相当于蛋白质量1/100~1/150的FITC溶于相当于IgG溶液量1/10的pH9.5碳酸盐缓冲液中，将FITC溶液的磁力搅拌下，缓慢加入抗体溶液。反应时间与温度的关系：2℃~4℃，6小时；7℃~9℃，4小时；20℃~25℃，1~2小时。
透析法又有袋内标记和袋外标记两种。袋内标记是将抗体蛋白以0.025mol/L pH9.0的碳酸盐缓冲液调整其蛋白浓度至1%（w/v），装透析袋内。称取蛋白量1/20的FITC溶于10倍抗体溶液量的0.025ml/L碳酸盐缓冲液中，将装好的透析袋浸没于FITC溶液中，置4℃ 16~18小时，其间定期以磁力搅拌器搅拌，每次约1~2小时。将透析袋取出，置0.01mol/LpH7.1的PBS中透析4小时，留待过滤。
（二）标记抗体的提纯 抗体标记后应立即进行纯化处理，以除去结合物中的非特异因素，其主要步骤如下：
1．除去游离荧光素 这是纯化标记试剂最基本的要求，常用有透析法和葡聚糖凝胶过滤法两种。透析法是结合物置透析袋内，先用自来水透析5分钟，再转入0.01mol/LpH7.1的PBS或生理盐水中置4℃冰箱继续透析。每天换水3~4次，透析4~5天，如用玻璃纸口袋需透析7天，直到外液无荧光为止。
凝胶过滤法系列用荧光素分子与结合物分子大小差异悬殊，通过分子筛使二者分离。常用的是Sephadex G25或G50。凝胶装柱后，以洗脱液（0.01mol/L pH7.1PBS）平衡，然后加入样品，2×15cm柱子一次可过滤约20ml样品。根据颜色收集第一带洗脱液，即标记抗体，样品大约稀释2倍左右。此法约1小时内即可完成，有条件者应首选此法。但最好与透析法结合，先透析4小时，除去大部分游离荧光素和小分子物质，再进行凝胶过滤，以保护凝胶柱，延长使用时间。
2．除去未标记上的和过度标记的蛋白分子 结合物中存在未标记的和过度标记的蛋白质是降低染色效价和出现非特异性染色的主要因素。除去这些不需要的部分，最常用的方法是DEAE纤维素或DEAE葡聚糖凝胶层析。这些离子交换剂可将过量标记部分吸住，使过低或未标记的部分自由流出，从而收集荧光素和抗体蛋白结合比最适的部分。
（三）荧光抗体染色滴度测定 染色滴度包括特异性和非特异性两种，以二倍比稀释的荧光抗体与对应抗原标本片作系列染色，出现荧光强度的最大稀释度，即该试剂的特异性染色滴度。同样，用不含抗原的组织染色以测定非特异性染色滴度。实际应用时，应取低于特异性染色滴度而高于非特异性染色滴度的稀释度。如特异性滴度为1∶46，非特异性滴度为1∶8，则用时可用1∶32稀释。
如有必要，有时还需作荧光抗体的化学鉴定、特异性鉴定。
四、荧光抗体染色及荧光显微镜检查
1．标本制备 标本制作的要求首先是保持抗原的完整性，并尽可能减少形态变化，抗原位置保持不变。同时还必须使抗原标记抗体复合物易于接受激发光源，以便良好地观察和记录。这就要求标本要相当薄，并要有适宜的固定处理方法。
细菌培养、感染动物的组织或血液、脓汁、粪便、尿沉渣等，可用涂片或压印片。组织学、细胞学和感染组织主要采用冰冻切片或低温石蜡切片。也可用生长在盖玻片上的单层细胞培养作标本。细胞或原虫悬液可直接用荧光抗体染色后，再转移至玻片上直接观察。
标本的固定有两个目的，一是防止被检材料从玻片上脱落，二是消除抑制抗原抗体反应的因素，如脂肪之类。检测细胞内的抗原，用有机溶剂固定可增加细胞膜的通透性有利于荧光抗体渗入。最常用的固定剂为丙酮和95%乙醇。固定后应随即用PBS反复冲洗，干后即可用于染色。
2．染色方法
荧光抗体染色法有多类，常用的有直接法和间接法。直接法系直接滴加2~4个单位的标记抗体于标本区，漂洗、干燥、封载。间接法则将标本先滴加未标记的抗血清，漂洗，再用标记的抗抗 体染色，漂洗、干燥、封载。对照除自发荧光、阳性和阴性对照外，间接法首次试验时应设无中间层对照（标本＋标记抗抗体）和阴性血清对照（中间层用阴性血清代替抗血清）。间接法的优点为制备一种标记的抗抗体即可用于多种抗原抗体系统的检测。将SPA标记上FITC制成FLITC-SPA，性质稳定，可制成商品，用以代替标记的抗抗体，能用于多种动物的抗原抗体系统，应用面更广。
3．荧光显微镜检查 标本滴加缓冲甘油后用盖玻片封载，即可在荧光显微镜下观察。荧光显微镜不同于光学显微镜之处，在于它的光源是高压汞灯或溴钨灯，并有一套位于集光器与光源之间的激发滤光片，它只让一定波段的紫外光及少量可见光（蓝紫光）通过；此外还有一套位于目镜内的屏障滤光片，只让激发的荧光通过，而不让紫外光通过，以保护眼睛并能增加反差。为了直接观察微量滴定板中的抗原抗体反应，如感染细胞培养上的荧光，可使用现已有商品的倒置荧光显微镜。
五、荧光激发细胞分检器
荧光激发细胞分检器（fluorescein activated cell sorter, FACS）能快速、准确测定各荧光抗体标记的淋巴细胞亚群的数量、比例、细胞大小等，并将其分检收集，是当前免疫学研究的极为重要的仪器之一。通过喷嘴形成连续的线状细胞液流，并以每秒1 000~5 000个细胞的速度通过激光束。标记有荧光抗体的细胞发出荧光，荧光色泽、亮度等信号由光电倍增管接收和控制，再结合细胞的形态、大小，产生光散射信号，其数据立即输入微电脑处理。根据细胞的荧光强度及大小的不同，细胞流在电场中发生偏离，最后分别收集于不同容器中。这种分离程序并不损害细胞活力，且可在无菌条件下进行。由此分出的淋巴细胞亚群能继续作功能测验。此法分离的细胞纯度可达90%~99%。这种方法还可用以分检淋巴细胞杂交瘤的细胞克隆，方法简便而灵敏。
六、荧光抗体标记技术的应用
（一）细菌学诊断 能用荧光抗体标记技术直接检出或鉴定的细菌约有30余种，均具有较高的敏感性和特异性，其中较常应用的链球菌、致病性大肠杆菌、沙门氏菌属、宋内氏痢疾杆菌、李氏杆菌、巴氏杆菌、布氏杆菌、炭疽杆菌、马鼻疽杆菌、猪丹毒杆菌和钩端螺旋体等，可从粪便、粘膜拭子涂片、病变组织的触片或切片以及尿沉渣等样本中，经直接免疫荧光法检出目的菌，具有很高的诊断价值。对含菌量少的标本，可采用滤膜集菌法，然后直接在滤膜上进行免疫荧光染色，这一方法已在水的卫生细菌学调查、海水细菌动力学研究中得到应用。
以较低浓度的荧光抗体加入培养基中，进行微量短期的玻片培养，于荧光显微镜下直接观察荧光集落的“荧光菌球法”，已广泛用于下痢粪便的病原体检测。尤其对于已用药物治疗的患畜，在病因学诊断上有较大价值，因为在这种情况下培养病原体常难于成功。
将间接免疫荧光检测抗体用于追溯调查、早期诊断和现症诊断，也都有良好的效果。如钩端螺旋体病检出IgM抗体，可作早期诊断或近期感染的指征。结核病用间接免疫荧光技术检出抗体，可以作为对病的活动性和化疗监控的手段。
（二）病毒感染诊断 用免疫荧光直接检出患畜病变组织中的病毒，已成为病毒感染快速诊断的重要手段。如猪瘟、鸡新城疫等可取感染组织作冰冻切片或触片，作直接或间接免疫荧光染色以检出病毒抗原，一般可在2小时内作出诊断报告。猪流行性腹泻（PED）在临床上与猪传染性胃肠炎（TGE）十分相似，将患病小猪小肠冰冻切片用PED荧光抗体作直接免疫荧光检查，即可对PED进行确诊。
对含病毒较低的病理组织，需先在细胞培养上短期培养增殖后，再用荧光抗体检测病毒抗原，可提高检出率。某些病毒（如猪瘟病毒）在细胞培养上不出现细胞病变，亦可应用免疫荧光作为病毒增殖的指征。应用间接免疫荧光以检测血清中的抗病毒抗体，亦常作为诊断和流行病学调查之用，尤以IgM型抗体的检出可供早期诊断和作为近期感染的指征。
（三）其它方面的应用 免疫荧光技术已广泛应用于淋巴细胞表面抗原和膜表面免疫球蛋白（SmIg）的检测，从而为淋巴细胞的分类和亚型鉴定提供研究手段。用抗IgM和IgG的抗血清标记SPA荧光菌体作荧光SPA花环试验，可计算带有SIgM或SIgG的B细百分率。
荧光抗体技术还可应用于研究和诊断自身免疫性疾病和观察免疫病理的发病机理。如采用直接免疫荧光法对尸检或活组织切片，检测固定在组织中的抗体或补体各组分，对许多与免疫病理有关的疾病（肾小球肾炎、多发性关节炎等）的发病机理和诊断都有重要意义。用间接免疫荧光技术还可用以测定外周血液中的自身抗体，如检出抗核抗体或抗DNA抗体对全身性红斑狼疮的诊断有特殊的价值。
美国研究成功一种荧光激发细胞分检器（fluorescein activated cell sorter, FACS），能快速、准确测定各种荧光抗体标记的淋巴细胞亚群的数量、比例、细胞大小等，并将其分检收集，是当前免疫学研究的极为重要的仪器之一。通过喷嘴形成连续的线状细胞液流，并以每秒1000~5000个细胞的速度通过激光束。标诚有荧光抗体的细胞发了荧光，荧光色泽、亮度等信号由光电倍增管接收和控制，再结合细胞的形态、大小，产生光散射信号，其数据立即输入微电脑处理。根据细胞的荧光强度及大小的不同，细胞流在电场中发生偏离，最好分别收集于不同容器中。这种分离程序并不损害细胞活力，且可在无菌条件下进行。由此分出的淋巴细胞亚群能继续作功能测验。此法分离的细胞纯度可达90%~99%。这种方法还可用以分检淋巴细胞杂交瘤的细胞克隆，方法简便而灵敏。
1966年Nakane等和Avrameas等分别报道用酶代替荧光素标记抗体，作生物组织中抗原的定位和鉴定，从而建立了酶标抗体技术（Enzyme-labelled antibody technique）。1971年Engvall等及Van Weemen等分别报道了酶联免疫吸附试验（ELISA），从而建立了酶标抗体定量技术。80年代，又建立了酶标记抗体检测蛋白质分子量的免疫印迹方法（Immunoblotting），使酶标记抗体技术成为临床检测和分子生物学研究中运用最广泛的免疫学方法之一。
一、原理
酶标抗体技术是根据抗原抗体反应的特异性和酶催化反应的高敏感性而建立起来的免疫检测技术。酶是一种有机催化剂，催化反应过程中酶不被消耗，能反复作用，微量的酶即可导致大量的催化过程，如果产物为有色可见产物，则极为敏感。
其催化过程是：E+S
（ES）
E+P；或E+S
（ES），（ES）+D1
E+P+D2
E为酶，S为酶作用底物，P为底物分解和的产物。D1为供氢体，无色，底物分解时，D1由还原型变为氧化型D2，呈现颜色反应。
酶标抗体技术的基本程序是：①将酶分子与抗原或抗体分子共价结合，此种结合既不改变抗体的免疫反应活性，也不影响酶的催化活性。②将此酶标抗体（抗抗体）与存在于组织细胞或吸附于固相载体上的抗原（抗体）发生特异性结合，并洗下未结合的物质；③滴加底物溶液后，底物在酶作用下水解呈色；或者底物不呈色，但在底物水解过程中由另外的供氢体提供氢离子，使供氢体由无色的还原型变为有色的氧化型，呈现颜色反应。因而可根据底物溶液的颜色反应来判定有无相应的免疫反应。颜色反应的深浅与标本中相应抗原（抗体）的量呈正比。此种有色产物可用肉眼或在光学显微镜或电子显微镜下看到，或用分光光度计加以测定。这样，就将酶化学反应的敏感性和抗原抗体反应的特异性结合起来，用以在细胞或亚细胞水平上示踪抗原或抗体的所在部位，或在微克、纳克水平上测定它们的量。所以本法既特异又敏感，是目前应用最为广泛的一种免疫检测方法之一。
二、用于标记的酶
用于标记的酶应具有高度的特异活性和敏感性、在室温下稳定、易于获得并能商品化生产、与底物反应和的产物易于显现等特性。常用的有辣根过氧化物酶、碱性磷酸酶、葡萄糖氧化酶等，其中以辣根过氧化物酶应用最广。
（一）辣根过氧化物酶（Horseradish peroxidase，简称HRP）
HRP的作用底物为过氧化氢，催化时需要供氢体，使产生一定颜色的产物。如果以联苯胺为供氢体，反应式如下：
HRP + H2O2
（HRP·H2O2）
H2N
NH2 + 2H2O2
HRP
HN
NH + 4H2O
（联苯胺-无色） （还原型联苯胺-黄褐色）
凡能在HRP催化H2O2生成H2O过程中提供氢，而后自己生成有色产物的化合物（供氢体）都可用作显色剂。HRP的供氢体很多，根据供氢体的产物可分为两类：①可溶性供氢体：产生有色的可溶性产物，可用比色法测定，如ELISA中的显色剂。常用的邻苯二胺（O-phenylenediamine，OPD），橙色，最大吸收值为490nm，可用肉眼判别；3,3’,5,5’四甲基联苯胺（tetramethylbenzidine，TMB），显色呈蓝色，加氰氟酸终止在650nm波长下测定，若用硫酸终止（变为黄色）则在450nm波长下测定。此外，还有邻联茴香胺（O-dianisidine，OD），5氨基水杨酸（5-amino-salicylic acid，5As），邻联甲苯胺（O-toluidine）简称OT。②不溶性产物供氢体：最常用的是3，3’二氨基联苯胺（3，3’-diaminobenzidine，DAB），反应后的氧化型中间体迅速聚合，形成不溶性棕色吩嗪衍生物。适用于各种免疫组化法，还用于蛋白的免疫转印试验。
HRP可用戊二醛法或过碘酸钠氧化法将其标记于抗体分子上制成酶标抗体。
（二）碱性磷酸酶（Alkaline phosphatase，AKP）
系从小牛肠黏膜和大肠杆菌中提取，由多个同工酶组成。AKP的底物种类很多，常用价廉无毒性的对硝基苯磷酸盐，酶解产物呈黄色，可溶性，最大吸收波长在400nm处，酶活性以在pH10反应系统中，37℃1min水解1μl磷酸苯二钠为一个单位。国产碱性磷酸酶以猪小肠黏膜制成，其特异酶活性在2000单位/mg左右。
（三）葡萄糖氧化酶（Glucose oxigase，GO） 系从曲霉中提取，对底物葡萄糖的作用常借过氧化物酶及其显色底物来加以显现，其反应如下：
葡萄糖+O2
H2O2
H2O2 +
+
2H2O
如显色底物为联苯二胺，则反应后呈棕色，阴性者为淡黄色，极易用目视法判别，其灵敏度高于过氧化物酶标记抗体高。
三、抗体的酶标记
酶标记体可直接购自生物试剂公司，亦可实验室标记。抗体的酶标记中，酶的活性和纯度至关重要。，最好用亲和层析纯化，但在单抗标记中也可直接标记小鼠的腹水。理想的结合剂应具备生产率高，结合物稳定，不影响酶的活性和抗体的活性，不产生干扰物质、操作简便等条件。目前主要采用戊二醛标记法和过碘酸钠标记法。
（一）戊二醛标记法 戊二醛标记法的原理是通过它的醛基和酶与免疫球蛋白上的氨基共价结合，即戊二醛上的两个活性醛基，一个与酶分子上的氨基结合，另一个与免疫球蛋白上氨基结合，形成一个酶-戊二醛-免疫球蛋白结合物。
将酶先与戊二醛作用，然后洗去过量未结合的戊二醛，再加入抗体进行结合。因为HRP的NH2基团较少，酶分子与过量的戊二醛反应，酶分子游离的氨基仅与戊二醛上的醛基（-CHO）结合，形成酶-戊二醛结合物。戊二醛的另一个醛基与随后加入抗体分子上的氨基结合，形成标记抗体。反应后加入赖氨酸，将过剩的醛基封闭。这样所得的产物均一性好、活性高、产率高。
酶结合物中不同程度地存在游离酶、游离抗体，可影响检测试验的敏感性和特异性，因此，酶结合物还需用50%饱和硫酸铵盐析法纯化，或者进一步用Sephadex G200层析纯化。
酶结合物还需进行鉴定，包括酶和抗体活性鉴定、结合物中酶含量和IgG含量、酶与IgG克分子比值以及结合率的测定等。但一般只作酶活性和抗体活性鉴定，方法是用系列稀释的结合物直接以ELISA法进行滴定，不仅可以测定标记效果，还可以确定结合物的作用浓度。
标记过程：将10mgHRP溶解在0.2ml含1.25%戊二醛的PB（0.1mol/L，pH6.8）中，室温静置18小时。然后通过Sephadex G25柱过滤，柱预先用0.15mol/L NaCl平衡。收集含棕色的洗脱液，并用超滤膜浓缩到1ml。加入等量的抗体（5ml，0.15mol/L生理盐水中），再加入0.1ml碳酸盐缓冲液（1.0mol/L、pH9.5），4℃放置过夜。加入0.1ml甘氨酸溶液（0.2mol/L），2小时后置PB中4℃透析过夜，透析物用Sephadex G200柱分离结合物。柱用乙基汞化硫代水杨酸钠缓冲液平稀，透析，20ml/h，分步收集，分别测每份在280nm（蛋白质）和403nm（酶）的OD值，收集OD高峰重叠管，加入纯甘油（至33%甘油浓度），-20℃长期保存。
（二）过磺酸钠法 用于HRP的标记。在反应的第一阶段用2，4-二硝基氟苯（DNFB）封闭酶蛋白上残存的α和ε氨基，以避免酶的自身交联，然后用过碘酸钠将HRP中的低聚糖基氧化为醛基。反应的第二阶段是使已活化HRP与抗体蛋白的自由氨基结合，形成斯夫氏碱。最后用硼氢酸钠还原，形成稳定的结合物。
过碘酸钠氧化法的优点是标记率高，未标记的抗体量少，但结合物分子量较大穿透细胞的能力不如用戊二醛法标记的抗体，故不适于在免疫电镜中应用。
标记过程 将5mgHRP溶于0.5ml蒸馏水中，加入新配制的0.06mol/L NaIO4水溶液0.5ml，混匀置冰箱30分钟，取出加入0.16mol/L乙烯甘醇水溶液0.5ml。室温放置30分钟后加入含5mg纯化抗体的水溶液（或PBS）1ml，混匀并装透析袋，以0.05mol/L pH9.5碳酸盐缓冲液缓慢搅拌透析6小时（或过夜）使之结合，然后吸出加NaBH4溶液(5mg/ml)0.2ml，置冰箱2小时，将上述结合物混合液加入等体积饱和硫酸铵，冰箱放置30分钟，离心，将所得沉淀物溶于少许0.02mol/L，pH7.4PBS中，并对之透析过夜，次日再离心除去不溶物，即为标记物。
四、酶标抗体技术类型
近年来，酶标抗体技术迅猛发展，种类繁多，迄今尚无统一命名与分类。
（一）根据检测目的和方法，分为以下几类。
1．酶标抗体沉淀技术 系将酶标记在抗原或抗体上，通过琼脂扩散，免疫电泳，对流电泳或辐射扩散，火箭电泳等方法检测标本中相应的抗体或抗原。抗原抗体形成的沉淀线，可用酶底物显色，从而提高了敏感性。
2．酶标抗体定位技术 系用酶标记的抗体或抗原，检查相应抗原或抗体在组织或细胞内的位置，有免疫组化染色技术和酶免疫电镜技术两类，前者用于细胞水平定后，后者用于亚细胞水平定位。
3．酶标抗体测定技术 用于抗原或抗体的定性和定量检测，又分液相和固相两类。
液相法有双抗体法和均相法两种。双抗体法的原理是将待测抗原先与少量已知量的抗体结合，再加入一定量的酶标记抗原，使与剩余的抗体结合，最后加入抗抗体使抗原抗体复合物沉淀，在沉淀物中相应的底物显色。待测抗原的显色反应强度成反比。
均相法主要是用竞争法原理检测溶液中的小分子半抗原，如药物、抗生素、激素等。同时将待测半抗原、抗体和酶标记半抗原共同孵育，由于酶标记半抗原分子上的酶有活性，当与抗体结合后酶活性受到抑制，因此，待测抗原与酶标半抗原竞争结合抗体，待测抗原量与酶的活性成正比。通常用溶菌酶、苹果酸脱氢酶、葡萄糖-6-磷酸脱氢酶作为标记酶。
固相酶标抗体测定技术是在固体支持相进行的，包括酶联免疫吸附试验（ELISA）、斑点酶免疫试验、微球免疫吸附试验等。
（二）根据酶标记物质及反应步骤，酶标抗体技术又分直接酶标抗体法、间接酶标抗体法、抗抗体搭桥法、杂交抗体法、酶-抗体法、增效抗体法等
五、常用酶标抗体技术
（一）免疫酶组化染色技术
1．标本制备和处理 用于免疫酶染色的标本有组织切片（冷冻切片和低温石蜡切片）、组织压印片、涂片以及细胞培养的单层细胞盖片等。这些标本的制作和固定与荧光抗体技术相同，但尚要进行一些特殊处理。
用酶结合物作细胞内抗原定位时，由于组织和细胞内含有内源性过氧化酶，可与标记的过氧化物酶在显色反应上发生混淆。因此，在滴加酶结合物之前通常将制片浸于0.3%H2O2中室温处理15~30min，以消除内源酶。应用1%~3%H2O2甲醇溶液处理单层细胞培养标本或组织涂片，低温条件下作用10~15min，可同时起到固定和消除内源酶的作用，效果比较满意。
组织成分对球蛋白的非特异性粘附所致的非特异性背景染色，可用10%卵蛋白作用30min，进行处理。用0.05%吐温-20和含1%牛血清白蛋白（BAS）的PBS对细胞培养标本进行预处理，同时可起到消除背景染色的效果。
2．染色方法 可采用直接法、间接法、抗抗体搭桥法、杂交抗体法、酶抗体法、增效抗体法等各种染色方法，但通常用直接法和间接酶标记抗体法。反应中每加一种抗体试剂，均需于37℃作用30min，然后以PBS反复洗涤3次，以除去未结合物。
（1）直接法 与荧光抗体的直接法相似，即以酶标记抗体或抗原处理标本，然后浸于含有相应底物和显色剂的反应液中，通过显色反应检测抗原抗体复合物的存在。
（2）间接法 同荧光抗体的间接法。标本用相应的抗体处理后，再加酶标记的抗抗体，然后经显色揭示抗原-抗体-抗抗体复合物的存在。
（3）抗抗体搭桥法 本法不需要事先制备标记抗体，是利用抗抗体既能与反应系统的抗体结合，又能与抗酶抗体结合（抗酶抗体与针对抗原的抗体必须是同源的）的特性，以抗抗体作桥连接抗体和抗酶抗体。先加抗体（如兔抗血清）使与标本上的抗原发生特异性结合，然后加抗抗体（羊抗兔血清）与抗体结合，再加既能与抗抗体结合又能与酶结合的兔抗酶抗体，最后用底物显色。此法的优点在于克服了因酶与抗体交联引起的抗体失活和标记抗体与非标记抗体对抗原的竞争，从而提高了敏感性；但抗酶抗体与酶之间的结合多为低亲和性，冲洗标本时易被洗脱，使酶感性降低。
（4）酶-抗体法 亦称HRP-抗HRP复合物（PAP）法。此法是将HRP和抗HRP抗体结合形成PAP，用PAP来代替抗抗体搭桥法中的抗酶抗体和酶。制备PAP时，需将HRP和抗HRP形成的复合物离心沉淀、洗涤。在此沉淀物中再加HRP，调pH至2.3使之溶解，离心后将上清pH调回至7.5，离心收集上清液；沉淀再加HRP继续提取，直至调回pH时不再有沉淀产生。合并各次上清液，即为可溶性PAP。此PAP为一环状分子，电镜下呈五边形，直径20.5nm。此环形结构使PAP十分稳定，冲洗时不易丢失，故其敏感性较搭桥法高。本法亦常用于ELISA法。
（5）杂交抗体法 将特异性抗体分子与抗酶抗体分子经胰酶消化成双价F（ab）2片段，将这两种抗体的F（ab）2片按适当的比例混合，在低浓度的乙酰乙胺和充氮条件下，使之进一步裂解为单价Fab片，再在含氮条件下使其还原复合。经分子筛层析后，即可获得约25％~50％的杂交抗体。这种杂交抗体分子含有两个抗原结合部位，一边能与特异性抗原结合，另一边能与酶结合。因此，不必事先准备标记抗体。试验时含抗原的标本直接用杂交抗体和酶处理，即可浸入底物溶液中，进行显色反应。杂交抗体还可采用杂交瘤技术和基因工程技术进行制备。
（6）增效抗体法 同时使用酶标抗体与抗酶抗体，其程序为：抗原、酶标记抗体、抗抗体、抗酶抗体、酶、底物。此法能使更多的酶连接在抗原上，从而使显色反应增强，提高其敏感性。
3．显色反应 免疫酶组化染色中的最后一环是用相应的底物使反应显色。不同的酶所用底物和供氢体不同。同一种酶和底物如用不同的供氢体，则其反应物的颜色也不同。如辣根过氧化物酶，在组化染色中最常用DAB，用前应以0.05mol/L pH7.4~7.6的Tris-HCl缓冲液配成50~75mg/100ml溶液，并加少量（约0.01%~0.03%）H2O2混匀后加于反应物中置室温10~30min，反应产物呈深棕色；如用甲萘酚，则反应产物呈红色；用4-氯-1-萘酚，则呈浅蓝色或蓝色。
4．标本观察 显色后的标本可在普通显微镜下观察，抗原所在部位DAB显色呈棕黄色。亦可用常规染料作反衬染色，使细胞结构更为清晰，有利于抗原的定位。本法优于荧光抗体法之处，在于毋须应用荧光显微镜，且标本可以长期保存。
（二）酶联免疫吸附试验（Enzyme linked immunosorbent assay, ELISA）
ELISA是当前应用最广、发展最快的一项新技术。其基本过程是将抗原（或抗体）吸附于固相载体，在载体上进行免疫酶反应，底物显色后用肉眼或分光光度计判定结果。
1．固相载体 有聚苯乙烯微量滴定板、聚苯乙烯球珠等。用聚苯乙烯微量滴定板（40孔或96孔板）是目前最常用载体，小孔呈凹形，操作简便，有利于大批样品的检查。新板在应用前一般无需特殊处理，直接应用或用蒸馏水冲洗干净，自然干燥后备用。一般均一次性使用，如用已用过的微量滴定板，需进行特殊处理。
用于ELISA的另一种载体是聚苯乙烯珠，由此建立的ELISA又称微球ELISA。珠的直径约0.5~0.6cm，表面经过处理以增强其吸附性能，并可做成不同的颜色。此小珠可事先吸附或交联上抗原或抗体，制成商品。检测时将小球放入特制的凹孔板或小管中，加入待检标本将小珠浸没进行反应，最后在底物显色后比色测定。本法现已有半自动化装置，用以检验抗原或抗体，效果良好。
2．包被
将抗原或抗体吸附于固相表面的过程，称载体的致敏或包被。用于包被的抗原或抗体，必须能牢固地吸附在固相载体的表面，并保持其免疫活性。各种蛋白质在固相载体表面的吸附能力不同，但大多数蛋白质可以吸附于载体表面。可溶性物质或蛋白质抗原，例如：病毒糖蛋白、血型物质、细菌脂多糖、脂蛋白、糖脂、变性的DNA等均较易包被上去。较大的病毒、细菌或寄生虫等难以吸附，需要将它们用超声波打碎或用化学方法提出抗原成分，才能供试验用。
用于包被的抗原或抗体需纯化，纯化抗原和抗体是提高酶联免疫吸附试验的敏感性与特异性的关键。抗体最好用亲和层析和DEAE纤维素层析柱提纯。有些抗原含有多种杂蛋白，须用密度梯度离心等方法除去，否则易出现非特异性反应。
蛋白质（抗原或抗体）很易吸附于未使用过的载体表面，但适宜的条件更有利于该包被过程。包被的蛋白质浓度通常为1~10mg/ml。高pH和低离子强度缓冲液一般有利于蛋白质包被，通常用0.1mol/L pH9.6碳酸盐缓冲液作包被液。一般包被均在4℃过夜，也有经37℃2~3小时达到最大反应强度。包被后的滴定板贮于4℃冰箱，可贮存3周。如真空塑料封口，于-20℃冰箱可贮存更长时间。用时充分洗涤。
3．洗涤
在ELISA的整个过程中，需进行多次洗涤，目的是防止重叠反应，引起非特异现象。因此，洗涤必须充分。通常采用含助溶剂吐温-20（最终浓度为0.05%）的PBS作洗液，以免发生非特异性吸附。洗涤时，先将前次加入的溶液倒空，吸干，然后于洗液中泡洗3次，每次3分钟，倒空，并用滤纸吸干。
4．试验方法
ELISA的核心是利用抗原抗体的特异性吸附，在固相载体 Ag抗原，Ab1特异性抗体，Ab2抗抗体，Ab3用另一种动物制备的特异性抗体， Ab4抗酶抗体，E酶，黑色小点为底物酶解后的色素，白色小环为未酶解的底物。 图16-3
酶联免疫吸附试验（ELISA）（据杜念兴）
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上一层层地叠加，可以是两层、三层甚至多层。整个反应都必需在抗原抗体结合的最适条件下进行。每层试剂均稀释于最适于抗原抗体反应的稀释液（0.01~0.05mol/L pH7.4 PBS中加吐温-20至0.05%、10％犊牛血清或1％BSA）中，加入后置4℃过夜或37℃ 1~2h。每加一层均需充分洗涤。阳性、阴性应有明显区别，阳性血清颜色深，阴性血清颜色浅，二者吸收值的比值最大时的浓度为最适浓度，试验方法主要有以下几种：
（1）间接法 用于测定抗体。用抗原将固相载体致敏，然后加入含有特异抗体的血清，经孵育一定时间后，固相载体表面的抗原和抗体形成复合物。洗涤除去其它成分，再加上酶标记的抗抗体，加入底物，在酶的催化作用下底物发生反应，产生有色物质。样品含抗体愈多，出现颜色愈快愈深。
（2）夹心法 又称双抗体法，用于测定大分子抗原。将纯化的特异性抗体致敏于固相载体，加入含待检抗原的溶液，孵育后，洗涤除去多余的抗原，再加入酶标记的特异性抗体，使之与固相载体表面的抗原结合，再洗涤除去未结合的酶标抗体结合物，最后加入酶的底物，经酶催化作用后产生有色产物的量与溶液中的抗原成正比。
（3）双夹心法 此法是采用酶标抗抗体检查多种大分子抗原，它不仅不必标记每种抗体，还可提高试验的敏感性。将抗体（如豚鼠免疫血清Ab1）吸附在固相上，洗涤未吸附的抗体，加入待测抗原（Ag），使之与致敏固相载体作用，洗去未起反应的抗原，加入不同种动物制出的特异性相同的抗体（如兔免疫血清Ab2），使之与固相载体上的抗原结合，洗涤后加入酶标记的抗Ab2抗体（如羊抗兔球蛋白Ab3），使之结合在Ab2上。结果形成Ab1-Ag-Ab2-Ab3-HRP复合物。洗涤后加底物显色，呈色反应的深浅与标本中的抗原量呈正比。
（4）竞争法 用于测定小分子抗原及半抗原。用特异性抗体将固相载体致敏，加入含待测抗原的溶液和一定量的酶标记抗原共同孵育，对照仅加酶标抗原，洗涤后加入酶底物。被结合的酶标记抗原的量由酶催化底物反应产生有色产物的量来确定。如待检溶液中抗原越多，被结合的酶标记抗原的量越少，有色产物就减少。根据有色产物的变化求出未知抗原的量。其缺点是每种抗原都要进行酶标记，而且因为抗原结构不同，还需应用不同的结合方法。此外，试验中应用酶标抗原的量较多。但此法的优点是出结果快，且可用于检出小分子抗原或半抗原。
（5）酶-抗酶抗体（PAP）法 又称PAP-ELISA，反应过程同组化染色法，只是操作在反应板上进行。此方法虽可提高试验的敏感性，但因不易制作理想的抗酶抗体，试验中较多干扰因素影响结果的准确性，因此较少采用。
（6）PPA-ELISA
以HRP标记SPA代替间接法中的酶标抗抗体进行的ELISA。因SPA（葡萄球菌蛋白A）能与多种动物（如人、猪、兔等）的IgG Fc片段结合，可用HRP标记制成酶标记SPA，而代替多种动物的酶标抗抗体，该制剂有商品供应。
（7）BA系统ELISA
生物素（biotin）与亲和素（avidin）具有很强的结合能力，因此可将其引入ELISA，方法有BA-ELISA（反应层次为：抗原、待检血清、生物素化的二抗、酶标亲和素）、BAB-ELISA（反应层次为：抗原、待检血清、生物素化二抗、亲和素、酶标生物素）、ABC-ELISA（反应层次为：抗原、待检血清、生物素化二抗、酶标记的亲和素与生物素复合物）等。
（8）斑点ELISA（Dot-ELISA）
此法是以硝酸纤维素膜代替反应板，用不溶性供氢体显色。也可作直接法、间接法等。
5．底物显色 与免疫酶组化染色法不同，本法必须选用反应后的产物为水溶性色素的供氢体。最常用的是邻苯二胺（OPD），产物呈棕色，可溶，敏感性高，但对光敏感，因此要避光进行显色反应。底物溶液（OPD-H2O2=溶液）应在试前新鲜配制。底物显色以室温10~20min为宜。反应结束，每孔加浓硫酸50ml，终止反应。也常用四甲基联苯胺（TMB）为供氢体，其产物为蓝色（加H2SO4后变黄色）。
应用碱性磷酸酶时，常用对硝基苯磷酸盐（PNP）作底物，产物呈黄色。
6．结果判定
ELISA试验结果可用肉眼观察，也可用分光光度计测定。每批试验都需要阳性和阴性对照，肉眼观察，如颜色反应超过阴性对照，即判为阳性。用酶联免疫测定仪来测量光密度，所用波长随底物而异。如以OPD为供氢体，测定波长为492nm，TMB为650nm（氰氟酸终止）或450nm（硫酸终止）。
定性结果通常有两种方法：以P/N比表示，求出该样本的OD吸收值与一组阴性样本吸收值的比值，即为P/N比值，若³2或3倍，即判为阳性。若样本的吸收值³规定吸收值（阴性样本的平均吸收值＋2标准差）为阳性。定量结果以终点滴度表示，可将样本稀释，出现阳性（如P/N>2或3，或吸收值仍大于规定吸收值）的最高稀释度为该样本的ELISA滴度。
一、原理
放射免疫标记技术（Radioimmunoassay, RIA）是将同位素测量的高度敏感性和抗原抗体反应的高度特异性结合起来而建立的一种免疫分析技术。它分为用于定量分析的放射免疫测定和用于定性分析的放射免疫检测技术两种类型。1959年Yalow和Berson共同创建了放射免疫测定技术，由于这种检测方法可以精确地测定体液中的微量活性物质，是定量分析方面的一次重大突破。因而受到各有关基础学科工作者的重视，推动了此类方法的迅速发展，并于1977年荣获诺贝尔生物学医学奖。
RIA具有特异性强、灵敏度高、准确性和精密度好等优点，是目前其它分析方法所无法比拟的。而且此法操作简便，便于标准化，其灵敏度可达纳克（ng）至皮克（pg）级，比一般分析方法提高了1000~1000000倍。本法的广泛应用，为研究许多含量甚微而又很重要的生物活性物质在动物体内的代谢、分布和作用机制提供了新的方法，大大促进了医学和生物学的进展。
（一）放射性原理 原子的中心是原子核，周围是电子。由于原子是中性的，因而原子核所带的正电荷量等于核外电子的总电荷。原子核又由质子（带正电荷）和中子（不带电荷）组成。当原子核的质子数与中子数满足一定比例时，核结构不会自发地改变，为稳定性元素。但当质子数与中子数偏离其特定比值时，原子核就自发地发生转变，放出射线，即发生核衰变，这种元素为放射性元素。质子数相同而中子数不同的一类放射性元素称为放射性同位素，它们大多为天然，如120~138I中，除127I外都是放射性同位素，也可人造放射性同位素，如3H。
放射性同位素核衰变时，会发射出α射线（即氨核）、β射线（即电子）、γ射线（一种高能电磁波）和β+射线（即正电子），或从核外俘获一个电子等。各种射线都很容易用仪器探测出来，并且灵每度很高。3H衰变时放射出β射线，能量低（0.0186mev），可用液体闪烁仪检测。32P和35S放射的中能量β射线（分别为1.709mev和0.167mev），125I放射的γ射线均可用井型闪烁计数计检测。
放射免疫中主要用这些同位素作示踪原子。
放射性强度的单位是居里（Ci），1居里的放射性为每秒种3.7×1010次核衰变，居里的单位较大，因此，通常应用毫居里（mCi）或微居里（μCi）。其关系为1 Ci=103 mCi=103μCi。
放射性比度通常是用每单位重量或体积中所含的放射性强度来表示。例如：mCi/g或mCi/cm3。放射性比度有时也叫比放射性或比活性。而放射性的计量通常以每分钟脉冲数（cpm）或每秒钟脉冲数（cps）表示。
目前国际逐渐通用“贝克勒尔”（Bq）代替居里表示放射性强度，1Bq=1dps，即Bq为每称衰变的次数。所以，换算：1Ci=3.7×1010Bq
（二）放射免疫标记技术检测原理
1．竞争性RIA，定量分析微量半抗原物质均采用这种RIA方法。其基本原理是同时在溶液中加入标记抗原（*Ag）、非标记抗原（Ag）和抗体（Ab），使Ag与*Ag竞争性地和Ab结合，根据免疫沉淀物中*Ag-Ab量的减少或增多来测定Ag的含量。
从上述反应系统可以看出，当反应液中存在一定量的*Ag和Ab时，结合型*Ag-Ab（B）和游高型*Ag（F）的比例是一定的，它们保持着可逆的动态平衡。如在此反应液中加入待检的Ag，则Ag与*Ag竞相与Ab结合，Ag的量越多，B/F值或B%越小。因此，只须把反应液中的B和F分开，然后分别测定B和F的放射性，即可计算出B/F值和结合百分率（B%）。用已知浓度的标准物（Ag）和一定量的*Ag、Ab反应，测出不同浓度Ag和B/F值或B%。以标准物的浓度为横座标，B/F或B%为纵座标即可绘成竞争性抑制反应的标准曲线。同上法测出待检Ag的B/F或B%，即可在标准曲线上查出其含量。
以B/F纵座标作的反应曲线是一条弧线。可将曲线演变成直线。如以结合率百分数的倒数值（即T/B）纵座标，就可得图14~5所示的直线反应曲线。T=B+F，是加入标记抗原的总放射性强度。
2．固相夹心RIA
与夹心ELISA的原理相似。用定量抗体包被反应管或聚苯乙烯球珠，然后加入系列稀释的待检抗原，最后加入放射性同位素标记的抗体，计数结果。根据标准样品制备的标准曲线进行定量测定。与竞争性放射分析不同的是，固相夹心RIA只能测定完全抗原，如细菌、病毒等，不能测定小分子的半抗原物质，此外测定结果不如竞争法准确。
3．放射性免疫分析 与酶标记体组化法的原理相似。用放射性同位素标记抗体或抗原，加入到组织制片或固定检样上，用放射自显影术以显示组织或固定检样上样应抗原或抗体的位置，即是一种定位和定性检测方法。放射性同位素射线使X光乳胶片感光显示结果。X光乳胶片的化学成分与普通照相胶片一样，但其溴化银晶粒要小得多，浓度却大得多。结合有标记抗体的组织制片或固定检样，洗去未结合的标记抗体，干燥后暗室中盖上X光乳胶片，用黑纸包裹，样品上的放射性粒子使胶片上的溴化银粒还原。经显像、定影后，即可观察分析结果。
二、标记用同位素
在已发现的109种元素共约2000种同位素中，只有274种为稳定同位素，绝大部分是不稳定同位素，即放射性同位素，但作为标记检测用的放射性同位素应考虑：①低序号的常见元素，便于置换化合物中的同种元素进行标记；②放射强度低或中等，降低对操作人员的危害；③半衰期适中，既能保证检测时间，又便于环境中的处理。因此，标记检测中常用以下几种放射性同位素：
（一）3H
发射β射线，能量低（0.018 mev），我国将其划归为低毒组放射性同位素，放射强度为3.57β×1014Bq/g。半衰期12.35年。优点是安全，且标记物可长期保存。缺点是射线能量低（软β射线），需加入闪烁剂使光信号得以放大，并需用专门的液体闪烁仪测定，其闪烁剂和液体闪烁仪化较昂贵，因而目前仅用于标记一些半抗原。如孕酮、睾酮等测定。
（二）125I
发射γ射线，尽管射线能量低（0.035 mev），但γ射线为一种不带电荷的光子，质量轻，其穿透力强，射程远，因此，我国将125I划为高毒组放射性同位素。半衰期60.25天。优点是测定方法简便，不需要闪烁剂，可直接用井型计数仪测定，该计数仪也较便宜，一般实验室均可购置。另外，碘原子的化学性质比较活泼，标记简便，不论蛋白质、多肽或半抗原均可进行碘标记。如生长激素、肾上腺皮质激素等的测定。缺点是毒性较大，须注意防护。
（三）32P
发射β射线，能量高（1.709 mev），放射强度为1.06×1016Bq/g，我国将其划归为中毒组放射性同位素。半衰期14.28天。由于半衰期短，衰变快，不能用于定量测定，只能用于示踪检测。而用于免疫示踪，又不如酶标抗体技术方便，因此32P很少用于免疫标记技术，主要用于核酸探针示踪方面。
（四）35S
发射β射线，能量低于32P，0.167 mev，放射强度为1.58×1015Bq/g，属于中毒组放射性同位素。半衰期87.4天。从半衰期和毒性方面都优于32P，用于细胞内标记蛋白多肽，然后通过免疫沉淀，电泳后放射性自显影，以显示标记蛋白多肽分子量。
三、放射性同位素的标记
一般从原子能中心或从国外进口含有放射性同位素的标记前体化合物，然后进行标记。标记方法可分为外标记和内标记两类。
（一）外标记 放射免疫测定（定量）中，最常用外标记法进行3H和125I的标记。
3H半衰期长，它的标记需要在特殊装置中进行，故多由放化试剂中心做成药盒供应。如从放化试剂中心直接订购固醇类激素、核酸、前更腺素等的3H标记物。
放射性碘标记较易，且应用方便，不需要液体闪烁仪，一般实验室均可进行检测。多肽、蛋白质激素、微生物抗原、血液成分、肿瘤抗原等多用放射性碘标记。
碘化标记的方法很多，最常用的为氯胺T法，氯胺T是一种氧化剂，它能使125I液中带匀电荷的碘离子氧化成正电荷的碘，然后取代抗原酪氨酸残基芳香环上的氢。蛋白质或多肽类的碘化标记率的大小与该化合物中酪氨酸残基的含量及其暴露程度有关。没有暴露酪氨酸残基的化合物，如甾体类，需先在其分子上接一个酪氨酸甲脂才能碘化标记。其反应式如下：
以胃泌素（SHGI）标记为例，SHGI 10μl(1μg)，Na125I 20μl（1μCi），氯胺T 20μl（40μg），混匀，振荡反应1分钟，加入偏重亚硫酸钠20μl（100μg），终止反应。反应液立即加于预先用BSA饱和的SephadexG25 1×10cm柱中，分离游离碘和碘化结合物。
本法对蛋白质的碘化在非常温和的条件下进行，用量很省，放射性物质也可减少到最小限度。它可以作为微量标记，可获得高放化纯度的结合物。但结合时应尽量减少化学反应和放射性碘过量标记所造成的各种损伤，以免降低标记物的免疫活性，影响实验灵敏度。标记时需要下列最佳条件：①供标记用的放射性碘化钠的比活性应大于20mCi/ml；②反应体积要小，使用氯胺T的剂量在不影响标记率的情况下，尽量减低；③反应时的pH宜保持在7.5为宜；④标记物的比放射性应大于50mCi/ug。
（二）内标记 微生物抗原除外标记外，还可采用内标记。它是在生物合成中将同位素掺入的抗原结构中，内标记对抗原结构无影响，仅是简单地置换一个相应的非放射性原子而已。但其缺点是比放射性不高，有时不能达到所要求的灵敏度。这是由于高活的辐射对生物合成系统有损伤。同时，在生物合成的条件下，不可避免地存在有稳定性同位素的大量稀释作用。
1．在人工培养基中加入放射性元素 如微生物需葡萄糖做唯一碳源时，可在培养基中加入14C-葡萄糖。又如细菌的核酸、磷脂等也可分别以32P或35S加于培养基中，以取代非放射性磷酸盐或硫酸盐。
2．应用特异的标记前体 在标记DNA时，可在培养基中加入3H-胸腺嘧啶；标记结核菌素衍生物，可在其生长培养基中加入14C-氨基酸。
3．应用事先标记的生物来源做培养基 有些细菌需要十分复杂的生长培养基，往往难于标记。此时可用二步法标记。即先将一种生长需要简单的微生物通过上述方法将其标记，获得较高的比放射性。然后收获此标记细菌，制成提取物或水解物，作为第二步培养要求严格的微生物的培养基成分。
4．细胞培养 在细胞营养液中加入标记盐类、氨基酸或3H-胸腺嘧啶，然后用以接种病毒。也可从宿主体内收获感染病毒的细胞，然后将其孵育在含有标记物的维持液中，即可将细胞内微生物标上。
标记物还需进行必要的纯化和鉴定，包括放射化学纯度鉴定、免疫化学活性鉴定、标记物用量滴定和放射强度测定等。
四、常用的放射免疫技术
（一）液相放射免疫测定 通常所指的放射免疫测定主要是指液相法。由于待测物的性质和所标记的同位素不同，液相放射免疫的具体方法千差万别。但均需先用标记抗原、已知量的标准抗原和抗血清进行预试，根据测定结果绘制标准曲线。标准曲线的纵座标有很多表示方法，其中常用的有B/F、B%、B/BO×100（BO为零标准管的脉冲数）、B/T×100等。横座标的坑原量用pg或ng表示。有时要求横座标用对数表示（用半对数纸）。
试验的基本过程是：①适当处理待测样品；②按一定要求加样，使待测抗原与标记抗原竞相与抗体结合或顺序结合；③反应平衡后，加入分离剂，将B和F分开；④分别测定B和F的脉冲数；⑤计算B/F、B%等值；⑥在标准曲线上查出待测抗原的量。
1．加样与反应 有两种加样与反应法。
（1）平衡饱和法 同时加入标记抗原（*Ag），待测抗原（Ag）和抗体（Ab），利用标记抗原与待测抗原竞争性结合的原理，先将已知量的标记抗原（*Ag）和待测抗原（Ag）混合。然后加入抗血清（Ab），温育一定时间，使反应达到平衡，就分别形成结合型标记抗原*Ag=Ab，即B，以及游离型标记抗原*Ag，即F。
（2）顺序饱和法 系先将待测抗原与限量的抗血清混合，温育一定时间后，再将标记抗原加入反应液中。在本法中待测抗原优先与抗体结合，故较平衡法更为敏感。两种方法测定的剂量反应曲线见图16-6。
标记抗原的量应按制作标准曲线所用的量加入。抗血清应稀释成能结合50%标准抗原的稀释度。温育时间按被测物不同而异，一般多用4℃24h。有的只需半小时即达到平衡，另一些要放在4℃，7天后才能达到平衡。在建立方法时，除根据文献介绍外，还可用不同的温度和时间进行实验对比，以选择最适宜的条件。
2．分离与测定 在上述反应相中，被测物以及发生特异反应的复合物均为可溶性的，故需加入适宜的分离试剂，将结合型标记抗原（B）与游离型标记抗原（F）分开，分别测定放射性，计算B/F值、B%、B0/B等，即可从标准曲线的座标上查出待测物的含量。分离剂的分离效果就成为影响测定结果准确性的一个重要因素。早期报道的方法如电泳、层析、凝胶过滤等分离技术，尽管分离效果很好，但操作繁琐，费时，不适于大量样品的检测，故现已少用。目前比较常用的方法有以下四种：
（1）吸附法 活性炭对蛋白质、多肽、类固醇和药物具有无选择性的吸附作用，但若在炭末表面被覆一层右旋糖苷、白蛋白等化合物时，就限制了炭末对大分子化合物的吸附，只允许它吸附分子较小的F，因此，只要经离心沉淀，就可将B和F分开。
在测定类固醇激素时，还可用硅鲜吸附剂，漂白粉等硅酸盐化合物作分离剂。
（2）化学沉淀法 用盐类、有机溶剂使B沉淀，从而达到分离的目的。其中以饱和硫酸铵法最为方便，但非特异性偏高。近来应用聚乙二醇（PEG6000）作分离剂，最终浓度为20%，分离效果良好，方法简便易行，克服了硫酸铵沉淀的缺点。
（3）双抗体沉淀法 在反应液中加入一定量的抗抗体，使B与抗抗体结合形成不溶性沉淀物，离心沉淀即可得到分离。还可将双抗体法与PEG法结合。双抗体法非特异性低，缺点是流程过长，PEG法简便快速，二者结合可以扬长避短。抗原抗体结合平衡后，加入抗抗体，37℃水浴1小时，再加等体积的6%~10%PEG液，离心沉淀。沉淀物中含B，而F则留在上清液中。
（4）微孔薄膜法 利用微孔薄膜减压抽滤分离B和F。B因分子大不能通过微孔（0.25~0.45μm）而粘在膜上。放80℃烘干，将膜投入用二甲苯配制的闪烁液中，即可在液体闪烁仪上计算放射性。
（二）固相非竞争放射免疫测定法 本法系预先将抗原或抗体联接在固相载体上（聚苯乙烯或硝酸纤维素膜）上，制作免疫吸附剂，然后按照ELISA相同步骤，使反应在同一管内进行，操作简便快速，特别适合于制成标准试剂盒，便于推广到基层医疗单位应用。
固相载体通常以聚苯乙烯制成小管或小珠，反应在管壁或小珠表面进行。也可用薄型塑料压制成微量滴定板，反应后可将各孔剪下，分别测定脉冲数。
试验方法分单层法和夹心法。
1．单层法 先将待测物与固相载体结合，然后加入过量相对应的标记物，经反应后，洗去游离标记物，测放射性量，即可测算出待测物浓度。本法可用以测抗原，也可测抗体，方法虽简便，但干扰因素较多。
2．夹心法 预先制备固相抗体，加入待检抗原使成固相抗体-抗原复合物，然后加入过量的标记抗体，与上述复合物形成抗体-抗原-标记抗体复合物，洗去游离抗体，测放射性，便可测算出待测物的浓度。
| | | | 生长激素CH
| | 双抗体法
| | 肾上腺皮质激素
| | 双抗体法
| | 人绒毛膜促性激素
| | 双抗体法
| | 催乳素
| | 双抗体法
| | 高血糖素
| | 右旋糖苷被覆的活性炭
| | 胰岛素
| | 双抗体法
| | 胃泌素
| | 双抗体法
| | 肾素
| | 右旋糖苷被覆的活性炭
| | 血管紧张素
| | 右旋糖苷被覆的活性炭
| | 甲状腺素
| | 双抗体法
| | 孕酮
| | 镁吸附法
| | 睾丸酮
| | 葡聚糖凝胶过滤
| | 雌三醇
| | 右旋糖苷被覆的活性炭
| | 去氧皮质醇
| | 30%PEG
| | 去氧异雄酮
| | 饱和硫酸铵
| | 前裂腺素
| | 白蛋白被覆的活性炭
| | DNA
| | 饱和硫酸铵
| |
放射免疫测定是目前最敏感的分析技术，其灵敏度是任何化学分析方法所无法以拟的。但制备高纯度抗原、标记抗原和高亲和力的标准抗血清有一定的难度。目前多由放化研究中心制成药盒供应。在国内，如前裂腺素、孕酮等已有药盒供应。本法主要用于各种生物活性物质的检测。据不完全统计，目前可用本法分析的项目已达300多项，其运用范围遍及生物科学的各个方面。下面介绍在基础医学和临床医学中应用的主要方面。
（一）疾病的诊治 本法除可用以诊断传染病、寄生虫等疾病外，还广泛应用于各种内分泌疾病、心血管疾病和肿瘤的诊断。如内分泌疾病中最常见的甲状腺机能亢进和减退，过去用的诊断方法既麻烦准确高，而利用放射免疫方法直接测定外周血液中甲状腺激素（T3、T4）的浓度，方法简便，准确率高，符合率达90%以上。过去心肌梗塞的诊断多依靠心电图和测定血清酶的含量。目前应用放射免疫法测定血清中肌红蛋白的浓度，不仅可早期诊断和治疗心肌梗塞，同时也可以预示治疗效果，如肌红蛋白持续升高，则为预后不良。
对肿瘤的诊断，如用以诊断肝癌的甲胎蛋白，琼脂扩散法的灵敏度为2~3mg/ml，临床符合率为65%；对流电泳的灵敏度为0.6~1ug/ml，符合率为80%左右；间接血凝法的灵敏度为25~50ng/ml，检出率高，但易出现假阳性。用放射免疫分析的灵敏度为10ng/ml，临床符合率达93%~95%，为早期诊断、早期治疗提供了重要手段。
（二）激素等微量活性物质的测定 动物体的各种生理活动都是通过激素、酶和其它活性物质传递信息和调节机能而得以实现的。研究生理和病理过程各类生物活性物质的动态，对探讨它们的生理功能、探索新治疗途径都有重要意义。例如通过利用放射免疫测定促甲状腺激素（TSH）和促甲状腺释放激素TRH）的浓度，使人们了解到甲状腺素的合成是受脑垂体前叶所分泌的TSH所控制，而TSH又受下丘所分泌的TRH的影响。又如对各类生殖激素测定，弄清了发情、排卵、受精、妊娠、泌乳等过程中各种激素的含量变化，这对进一步控制这些过程，推动体外受精、胚胎移值等技术的发展都有重要意义。
痛觉与前列腺素E、脑啡肽以及环磷酸腺苷（cAMP）的浓度的密切关系。通过放射免疫测定，现已明确阿斯匹林的镇痛原理是抑制前列腺素的合成所致。目前，国内已能用放射免疫法直接测出这些物质的浓度，这将对进一步弄清针刺镇痛的原理具有重要意义。应用放射免疫分析法对血清中cAMP和环磷酸鸟苷（cGMP）浓度的测定，对了解这两种物质的含量变化与疾病发生发展的关系，为阐明中医中药的理论提供了物质基础。
（三）药物监测 药物的有效作用主要决定于体液中药物的浓度，但由于检测困难，过去的给药剂量都凭在治疗过程中的经验积累。应用放射免疫分析法建立了体液中药物浓度的定量技术，这是近代药物学的一个重大突破。药物的临床监测对治疗的帮助是显而易见的。例如，监测中毒或用药过量、提供调整药物剂量的根据、检查病人是否按照医嘱用药、研究某种药物在体内的分布动态、为合理用药提供依据等。应用放射免疫技术对血清及组织中药物浓度的测定是当前发展最快的项目之一。每一种新药问世，都要建立测定该药的放射免疫分析方法，可见这一技术的药物研究中的重要意义。
此外，如在运动场上的判断一个运动员获得最佳成绩是否是由于服用某种兴奋所致，只要用放射免疫方法测一下运动员的尿，就可立即得出正确的结论。在法医上可用它测定毒药的性质和剂量，为迅速破案提供有力证据。
1．杜念兴，兽医免疫学，第二版，中国农业出版社，北京，1997
2．李成文，免疫化学研究进展，中国科学技术出版社，北京，1993
3．刘玉斌，动物免疫学实验技术，吉林科学技术出版社，长春，1989
4．杨汉春，动物免疫学，中国农业大学出版社，北京，1996
5．Kemeny, DM, A Protical Guide to ELISA, Oxford Pergamon Press, 1991
6．Ternynok, TH, et al, Immunoenzymatic Techniques, Amsterdam Elsvier, 1990
7．Tizard I, Veterinary Immunology, 5th ed, W.B.Sauders Company Press Philadelphia, 1996
1．试述免疫荧光抗体技术的原理、常用的染色方法及应用范围。
2．试述免疫酶标记技术的原理及免疫酶组化染色的方法。
3．酶联免疫吸附试验（ELISA）的原理、主要方法及其用途。
4．介绍一种ELISA的主要试验步骤及结果的判定。
5．放射免疫分析的基本原理是什么？有哪些常用方法？
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