饲料防霉剂防霉效果的检测方法

和兴 · 发表于 2008-5-1 06:39:53

盲目挑选和使用饲料防霉剂，往往不仅事与愿违，更会危害饲料企业的经济利益及品牌声誉。所以，掌握并采用科学、正确、有效的检测方法，自我判别防霉剂产品之优劣是各饲料企业维护自身利益的当务之急。
　　目前用于饲料防霉剂防霉效果的检测对比之方法有：杯碟法、最低抑菌浓度法、二氧化碳释放法、温度测定法、饲料常规试验、高温高湿法等。杯碟法测定最大抑菌圈直径，用其大小来定量测定其防霉效果，试验要求选配一种理想溶剂，要求较高、操作复杂；最低抑菌浓度法需将各种防霉剂配成浓度梯度液，工作量大，与杯碟法一样仅适于作初选、速选之用；二氧化碳释放法较难掌握急剧释放CO2的时间，需把握临界时段，而且所需仪器昂贵；温度测定法利用饲料异常发热是饲料霉变的前兆这一特点，它同饲料常规试验一样检测耗时很长，需2～3个月；高温高湿法着重凭借肉眼观察外观，准确性不理想。
　　本检测方法是将现行的GB13092—91《饲料中霉菌检测方法》具体应用于饲料防霉剂防霉效果的对比检测，经多年实践验证，此方法操作简便、结果准确；在多家饲料生产厂家应用，认为切实可行。

1原理
　　根据霉菌生理特性和防霉剂防霉作用机理，选择适宜霉菌生长而不适宜细菌生长的培养基，采用平皿计数方法，在一定菌液中加入一定量的防霉剂，培养后测定霉菌菌落总数。菌落总数越少，表明其防霉抑菌效果越佳，并根据测的数据计算出各防霉剂的抑菌率来准确表示。

2材料与设备
　　分析天平（感量0．0001g）、霉菌培养箱（10℃±1℃～50℃±1℃）、高压灭菌器（电热式蒸汽消毒器）、干燥箱（50℃±1℃～250℃±1℃）、水浴锅（30℃±1℃～80℃±1℃）、振荡器（往复式）、电炉、试管架、玻璃三角瓶（250ml）、试管（25ml）、平皿（Φ9cm）、吸管（1ml、10ml、100ml）、量筒（25ml、100ml）、洗耳球、无菌工作台。

3试剂及配制

3．1高盐察氏培养基

3.1.1成分硝酸钠2g、磷酸二氢钾1g、硫酸镁（MgSO4·7H2O）0．5g、氯化钾0．5g、硫酸亚铁0．01g、氯化钠60g、蔗糖30g、琼脂20g、蒸馏水1000ml。上述试剂，琼脂为生化试剂，其余为分析纯试剂。

3.1.2制法用蒸馏水加温溶解以上成分，分装后，于115℃高压灭菌30min。必要时，可酌量增加琼脂。

3．2稀释液

3.2.10．85％生理盐水称取分析纯NaCl8．5g，定容1000ml。

3.2.2制法121℃高温高压灭菌30min。

3．3所有玻璃器具采用干法灭菌在160℃下灭菌1．5h～2h。

4操作步骤

4．1称取有霉菌的饲料25g，放入含有225ml灭菌生理盐水的250ml三角瓶中，置振荡器上振荡30min。

4．2用10ml吸管吸取10ml1∶10的上述稀释液于25ml试管中，用洗耳球及1ml吸管反复吹吸50次，使霉菌孢子分散开。取1ml此稀释液加入9ml生理盐水，充分混匀得1∶100稀释液。取1∶100稀释液1ml，加到100ml灭菌生理盐水中，充分混匀得1∶10000带有霉菌的稀释液（此稀释液每毫升含霉菌菌落数大致100个）。

4．3取1∶10000带菌液，用1ml灭菌吸管吸取1ml于平皿中。

4．4称取各防霉剂0．2000g分别置于250ml灭菌的三角烧瓶中，加灭菌后的生理盐水100ml，放置振荡器上振荡30min取下，置电炉上加温至50℃左右3min～5min，使防霉剂的有效成分充分溶解。

4．5取带有防霉剂（4．4）溶液1ml（充分混匀后再取），放置于带有1ml霉菌孢子溶液的平皿中，摇匀。每一种防霉剂样品均做双皿。

4．6将灭菌后凉至45℃左右的高盐察氏培养基15ml～20ml注入各平皿中，充分混匀，待琼脂凝固后倒置于25℃～28℃的培养箱中，培养3d后开始观察，培养观察一周。

4．7每一批样品做两份含1ml霉菌不加防霉剂的空白试验。

4．8计算以加了各种防霉剂平皿的霉菌菌落数与不加防霉剂含1ml霉菌的平皿的霉菌菌落数相比较，计算出各防霉剂的抑菌率。

5注意事项

5．1培养基应煮沸后再分装、灭菌。

5．2饲料空白的霉菌孢子一定要充分打散，分布均匀。

5．3在稀释、取样过程中，每稀释1次，每取样1次，均应更换另一支干净的灭菌吸管。

5．4抑菌率的大小与霉菌空白数紧密相关，各防霉剂的抑菌率在同一次实验条件下才能公平比较。每皿菌落数控制在30～150，代表性比较好。

5．5检样从开始稀释到倾注最后一个平皿所用时间不宜超过20min。

5．6各步操作切记无菌操作
　　此方法除用于检测对比饲料防霉剂防霉效果以外，也可用于检测饲料各原材料的带菌程度，根据饲料卫生标准GB13078—91准确判定原材料的新鲜程度，从而达到准确监控各原材料品质之目的。同时可将加有防霉剂的培养物与未加防霉剂的饲料空白培养物做对比，结合低倍活物镜检，初步确定各防霉剂有效抑制霉菌的种属，可看出各防霉剂对各种霉菌杀菌作用力。