牛结核病体外免疫诊断技术

医兽堂 · 发表于 2008-5-12 20:21:37

摘  要:  牛分支杆菌感染的主要特征是引起细胞免疫反应。现在牛结核病的诊断试验是以T细胞反应机制为基础的。低敏感性的结核血清学试验是不值得提倡的，血清学试验最好作为细胞学试验的补充而不是替代。最近，发现了牛结核γ干扰素试验是一种快速的（24 h）惟一使用全血的体外试验，该方法在澳大利亚应用，结果表明，比传统的结核菌素法诊断牛结核更敏感。假阳性反应的难题归因于所使用的抗原制品间的交叉反应特性，设动物对牛PPD和禽PPD的γ干扰素反应作对照可解决假阳性的问题。虽然牛结核特异性蛋白已确认并被分类，这些特异性蛋白可能在血清学或细胞学诊断试验中使用，但是它们可能因牛对牛分支杆菌感染的免疫反应的遗传多样性而受到限制。

　　关键词：牛分支杆菌;酶联免疫吸附试验;γ干扰素;单一结核菌素试验

　　结核菌素试验是广泛使用的最古老的免疫学试验方法之一。自从罗伯特·库克首次在1891年提出了结核菌素反应，这种试验一直应用于动物和人结核病的免疫诊断。尽管传统的结核菌素试验得到了广泛的应用，但已证实该方法存在的问题。一些详细研究牛单一结核菌素试验（SIDT）的敏感性和特异性的文献指出，在某种情况下，这种试验方法的敏感性会大大下降。 Francis J等(1978)重复了该项工作，结果发现SIDT的敏感性只是中等水平（平均72%）。Wood P R等发现SIDT的敏感性为65.6%。
　　虽然SIDT的特异性一般很高（98.8%），但在一些国家的一些畜群和一些特殊群体中，可因抗原与非典型结核分支杆菌间的交叉反应而出现假阳性。另外,该试验结果需要3 d，并且被检牛在60 d~90 d内不能再接受检查。因此,亟待探索诊断结核病的替代试验。
　　1  血清学检查
　　对牛结核病的早期血清学研究有各种不同的试验，如皂土絮状沉淀试验、kaolin凝集试验、直接荧光抗体试验和补体结合试验。所有这些试验系统都使用粗制抗原制品，且非感染牛和其他分支杆菌感染的动物与该血清具有广泛的交叉反应，与较低的特异性问题一样，这些血清学试验也有很低的敏感性，而那些结核病牛的检测结果却是阴性。从这些早期研究中得到的惟一可喜的成果是在提高抗体效价和感染的严重程度之间存在相关性，也发现牛结核菌素试验阳性者中抗体反应有所提高。
　　Thoen C A等首次报道了用结核纯化蛋白提取物作抗原来进行牛结核病的酶联免疫吸附试验（ELISA），在ELISA的早期研究中,Ritacco V等报道了其对牛结核病的敏感性为90%，特异性为89.8%但是后来该研究组成员对ELISA进行了更深入的研究，发现ELISA的敏感性下降至73.6%。Plackett等报道，曾对感染牛分支杆菌但对牛结核菌素试验没有反应的动物进行了ELISA试验检测。但因抗体试验的低敏感性，他们提议将ELISA作为结核菌素试验的补充试验。据报道，经超声处理的牛分支杆菌样品用ELISA检测发现其特异性很差，这可能是因为样品中的广泛交叉反应热激蛋白的浓度要比培养滤液蛋白高的缘故。从结核病的早期血清学试验认识到，因分支杆菌间有广泛抗原交叉反应，故特异性抗原在发生特异性抗体反应中是必要的。因牛分支杆菌的主要抗原已经分离到且序列已测出，现在很容易解释分支杆菌的早期血清学研究中的交叉反应性高的原因。除了已知的非蛋白抗原间的交叉反应外，还知道结核分支杆菌的许多主要蛋白抗原与分支杆菌属有同源性，且与很多其他菌类有同源性。Fifis等报道，一种较大的牛分支杆菌特异性蛋白（MPT70）的使用大大提高了ELISA检测牛结核病的特异性。尽管在Harboe M等的研究中MPT70的敏感性低,但他们还是支持其抗体效价和迟发性超敏反应之间是负相关性。
　　在用牛分支杆菌的实验性感染过程中，虽然不同动物间反映出感染动物的数量非常不同，但发现在第19周至第28周间MPT70的抗体反应很低，然后逐渐增加。牛分支杆菌感染牛的结核菌素试验结果表明，可以诱导对MPT70的很强的免疫记忆抗体反应。几种研究表明，这种免疫记忆影响着后来的结核菌素试验，在这些研究中选用了一些结核菌素试验阳性的感染牛作为实验动物。
　　为了研究MPT70-ELISA的敏感性和特异性，使用了一批经过选择的血清样，牛分支杆菌培养阳性牛109例，培养阴性牛229例，这229头阴性牛中4头在ELISA检测中呈阳性，该检测结果的特异性为98.2%；109头培养阳性牛中有54头是ELISA检测阳性，故MPT70的ELISA的敏感性为49.5%。但是该次所有使用的血清的敏感性低，是因为这些牛最近刚接受了结核菌素试验。在结核菌素试验前采集的血清是可以应用的。对32例牛分支杆菌感染牛进行MPT70-ELISA试验，仅有4例阳性，即结果是12.5%的低敏感性。这又一次证实了牛分支杆菌感染牛对结核菌素有较强的免疫记忆反应。MPT70-ELISA也在该情况下被用于检测，从牛分支杆菌感染的牛群中抽出1 362头，所有血样都在结核菌素试验前采集，这次实验得出MPT70-ELISA的敏感性是18.1%，特异性为96.4%，这么低的敏感性，可能MPT70-ELISA反应的假阳性率与交叉反应的水平相关。
　　1.1  抗原检测
　　抗体已被用于人的痰液，尿液和脑脊液中的分支杆菌抗原的检测。但是对兽医来说，使用这些样品是不太适用的。单克隆抗体已经被用于牛分支杆菌培养物的阳性鉴定。以每毫升105  cfu的菌体浓度与ELISA相结合直接检测牛分支杆菌。惟一从牛分离出的用于体外检测牛结核的可实用的诊断样品就是痰液，此阶段的细菌水平最可能在该病发展到一定阶段时才能检测到。
　　1.2限分支杆菌的免疫反应图谱
　　人的主要分支杆菌病，即麻风病和结核病，通常很容易产生与因分支杆菌的生长所导致的免疫系统免疫失败相关的高水平的循环抗体。Thorns和Morris在几种动物身上重复了牛分支杆菌感染的过程，且包括长期感染的病灶，结果发现牛和人一样，大多数个体能产生有效的T细胞反应，在一些动物如鼯和獾，更频繁的发生突发的疾病，因此，发现在种内和种间存在一种相互关系，即T细胞反应性和感染部位间的关系；另一方面是抗体水平和疾病发展程度间的关系。牛结核病的血清学研究支持这个说法。细胞学试验如结核菌素、淋巴细胞增生试验和γ干扰素试验都比诊断牛结核病血清学试验更简单。从牛结核病的各种血清学的研究中得出的主要结论与从人结核病和麻风病患者的相似研究中得出的结论是一致的。动物对分支杆菌感染的较差的反应主要受血清学试验敏感性的局限，而且分支杆菌抗原间的交叉反应性也导致了高水平的假阳性反应。因为只有感染个体的一个小片段有被这些单克隆抗体识别的抗原表位，故种属特异性单克隆抗体已经用于竞争ELISA（能产生一种特异抗体的试验）中。迄今也没有诊断结核病的血清学试验被医学和兽医学实验室用于常规方法。